Evaluatie van oxidatieve stress in biologische monsters met behulp van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test
12 mei 2020
Het doel van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test is om oxidatieve stress in biologische monsters te beoordelen door de productie van lipide peroxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde, te meten met behulp van zichtbare golflengtespectrofotometrie bij 532 nm. De hier beschreven methode kan worden toegepast op menselijk serum, cellysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid.
Het TBARS-assay wordt het beste gebruikt voor een algemene intra-laboratorium beoordeling van oxidatieve stress in biologische monsters, waarbij relatieve TBARS-niveaus direct worden vergeleken tussen monsters die samen zijn opgeslagen en verwerkt. Deze assay heeft een extreem lage kostprijs van ongeveer 3 voor het testen van 96 monsters in vergelijking met commercieel verkrijgbare kits, die ongeveer 400 kosten, en slechts één batch monsters toestaan om te worden geanalyseerd. De hier beschreven methode kan verder worden aangepast voor specifieke toepassingen, inclusief stabiliteitsstudies van biospecimens, en voor die waarbij de toevoeging van antioxidanten of andere soorten monsterconserveerders vóór analyse geschikt of vereist is.
Om zeer variabele resultaten te vermijden, bereidt u verse reagentia voor, zorg ervoor dat de pH niet hoger is dan vier voor de kleurreagentia en verwijder eventuele luchtbellen in de nidese-zwelplaat voordat u de absorptie meet. Begin met het bereiden van een 0,8% waterige oplossing van thiobarbituurzuur. Bereid een vijf molaire natriumhydroxide-oplossing door vier gram natriumhydroxidekorrels op te lossen in 20 milliliter water.
Bewaar de oplossing in een plastic container. Deze moet voor elke batch vers worden bereid. Voeg vier gram thiobarbituurzuur toe aan 450 milliliter gedeïoniseerd water en gebruik een magnetische roerstaaf om het voorzichtig op te lossen.
Voeg langzaam ongeveer vier milliliter van de natriumhydroxide-oplossing toe in stappen van 100 microliter, terwijl u de pH controleert terwijl de thiobarbituurzuurdeeltjes oplossen. Blijf natriumhydroxide toevoegen totdat alle deeltjes zijn opgelost. Controleer of de pH van de oplossing niet hoger is dan vier met een pH-strip, breng vervolgens het eindvolume tot 500 milliliter met gedeïoniseerd water en bewaar de waterige thiobarbituurzuur-barbaarse zuuroplossing op kamertemperatuur.
Bereid MDA bis dimethyl acetal standaardcurve-oplossingen in twee milliliter snap cap polypropyleenbuisjes. Door de 200 micromolaire stamoplossing in water te verdunnen zoals beschreven in het tekstdocument. Vortex de monsters.
Label de glazen buisjes voor de te analyseren monsters, voeg vervolgens 100 microliter van de bereide monster toe aan elke buis. Voeg 200 microliter 8,1% SDS toe aan elk monster en schuif de glazen buis in een cirkelvormige beweging om te mengen. Voeg 1,5 milliliter 3,5 molare natriumacetaatbuffer toe aan elk monster, voeg vervolgens 1,5 milliliter van de waterige 0,8% thiobarbituurzuuroplossing toe.
Breng het eindvolume in elke buis op vier milliliter door 700 microliter gedeïoniseerd water toe te voegen. Sluit de glazen buisjes stevig en incubeer ze in een verwarmingsblok ingesteld op 95 graden Celsius gedurende een uur. Bedek de buisjes met aluminiumfolie om condensvorming te voorkomen, verwijder vervolgens de buisjes uit het blok en incubeer ze gedurende 30 minuten op ijs.
Na de incubatie worden de monsters en standaarden gecentrifugeerd bij 1.500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng 150 microliter supernatant van elke buis over naar een putje in een 96-wells plaat, verwijder eventuele luchtbellen met de pipettentip. Meet de absorptie van de monsters bij 532 nanometer, trek vervolgens het gemiddelde absorptieverhouding van de blanke monsters af van alle andere absorptiewaarden.
Maak een standaardcurve en gebruik deze om onbekende monsterconcentraties te berekenen. MDA bis dimethyl acetol standaardcurves werden gegenereerd om de detectielimieten en gevoeligheid van het assay en de oxidatieniveaus in drie verschillende biologische monsters te bepalen. In totaal werden 9 TBARS-assays uitgevoerd op de drie monsters op verschillende dagen.
Om de detectielimieten te bepalen, werd de absorptie van lege monsters gemeten op drie verschillende dagen. De minimale concentratie van TBARS-substantie die nodig is om een detecteerbaar niet-ruisabsorptiesignaal te geven, is 1,1 micromolair. En de gevoeligheid van het assay is ongeveer 0,0016 absorptie-eenheden per micromolair toename in concentratie.
De TBARS-assay kan worden gebruikt om veranderingen in lipideperoxidatie van verschillende biologische matrices te detecteren. Om dit aan te tonen, werd koper twee chloride gebruikt om de in vitro-oxidatie van humane serum HEPG2-cel lysaten en lagedichtheidslipoproteïnen te induceren. Een TBARS-assay werd uitgevoerd op LDL-monsters die EDTA bevatten en de niveaus van TBARS veranderden niet tussen de koper twee behandelde en onbehandelde LDL-monsters.
