Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Bij uitbraken veroorzaakt door arbovirussen zijn tegenmaatregelen grotendeels beperkt tot de bestrijding van muggen. Analyses van de vectorkwalificaties zijn daarom cruciale preventiestrategieën, omdat ze bepalen welke populaties en soorten muggen als vectoren voor een specifiek arbovirus kunnen dienen en dus aangepakt moeten worden. Een van de belangrijkste instrumenten in onze gereedschapskist voor het beoordelen van de rol van muggen en andere vectoren bij de overdracht van infectieziekten is dan ook de studie naar vectorkwalificaties. Dit zijn experimenten waarin we niet alleen de soort mug of teek zeer nauwkeurig kunnen controleren, maar ook geografische stammen, evenals zeer specifieke stammen van een ander virus of ander infectieus organisme, om zeer precieze en goed gecontroleerde gegevens te verkrijgen over het risico van verschillende soorten voor de overdracht van verschillende agentia in specifieke delen van de wereld. Werken met geïnfecteerde muggen vereist gespecialiseerde faciliteiten, training, ervaring en zorgvuldige planning om de risico's voor de experimentator, alsof te weten de risico's van een ontsnapte, geïnfecteerde mug, te minimaliseren. Het is daarom zeer belangrijk dat nieuwe medewerkers in deze faciliteiten de tijd nemen om met niet-geïnfecteerde bloedmuggen te werken, zodat zij vertrouwd raken met de technieken en de workflow.

Schakel op de dag van de expositie de stroombron in een faciliteit voor het inperken van arthropoden in om de voedingsunits voor te verwarmen. Meng vers geoogst gecitrateerd of gehepariniseerd menselijk bloed in een volumeverhouding van één op één met een virale stock, en bedek een standaard reservoirunit van drie milliliter met de huid van een naïeve, niet-geïnfecteerde muis. Plaats het afgedekte reservoir op witte papieren handdoeken en voeg ongeveer twee milliliter infectieus bloed toe aan het reservoir, telkens één milliliter per keer.

Controleer vervolgens met papieren handdoeken of er geen lekkages zijn. Bereid 24 uur vóór het uitvoeren van de infectieassay 24-well celkweekplaten met Vero-cellen voor en label elke well met de identiteit van de mug en het monster. Op de ochtend waarop de muggen worden blootgesteld aan de infectieuze bloedmaaltijd, verwijdert u de met water verzadigde wattenbollen en bevestigt u de reservoirs met de kunstmatige bloedmaaltijden aan de leidingen van de voedingseenheid met een doorzichtige plastic containment-handschoenenkast.

Plaats de kartonnen doos met de uitgehongerde muggen in de glove box onder de voedingsunit. Verwijder na voltooiing van de voeding het reservoir en dompel dit onder in vers bereide 10% bleekmiddel. Giet binnen de glove box de koud geneesde muggen in een Petri-schaal op ijs en sorteer de verzadigde muggen van de onverzadigde muggen.

Giet de verzadigde muggen terug in de kartonnen doos en dek deze snel af met een gaas en een deksel. Snijd het overtollige gaas van de doos af en zet het deksel vast met plakband. Voeg een wattenprop toe aan het gaas, verzadigd met steriel gefilterde 10%sucrose, en plaats de doos in een grote plastic secundaire container met een vochtige spons om de luchtvochtigheid te handhaven.

Incubeer de secundaire container bij 27 °C en geef de muggen ad libitum toegang tot de sucrose tot de experimenten zijn voltooid. Gebruik een mechanische aspirator om een vooraf bepaald aantal geïncubeerde muggen uit de doos te verzamelen en sluit de opvangbuis af met een wattenrondje wanneer u klaar bent. Giet, terwijl u in de glovebox werkt, de koud geneesde muggen in een Petrischaal op ijs.

Verwijder alle zes de poten van elke mug en plaats deze in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis van 2 milliliter met een gesteriliseerde roestvrijstalen kogellager en 500 microliters mosquito collection media, of MCM. Plaats de mug voorzichtig op een druppel minerale olie, waarbij u erop let dat de olie het hoofd of de proboscis van de mug niet raakt. Steek de proboscis in een micropipetpunt gevuld met 10 microliters hitte-geïnactiveerd FBS, en laat de mug 30 minuten spekelen.

Ejecteer de pipetpunt met het speeksel in een microcentrifugebuisje met 100 µL MCM en plaats het karkas in een aparte buis van 2 mm met de gesteriliseerde stalen kogellager en 500 µL MCM. Transporteer de buisjes naar een kogelmolen voor weefselhomogenisatie in een biologische veiligheidskast en tritureer alle lichaams- en pootmonsters bij 26 Hz gedurende vijf minuten om virusdeeltjes in het supernatant vrij te maken. Clarificeer alle monsters door centrifugatie bij 200 ×g gedurende vijf minuten om cellulair debris te pelletteren.

