Name: Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Leer vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met het Zika-virus voor onderzoek naar arbovirusoverdracht. Deze methode helpt onderzoekers populaties te identificeren die een risico vormen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen het personeel van het World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton en Divya Mirchandani, voor hun onvermoeibare werk bij het samenstellen en leveren van veel van de virale stammen die worden gebruikt voor de vectorcompetentie-experimenten van ons en andere groepen. Het gepresenteerde werk werd gefinancierd door het McLaughlin Fellowship Fund (SRA) en NIH-subsidies AI120942 en AI121452.

Alle procedures die in deze protocollen werden uitgevoerd, werden uitgevoerd in volledige overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee en het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Texas Medical Branch in Galveston.
1. Versterk ZIKV in Vero-cellen
<ol><li>Kweek Vero-cellen (CCL-81 of VeroE6) in Dulbecco's modificatie van Eagle's minimal essential medium (DMEM) aangevuld met 10% v/v warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 E/ml en 100 μg/ml) in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2 tot tussen 80−90% confluïtentie in een 150 cm2 weefselkweekkolf.</li>
	<li>Verwijder in een bioveiligheidskast (BSC) het medium en gooi het weg in 10% bleekmiddel of een werkverdunning van dubbel quaternair ammonium(Tabel van materialen). Ent de monolaag onmiddellijk in met 1 ml virale bouillon, gericht op 0,1−1 infectieus viraal deeltje per cel. Roer de kolf onmiddellijk zodanig dat het entmateriaal in zijn geheel in contact komt met de monolaag.</li>
	<li>Vul het medium aan tot een volume van 5 ml met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine. Verplaats vervolgens de kolf in de bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 60 minuten.</li>
	<li>Haal de kolf uit de couveuse en breng deze in een BSC. Voeg extra medium toe aan een totaal volume van 15 ml met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine. Verplaats de kolf in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Onderzoek de kolf dagelijks onder fasecontrastmicroscopie op bewijs van cytopathische effecten (CPE). Ga verder met de virale oogst (stap 1.7) wanneer slechts ongeveer 40−50% van de cellen in de monolaag achterblijft, over het algemeen 3-5 dagen na de infectie, afhankelijk van de stam van ZIKV die wordt gebruikt.</li>
	<li>Aspiraleer het supernatant en plaats het in een conische injectieflacon van 50 ml. Verduidelijk het supernatant van cellulair puin door centrifugering (3.500 x g gedurende 20 minuten). OPMERKING: Als meerdere kolven identiek zijn geïnfecteerd, kunnen supernatanten uit meerdere kolven worden gecombineerd tot conische buizen van 50 ml.</li>
	<li>Verwijder het supernatant van de conische buis van 50 ml naar een verse buis en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Vul het supernatant aan met warmte-geïnactiveerde FBS tot een eindconcentratie van 30% (v/v). Voeg dit mengsel toe aan afzonderlijke schroefdopbuizen en vries tot gebruik in bij -80 °C.</li>
</ol>2. Bereiding van kunstmatige bloedmeel
<ol><li>Op de dag dat muggen moeten worden blootgesteld aan infectieus bloedmeel, schakelt u de stroombron(Tabel van materialen)in een insluitingsfaciliteit voor geleedpotigen zodanig in dat de voedingseenheden(Tabel met materialen)zijn voorverwarmd tegen de tijd dat de muggen worden voorbereid op blootstelling.</li>
	<li>Bereid kunstmatige bloedmeel met behulp van een van de hieronder beschreven methoden.<ol>
<li>Methode 1: Combineer vers geoogst (binnen een week) geciteerd of gehepariniseerd menselijk bloed dat commercieel 1:1 v/v is gekocht met virale bouillon (bereid zoals beschreven in rubriek 1). OPMERKING: Deze methode is afhankelijk van de afwezigheid van antilichamen tegen de virus/virusfamilie die in het bloed aanwezig zijn.</li>
		<li>Als de afwezigheid van antilichamen niet kan worden bevestigd of als bekend is dat de bloedbron eerder aan het flavivirus is blootgesteld, was en pak erytrocyten dan handmatig in.<ol>
<li>Voeg in een BSC 30 ml vol menselijk bloed toe aan een conische buis van 50 ml en vul tot 50 ml aan met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
			<li>Centrifugeer bij 3.500 x g gedurende 20 minuten.</li>
			<li>Zuig het supernatant op door voorzichtig in een bakpan met 10% bleekmiddel of door verdunning van dubbel quaternair ammonium te gieten, waarbij u ervoor zorgt dat de erytrocytkorrel niet wordt weggegooid.</li>
			<li>Voeg 10 ml PBS toe en tik voorzichtig de bodem van de conische buis tegen de bodem van de BSC, zodat de erytrocytenkorrel opnieuw is samengesteld. Breng het volume van de suspensie op 50 ml met PBS. Meng door zachte inversie.</li>
			<li>Herhaal stap 2.2.2.1−2.2.2.4 in totaal 4−6x. Bevestig dat het supernatant helder of slechts lichtroze en niet langer ondoorzichtig is. Verwijder al het supernatant met een serologische pipet. Resuspend de erytrocytenkorrel in 1−2 ml PBS.</li>
			<li>Monteer het bloedmeel: 350 μL verpakte erytrocyten, 100 μL 10% sucrose, 200 μL warmte-geïnactiveerde FBS, 900 μM recombinant ATP en 2 ml op de juiste manier verdunde virusvoorraad met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overlay een standaard reservoireenheid van 3 ml (tabel metmaterialen)met de huid van een niet-geïnfecteerde muis (andere opties zijn paraffinefilm, collageenmembranen of worstomhulsel).</li>
	<li>Plaats het afgedekte reservoir op witte papieren handdoeken. Voeg ~ 2 ml infectieus bloedmeel toe aan het reservoir 1 ml per keer. Inspecteer de handdoek onder de feeder op tekenen van lekkage. Als er lekken aanwezig zijn, haal dan het bloedmeel terug uit de feeders en gooi de deksels weg. Sluit de feeders af met pluggen. Bevestig nogmaals dat er geen lekken aanwezig zijn.</li>
</ol>3. Backtitratie van bloedmeel/plaque-assay
<ol><li>Gebruik het resterende volume van het bereide bloedmeel om een serie van 10x seriële verdunning uit te voeren (d.w.z. 6 verdunningen, variërend van verdund 10x tot 1.000.000x) met DMEM aangevuld met 2% v / v warmte-geïnactiveerde FBS en 1% (v / v) penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Aliquot 100 μL van de verdunningen in de putten van 24 of 12 putplaten van de meest verdunde tot meest geconcentreerde.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Breng aan het einde van de incubatietijd van 1 uur de platen terug in de BSC en voeg 1 ml of 2 ml methylcellulose-overlay toe aan de 24 put- of 12 putplaten, dienovereenkomstig.</li>
	<li>Plaats de overlayplaten terug in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en incubeer gedurende 3−7 dagen (afhankelijk van de virusstam).</li>
	<li>Verwijder na incubatie de platen uit de couveuse en breng in de BSC. Gooi de methylcellulose-overlay weg in een bakpan met 10% bleekmiddel of dubbel quaternair ammoniumdesinfectiemiddel.</li>
	<li>Was elk putje 2x met PBS en gooi de was weg in een dienblad met 10% bleekmiddel of dubbel quaternair ammonium.</li>
	<li>Voeg ~1 ml methanol:aceton (1:1 v:v) toe en laat de cellen gedurende ten minste 30 minuten in de BSC bij kamertemperatuur (RT) op de plaat bevestigen. Methanol:aceton weggooien volgens het institutionele beleid inzake organisch afval.</li>
	<li>Visualiseer ZIKV met behulp van een van de twee methoden die hieronder worden beschreven.<ol>
<li>Na het verwijderen van methanol:aceton, onmiddellijk beitsen met een kristalviolette oplossing (0,25% w/v in 30% methanol) gedurende 5 min. Spoel 2x in leidingwater en laat drogen, visualiseer dan direct met het oog op bewijs van plaques of vernietiging van monolaag.</li>
		<li>U kunt ook een focusvormende test uitvoeren.<ol>
<li>Laat de platen aan de lucht drogen tot er geen organisch fixeermiddel overblijft. OPMERKING: Dit duurt ~ 2−3 uur buiten de BSC, maar kan worden versneld door luchtdroging in een BSC- of chemische zuurkast.</li>