Echter, nadat EDTA was verwijderd door spinfiltratie, onderging LDL koper twee gemedieerde oxidatie. Om de dynamische reikwijdte van de TBARS-assay in menselijk serum te illustreren, werd een concentratie van twee millimolair koper twee ionen aan de monsters toegevoegd, wat resulteerde in een zes- tot zevenvoudige toename in TBARS. Wanneer u dit protocol probeert, laat de monsters niet langer dan 10 minuten op ijs staan en laat ze na de centrifugatie op kamertemperatuur staan.
Voor batches of subsets van biospecimens die niet oorspronkelijk samen zijn verzameld, verwerkt en bewaard, moet u de gegevens statistisch evalueren op batcheffecten om er zeker van te zijn dat artefactuele oxidatie niet heeft bijgedragen aan de resultaten. Opzettelijk kwantitatief in vitro-oxidatie van lagedichtheidslipoproteïnen maakt het mogelijk om te begrijpen hoe oxidatie het functioneren van de biologie beïnvloedt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Het thiobarbituurzuur reactieve stoffen (TBARS) assay is een kosteneffectieve methode voor het beoordelen van oxidatieve stress in biologische monsters door het meten van lipide peroxidatie producten. Deze methode is bijzonder nuttig voor het vergelijken van relatieve TBARS niveaus in samen verwerkte monsters.
Belangrijke studie componenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Beoordeling van oxidatieve stress
- Analytische Chemie
Achtergrond
- De TBARS assay meet malondialdehyde als een indicator van oxidatieve stress.
- Het kan worden toegepast op verschillende biologische monsters, waaronder humaan serum en cel lysaat.
- Deze assay is goedkoop in vergelijking met commerciële kits.
- Verse reagentia en specifieke pH condities zijn cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
Doel van studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van oxidatieve stress.
- Om vergelijking van TBARS niveaus mogelijk te maken tussen monsters die onder vergelijkbare omstandigheden zijn verwerkt.
- Om de methode aan te passen voor specifieke toepassingen, inclusief stabiliteitsstudies.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een 0,8% waterige oplossing van thiobarbituurzuur.
- Bereiding van een vijf molaire natriumhydroxide oplossing.
- Meting van absorptie bij 532 nm met behulp van zichtbare golflengte spectrofotometrie.
- Zorg ervoor dat reagentia vers zijn en dat de pH onder vier wordt gehouden.
Belangrijkste resultaten
- De TBARS assay biedt een directe vergelijking van oxidatieve stress niveaus.
- Kosteneffectieve testen maakt analyse van meerdere monsters mogelijk.
- Aanpasbaar voor verschillende biologische toepassingen.
- Verse reagentia minimaliseren variatie in resultaten.
Conclusies
- De TBARS assay is een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van oxidatieve stress.
- Het biedt aanzienlijke kostenbesparingen ten opzichte van commerciële alternatieven.
- Juiste voorbereiding en hantering zijn essentieel voor betrouwbare resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The TBARS assay provides a cost-effective, intra-laboratory method for relative oxidative stress assessment in biological samples, supporting early discovery workflows where comparative lipid peroxidation data informs target validation and mechanistic de-risking. Its low cost and adaptability enable reproducible screening of compound effects across sample sets, reducing false positives in lead identification. Proper reagent handling and pH control ensure data reliability for go/no-go decisions in preclinical prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lipid peroxidation changes in response to compound treatment.
- Operational Value: Supports pathway clarification through comparative TBARS levels in disease-relevant systems like human serum and cell lysates.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by identifying compounds that modulate oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by establishing baseline oxidative stress metrics.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fresh reagent preparation and pH ≤4 control.
- Scalability Value: Enables high-throughput screening readiness with 96-sample processing at ~$3 per batch.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detectable TBARS changes in LDL oxidation models upon EDTA removal.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying invitro oxidation effects on lipoprotein function.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions via dose-responsive TBARS increases (e.g., 6-7 fold with 2 mM Cu²⁺ in serum).
Pipeline & Workflow Integration
The TBARS assay fits within the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, providing oxidative stress readouts that help prioritize compounds before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring lipid peroxidation as a functional readout of pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, low-cost processing of biospecimens stored and processed together.
- Analytics: Generates quantitative absorbance measurements at 532 nm, enabling LOD of 1.1 µM and sensitivity of 0.0016 AU/µM for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling LDL oxidation to understand functional biological impacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for batch-wise oxidative stress assessment across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct comparison of oxidative stress levels.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fresh reagent preparation and controlled incubation (95°C, 1 hr).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in lipid peroxidation pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via detection of concentration-dependent TBARS changes in biological matrices.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reagent preparation, pH control, and spectrophotometric measurement.
- Needs heating block (95°C), centrifuge, and visible wavelength spectrophotometer.
- Demands cross-team standardization of sample storage and processing to avoid batch effects.
- Requires adaptation considerations for biospecimens with antioxidants or preservatives.
- Limited to relative comparisons; absolute quantification requires MDA-bis-acetal standard curves.
