Flypub om ethanol geïnduceerde gedragsstoornissen en sensibilisatie te bestuderen
18 mei 2020
De Flypub test meet het gedrag dat de fruitvlieg Drosophila melanogaster toont onder invloed van ethanol. De test kan gemakkelijk worden beheerst door onderzoekers op alle niveaus en toegepast op verschillende verdampte stimuli, het vergemakkelijken van drugsmisbruik en verslavingsstudies.
De Flypub-test meet ontremd gedrag onder invloed van alcohol. Daardoor het vergemakkelijken van de mechanistische studie van alcoholgebruik stoornis. Alcohol is een van de meest direct beschikbare en op grote schaal misbruikt drugs in de wereld.
Het neurobiologische mechanisme dat ten grondslag ligt aan alcoholgebruik, wordt echter onvolledig begrepen. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is op grote schaal gebruikt om de effecten van ethanol op euforie, bewegingsvrijheid, disinhibition en sedatie te bestuderen. Het wordt ook gebruikt om de langdurige en duurzame veranderingen in gedrag dat relevant is voor verslaving te bestuderen, zoals tolerantie, sensibilisatie en ethanolzoeken.
Veel studies in Drosophila en andere diermodellen richten zich op de motorische activerende effecten van ethanol. Het duidelijke effect van ethanol is gedragsonthibitie. Echter, het is studie is nogal ondervertegenwoordigd.
Om dit belangrijke probleem aan te pakken, ontwikkelden we de Flypub-test om ondeinbaar gedrag onder invloed van ethanol te meten. Om de Flypub kamer te monteren, neem een ronde fles en snijd het onderste gedeelte van een 25 milliliter merk met een scheermesje. Maak een gat op de 50 milliliter merk met behulp van een hete soldeerbout.
Dit is het toegangspunt waar vliegen zullen worden geïntroduceerd. Plaats een ronde mesh 54 millimeter in diameter op de 75 milliliter merk, en zet het met behulp van hete lijm. Plaats een doorzichtig plastic vel met een diameter van 70 millimeter aan de open onderkant en bevestig deze met behulp van hete lijm.
Om ervoor te zorgen dat de kunststof ronde stevig aan de bodem is bevestigd, druk naar beneden met behulp van gewichten. Verzamel mannelijke vliegen in een groep van 33. Plaats ze op de zijkant van een voedsel flesje.
Plaats ze in een 25 graden Celsius incubator met ten minste 50% relatieve vochtigheid en een 12 uur licht, 12 uur donkere cyclus gedurende 2 dagen voor blootstelling aan ethanol. Bereid het Flypub-teststation voor door lichten, een computer en een camera in te schakelen voor video-opname. Bereid zes pubs voor op een reeks experimenten.
Label ze met een nummer één tot en met zes. Introduceer de vliegen voorzichtig in de kroeg met een kleine trechter. Sluit de pub met een tape.
Acclimatiseren de vliegen voor 10 minuten. Tijdens de acclimatisatie, aanpassen camera focus en neem de laatste vijf minuten van acclimatisatie. Bereid tijdens de acclimatisatie wattenschijfjes voor op de levering van ethanol.
Snijd een wattenschijfje in vier gelijke kwadranten en trim vervolgens de hoeken om het te laten passen in een petrischaaltje. Voeg een wattenschijfje toe aan een petrischaaltje. Voeg een milliliter van 95% ethanol toe aan het wattenschijfje.
Zorg ervoor dat ethanol oplossing gelijkmatig worden verdeeld over het gehele gebied van het pad. Bedek petrischaaltje snel met labdoekjes. Plaats voorzichtig een ethanol met petrischaaltje onder elke pub.
Lijn de pubs op het podium. Begin met opnemen en start tegelijkertijd een timer. Record tot vliegen stoppen met het courten of bewegen.
Verwijder de ethanol met petrischaal wanneer meer dan 90% van de vliegen zijn verdoofd. Breng de verdoofde vliegen voorzichtig terug in voedsel flesjes. Plaats ze terug in de couveuse.
Herhaal de vorige stappen elke 24 uur gedurende zes opeenvolgende dagen. Open de video met een mediaspeler. Dan score het aantal mannen die zich bezighouden met verkering activiteiten om de 10 seconden.
Verkering activiteiten om te scoren omvatten volgende: eenzijdige vleugel uitbreiding, verkering keten, verkering cirkel, buik buigen en montage. Getoond zijn representatieve opnames van vlieggedrag. Tijdens de acclimatisatie waar mannetjes niet veel activiteit vertonen.