			<li>Was elke put 3x gedurende 15 minuten elk in niet-steriel PBS (Mg2+ en Ca2+ vrij) op een orbitale plaat rocker. Verwijder PBS en voeg 1 ml blokkeringsoplossing (PBS + 3% FBS) toe aan elke put en rock gedurende 15 minuten bij RT.</li>
			<li>Voeg 100 μL per putje α-ZIKV of α-flavivirus primair antilichaam (bijv. flavivirusgroephybridoom D1-4G2-4-15 [4G2]) toe bij een verdunning van 1:2.000 in blokkerende oplossing. Incubeer met schommelen gedurende minimaal 4 uur (bij voorkeur 's nachts, niet langer dan 18 uur) bij RT.</li>
			<li>Verwijder het primaire antilichaam en was 3x gedurende 15 minuten elk met PBS (Mg2+ en Ca2+ vrij) op een orbitale plaat rocker.</li>
			<li>Voeg 100 μL per putje van het secundaire antilichaam (geit α muis HRP-gelabeld) verdund 1:2.000 toe in blokkeerbuffer. Incubeer met schommelen gedurende 1 uur bij RT.</li>
			<li>Was 3x gedurende 15 minuten elk met PBS (Mg2+ en Ca2+ vrij) op een orbitale plaat rocker.</li>
			<li>Aliquot 100 μL substraatontwikkelingsreagens (Tabel van Materialen) per put. Rockplaten bij RT gedurende 15 min.</li>
			<li>Stop de reactie bij het ontstaan van foci/plaques door het substraat te verwijderen en de platen 2x af te spoelen met leidingwater. Giet kraanwater af en laat de platen aan de lucht drogen voordat u ze kwantificeert.</li>
			<li>Tel virale foci om het aantal FFU in het gegeven monster te bepalen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Toediening van bloedmeel
<ol><li>Gebruik Ae. aegypti muggen 2−4 dagen na eclosie. Sorteer vrouwelijke muggen in kartonnen dozen van 0,5 L met afgeschermde deksels en beroof ze van suiker (over het algemeen 36−48 uur voorafgaand aan het besmettelijke bloedmeel). Geef ad libitum water via met water verzadigde wattenbollen.</li>
	<li>Verwijder de met water verzadigde wattenbollen op de ochtend dat de muggen worden blootgesteld aan het besmettelijke bloedmeel.</li>
	<li>Bevestig reservoirs met kunstmatig bloedmeel aan voedingskabels in een doorzichtig plastic handschoenenkastje.</li>
	<li>Plaats in het dashboardkastje een kartonnen doos van 0,5 L met een afgeschermd deksel, met daarin 50−100 uitgehongerde Ae. aegypti-muggen, onder de voedingseenheid die aan het reservoir is bevestigd. OPMERKING: Op de juiste manier uitgehongerde muggen zullen zich over het algemeen binnen 20 minuten voeden. Het voeren kan indien nodig worden verlengd om de steekproefomvang in langzamere populaties te vergroten, hoewel dit niet langer mag duren dan 60 minuten, omdat (ZIKV) virale titer na ~ 60 minuten in de feeder kan afnemen.</li>
	<li>Verwijder na voltooiing van het voeren het reservoir en dompel onder in vers gemaakt 10% bleekmiddel.</li>
	<li>Verdoving muggen koud door incubatie gedurende 30 s bij -20 °C of gedurende 5 minuten in een koelkast.</li>
	<li>Giet in het dashboardkastje de muggen in een petrischaaltje op ijs. Tel en sorteer de opgezwollen vrouwtjes van ongeengorganiseerde muggen. Gooi de ongeïnteresseerde muggen weg door onderdompeling in een conische buisbuis van 50 ml gevuld met 70% ethanol. Terwijl de muggen nog steeds verdoofd zijn, giet je ze terug in de kartonnen doos van 0,5 L en dek je ze snel af met het scherm en het deksel. Knip overtollig zeefgaas van de doos af en zet het gaas vast met tape.</li>
	<li>Voeg een watje verzadigd met steriel gefilterde 10% waterige sucrose toe aan het scherm van elke doos. Plaats alle muggendozen in een grote plastic secundaire container met een vochtige spons om de luchtvochtigheid te behouden.</li>
	<li>Plaats secundaire container met dozen muggen in een incubator met een temperatuur van 27 ± 1 °C (of, indien van toepassing om omstandigheden in het betreffende gebied te simuleren) met 80% ± 10% relatieve vochtigheid en een 16:8 licht:donker cyclus). Onderhoud de muggen met ad libitum toegang tot 10% sucrose totdat de experimenten zijn voltooid.</li>
</ol>5. Monsterverwerving en -verwerking
<ol><li>Op bepaalde dagen na het voeden, aspirateer een vooraf bepaald aantal muggen uit de juiste dozen met behulp van een mechanische aspirator in een dashboardkastje. Bedek de verzamelbuis met een katoenen ronde nadat het vereiste aantal muggen is verkregen.</li>
	<li>Verdoving muggen door incubatie gedurende 30 seconden bij -20 °C of gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Giet in het dashboardkastje de muggen in een petrischaaltje op ijs. Verwijder met behulp van twee paar tangen alle zes de poten van elke mug en plaats deze in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis met ronde bodem van 2 ml met een gesteriliseerd roestvrijstalen kogellager (7/32 ") en 500 μl muggenopvangmedium (MCM) bestaande uit DMEM, 2% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 2,5 μg / ml amfotericine.</li>
	<li>Plaats de mug voorzichtig op een druppel minerale olie om hem in bedwang te houden, zorg ervoor dat er geen contact is tussen de olie en het hoofd en de proboscis van de mug.</li>
	<li>Plaats de muggenslurf in een pipetpunt van 10 μL gevuld met 10 μL warmte-geïnactiveerde FBS. OPMERKING: Als alternatief kan de pipet worden gevuld met sucrose, bloed of minerale olie. De olie maakt directe visualisatie van speekselbellen mogelijk via lichtmicroscopie.</li>
	<li>Laat de mug 30 min kwijlen. Werp de micropipettepunt met FBS + speeksel uit in een microcentrifugebuis met 100 μL MCM en plaats het karkas vervolgens in een afzonderlijke microcentrifugebuis met ronde bodem van 2 ml met een gesteriliseerd stalen kogellager en 500 μL MCM. Zorg ervoor dat de buizen die worden gebruikt voor de lichamen, benen en speeksel zijn gelabeld, zodat het duidelijk is dat alle drie de monsters afkomstig zijn van dezelfde mug.</li>
	<li>Terwijl de mug(s) kwijlen, voert u stappen 5,3−5,5 uit op de resterende muggen.</li>
	<li>Transporteer de buizen met de lichamen en poten naar een homogenisatie-apparaat voor het frezen van het weefsel dat zich in een BSC bevindt. Triturateer alle lichaams- en beenmonsters op 26 Hz gedurende 5 minuten om virale deeltjes vrij te maken in het supernatant. Reinig alle monsters door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten om cellulair afval te pelleteren. OPMERKING: Op dit punt kunnen monsters worden ingevroren bij -80 °C of onmiddellijk worden getest.</li>
</ol>6. Detectie van ZIKV door infectieuze assay
<ol><li>Bereid in een BSC 24 putweefselkweekplaten voor met Vero-cellen (105 cellen per put) 24 uur voorafgaand aan het begin van de infectieuze test. Label elke put met de identiteit van een enkele mug / monster.</li>
	<li>Als de monsters bij -80 °C zijn ingevroren, laat dan ontdooien.</li>
	<li>Verwijder de media van de Vero-celplaten vóór inenting met monsters één plaat per keer.</li>
	<li>Voor monsters die lichamen of poten bevatten, moet u zorgvuldig 100 μL geklaard supernatant in elke put aliquoteren, waarbij u ervoor moet zorgen dat het muggencelafval van de pellet niet wordt verstoord. OPMERKING: Speekselmonsters kunnen 1:1 (v/v) worden verdund met MCM voorafgaand aan inenting op cellen om monsters te conserveren voor latere titratie, indien nodig.</li>
	<li>Verplaats de platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator en incubeer gedurende 1 uur.</li>
	<li>Breng de platen terug naar de BSC en voeg ~ 1 ml methylcellulose-overlay toe aan elke put. Plaats de overlayplaten terug in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en incubeer gedurende 3−7 dagen (virus-/stamafhankelijk).</li>
	<li>Voer fixatie en visualisatie uit zoals beschreven in stap 3.6−3.9.</li>
	<li>Met betrekking tot het scoren via een focusvormende test, kwantificeert u de positieve putten door onderzoek onder een lichtmicroscoop. Detectie van intracytoplasmatische kleuring van cellen in een put duidt op de aanwezigheid van virus. Monsters worden uitsluitend gescoord als focus-positief of -negatief.</li>
</ol>