Verwijder direct vóór de inoculatie met de monsters het medium van de eerder voorbereide Vero-cellen. Pipetteer voorzichtig 100 µL geklaarde supernatanten van de lichaampjes of poten in elke put, waarbij u er op let dat het celdebris van de muggen uit het pellet niet wordt verstoord. Incubeer de platen vervolgens gedurende één uur.

Voeg na de incubatie één milliliter methylcellulose-overlay toe aan elke put en plaats de platen drie tot zeven dagen terug in de incubator. Haal de platen met de overlay uit de incubator en breng ze naar een veiligheidskast. Gooi de methylcellulose-overlay weg in een lekbak met 10% bleekmiddel en was elke put tweemaal met PBS, waarbij elke wasbeurt in de lekbak wordt weggegooid.

Verwijder de PBS, voeg één milliliter methanol-aceton per well toe en laat de cellen 30 minuten fixeren op de plaat. Gooi vervolgens het fixeerder weg en laat de platen drogen. Was elke well drie keer met niet-steriele PBS op een orbitale plaatshaker gedurende 15 minuten per wasbeurt, voeg daarna één milliliter blokkeeroplossing toe aan elke well en schud de plaat nogmaals 15 minuten.

Voeg 100 µL anti-Zika-virus- of anti-flavivirus primair antilichaam toe aan elke put en incubeer de plaat een nacht onder schudconditionering. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en herhaal de wasstappen met PBS. Voeg na de laatste wasbeurt 100 µL secundaire antilichamen toe en incubeer de plaat één uur onder schudconditionering.

Herhaal de wasstappen met PBS, voeg vervolgens 100 µL substraatontwikkelingsreagens per putje toe en schud de plaat 15 minuten lang. Wanneer de foci of plaques zich hebben ontwikkeld, wordt de reactie gestopt door de plaat te spoelen met kraanwater. Giet het kraanwater af en laat de platen aan de lucht drogen, waarna de virale foci worden gekwantificeerd om het aantal focus-forming units in de betreffende monster te bepalen.

Drie muggenpopulaties werden blootgesteld aan een uitbraakstam van het Zika-virus bij uiteenlopende titers in de bloedmaaltijd. Gedurende de volgende twee weken werden subgroepen muggen verwerkt om de infectie, verspreiding en potentiële transmissiesnelheid te bepalen. Bij de lagere titers in de bloedmaaltijd raakten de muggen uit Salvador, Brazilië, geïnfecteerd na 4, 10 en 14 dagen extrinsieke incubatie, waarbij geen bewijs van verspreide infectie werd waargenomen in de geanalyseerde poten.

Bij de hoogste titer werd het virus aangetroffen in de poten van de muggen, maar niet in het speeksel. De muggen uit de Dominicaanse Republiek bleken het meest vatbaar voor infectie en vertoonden de hoogste transmissiecompetentie bij alle geteste titers van de bloedmaaltijd. Muggen die alle drie de doses kregen, vertoonden verspreiding binnen zeven dagen en transmissiecompetentie 14 dagen na infectie.

Muggen uit de Rio Grande Valley in Texas, die waren blootgesteld aan lagere titers in de bloedmaaltijd, waren al vanaf vier dagen na infectie geïnfecteerd, terwijl gedissemineerde infecties werden gevonden na 14 dagen. In de cohort die was blootgesteld aan het hoogste titer, werd infectie waargenomen vanaf de tweede dag na infectie, met pieken op 4, 10 en 14 dagen. Gedissemineerde infecties werden waargenomen na zeven dagen, en slechts één enkele mug was in staat tot transmissie op 10 dagen.

Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om veilig te werken in plaats van snel. Hanteer geïnfecteerde of potentieel geïnfecteerde muggen daarom altijd binnen een glovebox of een biologische veiligheidskabinet, totdat hun poten of vleugels zijn verwijderd. De basisworkflow voor vectorkompetentie kan worden aangepast om geïnfecteerde muggen te produceren voor downstream-analyses, zoals transmissiestudies, alsook om de interacties tussen muggen, het virus en het microbioom te onderzoeken.

Vectorcompetentie is al vele decennia een zeer belangrijk instrument om de rol van muggen bij de overdracht van virussen tijdens epidemieën van virale ziekten te begrijpen. Tegelijkertijd is het een methode die in de loop der jaren is geëvolueerd om nieuwe informatie op te nemen, naarmate we meer leren over de interacties tussen deze virussen en de muggenvectoren. Om twee voorbeelden te noemen: de genetische populatie van het virus, waarbij de complexiteit van de populatie binnen de mug zeer belangrijk blijkt te zijn voor het vermogen tot transmissie, kan nu worden meegenomen in studies naar vectorcompetentie dankzij nieuwe methoden voor het sequensen van de virale populatie.

We weten inmiddels ook dat de populatie bacteriën en andere organismen die in het maag-darmkanaal van de mug leven, een grote invloed kan hebben op hun vermogen om ziekteverwekkers over te dragen, en we kunnen die populatie nu evalueren met nieuwe sequentiemethoden. Vectorcompetentie is dus een methode die is geëvolueerd en blijft evolueren naarmate we meer leren over deze complexe interacties.