Mouse Footpad Inenting Model om virale geïnduceerde neuro-ontstekingsreacties te bestuderen

Dit protocol maakt het mogelijk de studie van de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties in de muis perifere zenuwstelsel tijdens een virale infectie. Met dit model, infecties reizen een grotere afstand van de periferie naar het perifere en centrale zenuwstelsel, waardoor een maximale beoordeling van de kinetiek van de neuro-inflammatoire reactie. Na het plaatsen van de vijf tot zeven weken oude verdoofde C57BL/6 muis in de supine positie op een chirurgische pad, bevestig een gebrek aan reactie op pedaal reflex.

En gebruik een 100 tot 180 grit emery board, om zachtjes schuren de glabrous huid van een achterste voetpad tussen de hiel en wandelpads met ongeveer 20 passen van het bord. Gebruik dan fijne tangen om langzaam af te pellen van de stratum corneum losgemaakt door de slijtage aan de stratum basale bloot te leggen. Na het zachte mengen, actueel aanbrengen 20 microliter van de juiste titer van virus inoculum op de geschuurde voetpad.

Voer schijninentingen met medium alleen uit in de geschuurde voetpaden van controledieren parallel. Wrijf na elke toepassing het voetpad 10 keer voorzichtig in met de schacht van een naald om de adsorptie van het virus gedurende 30 minuten te vergemakkelijken. Wanneer het geschuurde voetpad is gedroogd, laat u de muizen met controle herstellen tot sternale recumbency voordat ze de dieren in individuele kooien plaatsen voor klinische follow-up en bemonstering.

Op de juiste experimentele tijdstippen, het verzamelen van het virus blootgestelde organen, met inbegrip van het hart, longen, milt, alvleesklier, lever, nieren, en blaas in individuele 1,5 milliliter microtubes op ijs. Oogst vervolgens de geschuurde voetpaden tussen de hiel en de wandelpads en leg de monsters in individuele 1,5 milliliter microtubes op ijs. Plaats vervolgens de muis in de gevoelige positie en maak de vacht nat met 70% ethanol.

Om de wervelkolom bloot te leggen, maak een kleine incisie in het gebied van het bekken en strip de huid van de achterste ledematen naar het hoofd. Om de voor- en achterpoten te verwijderen, gebruikt u een schaar om parallel met en dicht bij de wervelkolom aan beide zijden te snijden. En verwijder het hoofd aan de basis van de schedel.

Gebruik de schaar om de schedel te openen van de foramen magnum naar het frontale bot. En gebruik tangen om de schedel in een zijwaartse richting open te trekken. Gebruik dan de tangen om voorzichtig schep uit de hersenen en plaats de hersenen in een 1,5 milliliter microtube op ijs.

Gebruik gebogen schaar om de wervelkolom van spier, vet en zacht weefsel schoon te maken en verwijder de staart. Plaats vervolgens de intacte wervelkolom in een 15 milliliter buis van steriele ijskoude PBS op ijs voor niet meer dan drie uur. Na de dissectie, breng het ruggenmerg in een weefsel cultuur schotel om verwijdering van eventuele resterende weke delen mogelijk te maken.

Gebruik een scheermesje om drie dwarse sneden te maken door de wervelkolom op de S2, L1, en de T1 wervels. Breng de stukken in individuele 15 millimeter schotels met steriele ijskoude PBS. Het bijhouden en markeren van de oorsprong van de segmenten voor latere analyse.

Gebruik vervolgens tangen om een segment dorsale kant omhoog te beveiligen en gebruik een scheermesje om een enkele, longitudinale cut down door de middellijn om de kolom te splitsen in twee gelijke helften te maken. Plaats beide helften in een nieuwe petrischaal met verse, steriele ijskoude PBS in de oorspronkelijke oriëntatie om de linker- en rechterkant van de wervelkolom te kunnen onderscheiden. Gebruik onder een ontledenmicroscoop fijne tangen om het ruggenmerg voorzichtig uit de elke helft van de wervelkolom te pellen in een rostral naar caudal richting.

Plaats vervolgens beide ruggenmerghelften in individuele 1,5 milliliter microbuisjes met 500 microliter steriele ijskoude PBS op ijs. Om de dorsale wortel ganglion bloot te stellen, verwijder voorzichtig de hersenvliezen van de ene kant van de wervelkolom naar de andere. En trek de blootgestelde witte ruggenmerg zenuw uit de wervelkolom.

Oogst de ronde, transparante rugwortel ganglion uit de wervelkolom segment in een 15 millimeter Petri schotel van ijskoude PBS. En het verzamelen van de ipsilaterale en contralaterale dorsale wortel ganglion zoals net aangetoond. Na het oogsten van de spinale zenuw en dorsale wortel ganglion van de andere twee wervelkolom segmenten zoals net aangetoond, centrifuge alle buizen van weefsel op hoge snelheid.

Dan aspirate de supernatants en flash-freeze de monsters in vloeibare stikstof, en op te slaan op min 80 graden Celsius tot homogenisatie. Voor weefselhomogenisatie ontdooit u de buisjes bevroren weefsel op ijs voordat u 100 milligram van elk monster weegt. Breng over in een twee milliliter microcentrifugebuis met steriele kralen en 500 microliters radioimmunoprecipitatie.

Vervolgens verstoren de weefsels bij kamertemperatuur op een homogenisator op 20 cycli per seconde gedurende twee minuten, gevolgd door een wachttijd van een minuut, en 20 cycli per seconde voor een extra twee minuten. Na de tweede ronde van homogenisatie, centrifugeren de weefsels op hoge snelheid alvorens 500 microliters van elke supernatant in een nieuwe geschikt gelabelde buis. Opslaan op min 20 graden Celsius tot downstream analyse.

De plaats van slijtage is zichtbaar in het controlevoetpad. En het is typisch voor een korst te vormen op de slijtage site als onderdeel van het genezingsproces. Muizen daarentegen ingeënt met pseudorabies, tonen een ernstige ontsteking van het voetpad aan op het humane eindpunt dat wordt gekenmerkt door zwelling en roodheid.

Histopathologisch onderzoek van het ingeënte voetpad en dorsale wortel ganglion onthult epidermale necrose en ernstige huidontsteking binnen de pseudorabies geïnfecteerde voetsecties. Infiltratie van neutrofielen wordt ook waargenomen in pseudorabies geïnfecteerde DRG secties. Een aanzienlijke toename van G-CSF eiwitexpressie wordt gemeten in het voetpad en dorsale wortel ganglion van pseudorabies geïnfecteerde muizen in vergelijking met controles op zowel zeven als 82-uur na infectie.

Significante G-CSF niveaus worden ook waargenomen op 82-uur na infectie in het ruggenmerg, hersenen, hart, en leverweefsels van pseudorabies geïnfecteerde muizen in vergelijking met controles. Bovendien worden significante niveaus van IL-6 gedetecteerd in alle geteste weefsels van met pseudorabies geïnfecteerde muizen vanaf 24 uur na infectie. In een stervende toestand, pseudorabies werd ontdekt in het voetpad, dorsale wortel ganglion, ruggenmerg, en hersenen.

Met de hoge cytoplasmatische expressie van psuedorabies glycoprotein gB in de neuronen van de dorsale wortel ganglion in pseudorabies geïnfecteerde muizen. Om een succesvolle infectie te garanderen, is het belangrijk dat de druppel van het virus in een kolom niet van het geschuurde voetpad valt. Dit diermodel kan platform dienen om de werkzaamheid van ontstekingsremmende en antivirale geneesmiddelen te testen om virale geïnduceerde perifere neuropathieën te voorkomen.