<ol><li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence%3A+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867(2019).</li>
<li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+vector+competence+studies%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li>
<li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus%3A+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li>
<li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li>
<li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li>
<li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li>
<li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).</li>
<li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980(2018).</li>
<li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li>
<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+quinquefasciatus%3A+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102(2016).</li>
<li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite%3A+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 346(2017).</li>
<li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li>
<li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li>
<li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li>
<li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li>
<li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li>
<li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li>
<li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li>
<li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+from+Guerrero%2C+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li>
<li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+Gabon+%28Central+Africa%29+%E2%80%93+2007%3A+a+new+threat+from+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li>
<li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Zika+Virus+Infection%2C+Chiapas+State%2C+Mexico%2C+2015%2C+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li>
<li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702(2019).</li>
<li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li>
<li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li>
<li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites & Vectors. 12 (1), 462(2019).</li>
<li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661(2018).</li>
<li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li>
<li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072(2019).</li>
<li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes%2C+Gulf+Coast%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li>
<li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonized+Sabethes+cyaneus%2C+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species%2C+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434(2018).</li>
<li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li>
<li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li>
<li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804(2018).</li>
<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li>
<li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li>
<li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li>
<li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).</li>
<li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fever+from+the+forest%3A+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li>
<li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methoden bieden een gegeneraliseerde workflow om vectorcompetentieanalyses uit te voeren. Als algemeen kader worden veel van deze methodologieën in de literatuur bewaard. Er is echter aanzienlijke ruimte voor wijzigingen (besproken in Azar en Weaver1). Van virussen (bijv. virale afstamming, opslag van challenge-virus, virale passagegeschiedenis), entomologie (bijv. laboratoriumkolonisatie van muggenpopulaties, aangeboren immuniteit, het muggenmicrobioom / viroom) en experimentel...

Vectorcompetentie wordt gedefinieerd als het vermogen op het niveau van soort, populatie en zelfs een individu van een bepaalde geleedpotige zoals een mug, teek of flebotomine zandvlieg, om een agens biologisch te verwerven en over te dragen met replicatie of ontwikkeling in de geleedpotige1,2. Met betrekking tot muggen en door geleedpotigen overgedragen virussen (d.w.z. arbovirussen), wordt het middel door een vrouwelijke mug uit een viremische gastheer geïmpregneerd. Na inname moet het virus productief een van een kleine populatie midgut-epitheelcellen infecteren3, waarbij verschillende fysiologische obstakels worden overwonnen, zoals proteolytische afbraak door spijsverteringsenzymen, de aanwezigheid van de microbiota (midgut-infectiebarrière of MIB) en de uitgescheiden peritrofische matrix. Infectie van het midgut-epitheel moet worden gevolgd door replicatie van het virus en uiteindelijk ontsnapping uit het midgut in de open bloedsomloop van de mug, of hemolymfe, wat het begin vertegenwoordigt van een gedissemineerde infectie die de midgut-ontsnappingsbarrière (MEB) overwint. Op dit punt kan het virus infecties van secundaire weefsels (bijv. Zenuwen, spieren en vetlichamen) vaststellen en zich blijven vermenigvuldigen, hoewel een dergelijke secundaire replicatie mogelijk niet strikt noodzakelijk is voor het virus om de acinaire cellen van de speekselklieren te infecteren (het overwinnen van de speekselklierinfectiebarrière). Uitgaan van de speekselklier acinar cellen in hun apicale holtes en vervolgens beweging in het speekselkanaal maakt inenting van het virus in volgende gastheren bij bijten mogelijk en voltooit de transmissiecyclus1,2,4,5,6,7.
Gezien dit goed gekarakteriseerde en over het algemeen geconserveerde mechanisme van verspreiding binnen een muggenvector, zijn laboratoriumvectorcompetentiebeoordelingen vaak methodologisch vergelijkbaar, hoewel er verschillen in protocollen bestaan1,2. Over het algemeen worden muggen na orale blootstelling aan het virus ontleed, zodat individuele weefsels zoals het midgut, benen, eierstokken of speekselklieren kunnen worden getest op virale infectie, gedissemineerde infectie, gedissemineerde infectie / potentiële transovariale overdracht en gedissemineerde infectie / potentiële overdrachtscompetentie, respectievelijk8. De loutere aanwezigheid van een virus in de speekselklieren is echter geen definitief bewijs van overdrachtsvermogen, gezien het bewijs van een speekselklier ontsnapping / uitgang barrière (SGEB) in sommige vector / virus combinaties1,2,4,5,7,9. De standaardmethode om overdrachtscompetentie aan te tonen blijft muggenoverdracht op een vatbaar dier10,11,12. Aangezien dit voor veel arbovirussen echter het gebruik van immuungecompromitteerde muizenmodellen13,14,15,16vereist, is deze methode vaak onbetaalbaar. Een veelgebruikt alternatief is het verzamelen van het muggenspeeksel, dat kan worden geanalyseerd door reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) of een infectieuze test om de aanwezigheid van respectievelijk het virale genoom of infectieuze deeltjes aan te tonen. Het is vermeldenswaard dat dergelijke in vitro speekselverzamelingsmethoden12 kunnen overschatten of17 de hoeveelheid virus die tijdens in vivo voeding wordt afgezet, kunnen onderschatten, wat aangeeft dat dergelijke gegevens met de nodige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd. Niettemin is de in vitro-methode zeer waardevol wanneer geanalyseerd vanuit het perspectief van de loutere aanwezigheid van virus in het speeksel, wat wijst op transmissiepotentieel.
Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor het bepalen van de rol van muggenvectoren bij uitbraken van arbovirale ziekten. De eerste methode omvat veldbewaking, waarbij muggen worden verzameld in het kader van actieve overdracht18,19,20,21,22,23,24. Aangezien de infectiepercentages echter doorgaans vrij laag zijn (bijv. de geschatte 0,061% infectiegraad van muggen in gebieden met actieve Zika-virus (ZIKV) circulatie in de Verenigde Staten21), kan de beschuldiging van potentiële vectorsoorten sterk worden beïnvloed door vangmethode25,26 en willekeurige kans (bijv. Bemonstering van één geïnfecteerd individu op 1.600 niet-geïnfecteerden)21 . Hiermee rekening houdend, kan een bepaald onderzoek mogelijk niet voldoende muggen verwerven in zowel ruwe aantallen als soortendiversiteit om muggen die betrokken zijn bij overdracht nauwkeurig te bemonsteren. Vectorcompetentieanalyses worden daarentegen uitgevoerd in een laboratoriumomgeving, waardoor strikte controle van parameters zoals orale dosis mogelijk is. Hoewel ze niet volledig in staat zijn om de ware complexiteit van muggeninfectie en overdrachtscapaciteit in een veldomgeving weer te geven, blijven deze laboratoriumbeoordelingen krachtige hulpmiddelen op het gebied van arbovirologie.
Op basis van verschillende vectorcompetentieanalyses met ZIKV in verschillende muggensoorten, populaties en methoden27,28,29,30,31,32,evenals een recent overzicht van vectorcompetentiebeoordelingen1,beschrijven we hier verschillende protocollen die verband houden met een typische vectorcompetentieworkflow. In deze experimenten werden drie Ae. aegypti-populaties uit Amerika (de stad Salvador, Brazilië; de Dominicaanse Republiek; en de lagere Rio Grande-vallei, TX, VS) blootgesteld aan een enkele stam van ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bij 4, 5 of 6 log10 focusvormende eenheden (FFU) / ml-doses door middel van kunstmatige bloedmeel. Vervolgens werden ze geanalyseerd op bewijs van infectie, gedissemineerde infectie en transmissiecompetentie na verschillende tijden van extrinsieke incubatie (2, 4, 7, 10 en 14 dagen) door middel van dissectie en een op celcultuur gebaseerde infectieuze test. Hoewel de huidige workflow/protocollen zijn geoptimaliseerd voor ZIKV, zijn veel elementen direct vertaalbaar naar andere door muggen overgedragen arbovirussen in geleedpotige insluiting en bioveiligheidsniveaus 2 en 3 (ACL/BSL2 of ACL/BSL3).

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5'-triphospaat disodiumzout hydraat, microbieel, BioReagent, geschikt voor celcultuur</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primair Antilichaam voor focusvormingsassay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Fles</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secundair Antilichaam voor focusvormingsassay</td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Ontsmetting</td></tr><tr><td>Corning, Celcultuurbehandelde Flacons, 150cm2, Ventieldop, Doos van 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Costar Celcultuur Platen, 24-wel, 5/zak, 100/doos, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Costar Celcultuur Platen, 96-wel, 5/zak, 100/doos, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Kristalviolet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Kleurstof</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Buizen, 500/Doos</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conische Centrifugebuizen</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conische Centrifugebuizen</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon Wegwerp Polystyreen Serologische 10mL Pipetten, 200/Doos</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon Wegwerp Polystyreen Serologische 1mL Pipetten, 1000/Doos</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon Wegwerp Polystyreen Serologische 25mL Pipetten, 200/Doos</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon Wegwerp Polystyreen Serologische 5mL Pipetten, 200/Doos</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Falcon Standaard Tissue Cultuur Schaaltjes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Gewone Glazen Microscoopglazen</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilisatie van Muggen</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; voedingseenheden</td></tr><tr><td>Gibco DPBS met Calcium en Magnesium, 10 x 500mL Flessen</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&mu;g/mL, 50mL/Fles</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Gibco Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL), 100mL/Fles, 20 Flessen/Doos</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Gibco, Trypsine-EDTA (.25%), Fenol rood, 20 x 100mL Flessen</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, Hoge Glucose, 10 x 500mL Flessen</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Menselijk Bloed, Ongespecificeerd Geslacht, Na-Citraat, 1 Eenheid</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloedmaaltijd bereiding</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glazen Fles, 4L, 4/Doos</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixatief</td></tr><tr><td>Methylcellulose, viscositeit: 3.500-5.600 cP, 2 % in water(20 &deg;C), 250g/Fles</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Celcultuur reagens</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Desinfecterend Reinigingsmiddel</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Ontsmetting; werkverdunning van dubbel kwaternair ammonium</td></tr><tr><td>Minerale Olie, BioReagent, voor moleculaire biologie</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilisatie van Muggen</td></tr><tr><td>O-ringen</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Kunststof Pluggen</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Stroomvoorzieningseenheid (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; stroombron</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Verzette bladen, superfijne punten</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Schroefdop Microbuisjes, Conische Bodem, O-ring Dop, Steriel, 1000/Doos</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, voor moleculaire biologie</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&mu;L Pipetpunten, 100 punten/Rack, 8 Racks/Pak, 4 Pakken/Doos</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&mu;L Pipetpunten, 96 punten/Rack, 10 Racks/Pak, 5 Pakken/Doos</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststof verbruiksartikel</td></tr><tr><td>ThermoScientific,

vectorcompetentieanalyses op aedes aegypti-muggen met behulp van het zika-virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

De gepresenteerde procedures beschrijven een gegeneraliseerde methodologie om Aedes aegypti-muggen te infecteren met het Zika-virus onder laboratoriumomstandigheden om de infectiesnelheid, gedissemineerde infectie en mogelijke overdracht van het virus in de betreffende muggenpopulatie te bepalen. Deze procedures worden op grote schaal gebruikt met verschillende wijzigingen in vectorcompetentie-evaluaties wereldwijd. Ze zijn belangrijk bij het bepalen van de potentiële rol die een bepaalde mug (d.w.z. soort, populatie, individu) kan spelen bij de overdracht van een bepaald middel.

Drie populaties van Ae. aegypti uit Noord- en Zuid-Amerika (Salvador, Brazilië; de Dominicaanse Republiek; en de Rio Grande Valley, TX, VS) werden blootgesteld aan een uitbraakstam van ZIKV uit Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexico, 2015) over een reeks bloedmeeltiters (4, 5 en 6 log10 FFU / ml) gepresenteerd in een gewassen menselijk erytrocytengebaseerd kunstmatig bloedmeel. Op dag 2, 4, 7, 10 en 14 na infectie werden subgroepen van muggen verwerkt om infectie, verspreiding en potentiële over...

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Bij uitbraken veroorzaakt door arbovirussen zijn tegenmaatregelen grotendeels beperkt tot de bestrijding van muggen. Analyses van de vectorkwalificaties zijn daarom cruciale preventiestrategieën, omdat ze bepalen welke populaties en soorten muggen als vectoren voor een specifiek arbovirus kunnen dienen en dus aangepakt moeten worden. Een van de belangrijkste instrumenten in onze gereedschapskist voor het beoordelen van de rol van muggen en andere vectoren bij de overdracht van infectieziekten is dan ook de studie naar vectorkwalificaties. Dit zijn experimenten waarin we niet alleen de soort mug of teek zeer nauwkeurig kunnen controleren, maar ook geografische stammen, evenals zeer specifieke stammen van een ander virus of ander infectieus organisme, om zeer precieze en goed gecontroleerde gegevens te verkrijgen over het risico van verschillende soorten voor de overdracht van verschillende agentia in specifieke delen van de wereld. Werken met geïnfecteerde muggen vereist gespecialiseerde faciliteiten, training, ervaring en zorgvuldige planning om de risico's voor de experimentator, alsof te weten de risico's van een ontsnapte, geïnfecteerde mug, te minimaliseren. Het is daarom zeer belangrijk dat nieuwe medewerkers in deze faciliteiten de tijd nemen om met niet-geïnfecteerde bloedmuggen te werken, zodat zij vertrouwd raken met de technieken en de workflow.Schakel op de dag van de expositie de stroombron in een faciliteit voor het inperken van arthropoden in om de voedingsunits voor te verwarmen. Meng vers geoogst gecitrateerd of gehepariniseerd menselijk bloed in een volumeverhouding van één op één met een virale stock, en bedek een standaard reservoirunit van drie milliliter met de huid van een naïeve, niet-geïnfecteerde muis. Plaats het afgedekte reservoir op witte papieren handdoeken en voeg ongeveer twee milliliter infectieus bloed toe aan het reservoir, telkens één milliliter per keer.Controleer vervolgens met papieren handdoeken of er geen lekkages zijn. Bereid 24 uur vóór het uitvoeren van de infectieassay 24-well celkweekplaten met Vero-cellen voor en label elke well met de identiteit van de mug en het monster. Op de ochtend waarop de muggen worden blootgesteld aan de infectieuze bloedmaaltijd, verwijdert u de met water verzadigde wattenbollen en bevestigt u de reservoirs met de kunstmatige bloedmaaltijden aan de leidingen van de voedingseenheid met een doorzichtige plastic containment-handschoenenkast.Plaats de kartonnen doos met de uitgehongerde muggen in de glove box onder de voedingsunit. Verwijder na voltooiing van de voeding het reservoir en dompel dit onder in vers bereide 10% bleekmiddel. Giet binnen de glove box de koud geneesde muggen in een Petri-schaal op ijs en sorteer de verzadigde muggen van de onverzadigde muggen.Giet de verzadigde muggen terug in de kartonnen doos en dek deze snel af met een gaas en een deksel. Snijd het overtollige gaas van de doos af en zet het deksel vast met plakband. Voeg een wattenprop toe aan het gaas, verzadigd met steriel gefilterde 10%sucrose, en plaats de doos in een grote plastic secundaire container met een vochtige spons om de luchtvochtigheid te handhaven.Incubeer de secundaire container bij 27 °C en geef de muggen ad libitum toegang tot de sucrose tot de experimenten zijn voltooid. Gebruik een mechanische aspirator om een vooraf bepaald aantal geïncubeerde muggen uit de doos te verzamelen en sluit de opvangbuis af met een wattenrondje wanneer u klaar bent. Giet, terwijl u in de glovebox werkt, de koud geneesde muggen in een Petrischaal op ijs.Verwijder alle zes de poten van elke mug en plaats deze in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis van 2 milliliter met een gesteriliseerde roestvrijstalen kogellager en 500 microliters mosquito collection media, of MCM. Plaats de mug voorzichtig op een druppel minerale olie, waarbij u erop let dat de olie het hoofd of de proboscis van de mug niet raakt. Steek de proboscis in een micropipetpunt gevuld met 10 microliters hitte-geïnactiveerd FBS, en laat de mug 30 minuten spekelen.Ejecteer de pipetpunt met het speeksel in een microcentrifugebuisje met 100 µL MCM en plaats het karkas in een aparte buis van 2 mm met de gesteriliseerde stalen kogellager en 500 µL MCM. Transporteer de buisjes naar een kogelmolen voor weefselhomogenisatie in een biologische veiligheidskast en tritureer alle lichaams- en pootmonsters bij 26 Hz gedurende vijf minuten om virusdeeltjes in het supernatant vrij te maken. Clarificeer alle monsters door centrifugatie bij 200 ×g gedurende vijf minuten om cellulair debris te pelletteren.Verwijder direct vóór de inoculatie met de monsters het medium van de eerder voorbereide Vero-cellen. Pipetteer voorzichtig 100 µL geklaarde supernatanten van de lichaampjes of poten in elke put, waarbij u er op let dat het celdebris van de muggen uit het pellet niet wordt verstoord. Incubeer de platen vervolgens gedurende één uur.Voeg na de incubatie één milliliter methylcellulose-overlay toe aan elke put en plaats de platen drie tot zeven dagen terug in de incubator. Haal de platen met de overlay uit de incubator en breng ze naar een veiligheidskast. Gooi de methylcellulose-overlay weg in een lekbak met 10% bleekmiddel en was elke put tweemaal met PBS, waarbij elke wasbeurt in de lekbak wordt weggegooid.Verwijder de PBS, voeg één milliliter methanol-aceton per well toe en laat de cellen 30 minuten fixeren op de plaat. Gooi vervolgens het fixeerder weg en laat de platen drogen. Was elke well drie keer met niet-steriele PBS op een orbitale plaatshaker gedurende 15 minuten per wasbeurt, voeg daarna één milliliter blokkeeroplossing toe aan elke well en schud de plaat nogmaals 15 minuten.Voeg 100 µL anti-Zika-virus- of anti-flavivirus primair antilichaam toe aan elke put en incubeer de plaat een nacht onder schudconditionering. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en herhaal de wasstappen met PBS. Voeg na de laatste wasbeurt 100 µL secundaire antilichamen toe en incubeer de plaat één uur onder schudconditionering.Herhaal de wasstappen met PBS, voeg vervolgens 100 µL substraatontwikkelingsreagens per putje toe en schud de plaat 15 minuten lang. Wanneer de foci of plaques zich hebben ontwikkeld, wordt de reactie gestopt door de plaat te spoelen met kraanwater. Giet het kraanwater af en laat de platen aan de lucht drogen, waarna de virale foci worden gekwantificeerd om het aantal focus-forming units in de betreffende monster te bepalen.Drie muggenpopulaties werden blootgesteld aan een uitbraakstam van het Zika-virus bij uiteenlopende titers in de bloedmaaltijd. Gedurende de volgende twee weken werden subgroepen muggen verwerkt om de infectie, verspreiding en potentiële transmissiesnelheid te bepalen. Bij de lagere titers in de bloedmaaltijd raakten de muggen uit Salvador, Brazilië, geïnfecteerd na 4, 10 en 14 dagen extrinsieke incubatie, waarbij geen bewijs van verspreide infectie werd waargenomen in de geanalyseerde poten.Bij de hoogste titer werd het virus aangetroffen in de poten van de muggen, maar niet in het speeksel. De muggen uit de Dominicaanse Republiek bleken het meest vatbaar voor infectie en vertoonden de hoogste transmissiecompetentie bij alle geteste titers van de bloedmaaltijd. Muggen die alle drie de doses kregen, vertoonden verspreiding binnen zeven dagen en transmissiecompetentie 14 dagen na infectie.Muggen uit de Rio Grande Valley in Texas, die waren blootgesteld aan lagere titers in de bloedmaaltijd, waren al vanaf vier dagen na infectie geïnfecteerd, terwijl gedissemineerde infecties werden gevonden na 14 dagen. In de cohort die was blootgesteld aan het hoogste titer, werd infectie waargenomen vanaf de tweede dag na infectie, met pieken op 4, 10 en 14 dagen. Gedissemineerde infecties werden waargenomen na zeven dagen, en slechts één enkele mug was in staat tot transmissie op 10 dagen.Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om veilig te werken in plaats van snel. Hanteer geïnfecteerde of potentieel geïnfecteerde muggen daarom altijd binnen een glovebox of een biologische veiligheidskabinet, totdat hun poten of vleugels zijn verwijderd. De basisworkflow voor vectorkompetentie kan worden aangepast om geïnfecteerde muggen te produceren voor downstream-analyses, zoals transmissiestudies, alsook om de interacties tussen muggen, het virus en het microbioom te onderzoeken.Vectorcompetentie is al vele decennia een zeer belangrijk instrument om de rol van muggen bij de overdracht van virussen tijdens epidemieën van virale ziekten te begrijpen. Tegelijkertijd is het een methode die in de loop der jaren is geëvolueerd om nieuwe informatie op te nemen, naarmate we meer leren over de interacties tussen deze virussen en de muggenvectoren. Om twee voorbeelden te noemen: de genetische populatie van het virus, waarbij de complexiteit van de populatie binnen de mug zeer belangrijk blijkt te zijn voor het vermogen tot transmissie, kan nu worden meegenomen in studies naar vectorcompetentie dankzij nieuwe methoden voor het sequensen van de virale populatie.We weten inmiddels ook dat de populatie bacteriën en andere organismen die in het maag-darmkanaal van de mug leven, een grote invloed kan hebben op hun vermogen om ziekteverwekkers over te dragen, en we kunnen die populatie nu evalueren met nieuwe sequentiemethoden. Vectorcompetentie is dus een methode die is geëvolueerd en blijft evolueren naarmate we meer leren over deze complexe interacties.

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia worden vrijgegeven in natuurlijke populaties te onderdrukken van de overdracht van arboviruses. We worden methoden beschreven aan achterzijde Ae. aegypti met Wolbachia infecties in het laboratorium voor experimenten en veld release, voorzorgsmaatregelen nemen om laboratorium aanpassing en selectie te minimaliseren.

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

Een protocol om de microsporidische parasiet Edhazardia aediste cultuuren. De parasiet wordt doorgevoerd van de ene generatie Aedes aegypti muggen naar de volgende via horizontale overdracht in het larvestadium, gevolgd door verticale transmissie in het volwassen stadium. Levende sporoplasma's overleven op lange termijn in geïnfecteerde eieren.

Voortplanting van de Microsporidische Parasiet Edhazardia aedis in Aedes aegypti Muggen

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Procedures worden beschreven voor het bestuderen van het sonderende en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op menselijke handen met behulp van AC-DC elektropenetragrafie.

AC-DC Electropenetrografie voor de studie van sonderend en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op mensenhanden

Dit protocol bevat instructies voor het klonale-cellijn selectie en een calcium-bioluminescentie test om de structuur-activiteit relaties van gesynthetiseerd geleedpotigen neuropeptiden op hun verwante GPCR's te analyseren. Deze test kan gebruikt worden voor receptor deorphanization en structuur-activiteit relatie studies voor synthetische analoog ontwerp en peptide / drug-lead discovery.

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Leer vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met het Zika-virus voor onderzoek naar arbovirusoverdracht. Deze methode helpt onderzoekers populaties te identificeren die een risico vormen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Meer video's verkennen