Tijdens de eerste blootstelling waar mannen vertonen sporadische verkering. En tijdens de zesde blootstelling waar mannen vertonen activiteit verkering. Voer het aantal mannen weergegeven verkering in een tien seconden tijd blok.
Gebruik het maximale aantal mannelijke rechtbanken in drie opeenvolgende 10 seconden tijdblokken als representatief gegevenspunt. Het gemiddelde van 10 opeenvolgende gegevenspunten met de hoogste waarde vertegenwoordigen het percentage intermale verkering per pub. Het wilde type Canton-S vertonen geleidelijk verhoogde activiteiten van onverdekt verkering bij herhaalde blootstelling aan ethanol.
Dit vertegenwoordigt gedragssensibilisatie aan disinhibition effect van ethanol. We onderzochten de rol van octopamine in sensibilisatie door het testen van de vliegen die ontbreken tyramine beta-hydroxylase, T beta H, dus een tekort aan octopamine. Net als Canton-S vertoonden de T beta H mutanten geëscaleerde reacties op herhaalde blootstelling aan ethanol, maar op een lager niveau.
Toen we T beta H en Canton-S vergeleken, merkten we op dat de T beta H mutant mannetjes minder ontmoedigd verkering vertoonden dan Canton-S mannetjes bij elke blootstelling, wat aangeeft dat octopamine belangrijk kan zijn voor sensibilisatie. Nu u gedrag dat door ethanol wordt geïnduceerd instellen, uitvoeren en analyseren met behulp van de Flypub-test. De belangrijkste punten om in gedachten te houden zijn, een, een goede montage van de pub.
Twee, consistente ethanol levering, en drie, nauwkeurige en onbevooroordeelde gedragsscore. De Flypub test heeft vele voordelen. Het is eenvoudig, goedkoop op te zetten, en gemakkelijk te leren.
Ook kunnen meerdere groepen vliegen tegelijkertijd worden getest, waardoor deze studie wordt vergemakkelijkt om de effecten van genetische of experimentele manipulaties te identificeren. De Flypub test is zeer aantrekkelijk voor onderzoekers op alle niveaus, waaronder elementaire door middel van middelbare school, undergraduate en graduate studenten, post docs en faculteit. Samengevat, de Flypub test zal u toelaten om moleculaire spelers, cellulaire trajecten, hersencircuits, en risicofactoren die bijdragen aan alcoholgebruik stoornis te identificeren.
Overzicht
De Flypub-assay meet ontremd gedrag bij de fruitvlieg Drosophila melanogaster onder invloed van ethanol. Deze assay is ontworpen om het onderzoek naar alcoholgebruiksstoornissen te vergemakkelijken en kan eenvoudig worden beheerst door onderzoekers van alle niveaus.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Onderzoek naar alcoholgebruikstoornissen
Achtergrond
- Alcohol wordt op grote schaal misbruikt, maar de neurobiologische mechanismen hiervan zijn nog niet volledig begrepen.
- Drosophila melanogaster dient als modelorganisme voor het bestuderen van de effecten van ethanol.
- De Flypub-assay richt zich specifiek op de onderbelichte studie naar gedragsmatige ontremming veroorzaakt door ethanol.
- Eerdere studies hebben zich primair gericht op locomotorische effecten in plaats van op ontremming.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het meten van ontremd gedrag als reactie op ethanol.
- Het onderzoeken van de rol van octopamine bij gedragssensitisatie in verband met alcoholblootstelling.
- Het bieden van een eenvoudige en effectieve assay voor onderzoekers om verslavingsmechanismen te bestuderen.
Gebruikte methoden
- Assemblage van de Flypub-kamer met gebruik van een aangepaste fles.
- Voorbereiding van mannelijke Drosophila voor blootstelling aan ethanol.
- Video-opname van het vlieggedrag tijdens hofmakerijactiviteiten.
- Score van hofmakerijgedragingen om ontremmingseffecten te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Wildtype Canton-S vliegen vertoonden een toename in ongeremd hofmakerijgedrag bij herhaalde blootstelling aan ethanol.
- T beta H mutanten vertoonden een verminderde disinhibitie in vergelijking met Canton-S, wat wijst op de rol van octopamine.
- De assay maakt het mogelijk om meerdere vlieggroepen gelijktijdig te testen.
- Consistente toediening van ethanol en nauwkeurige scoring zijn cruciaal voor betrouwbare resultaten.
Conclusies
- De Flypub-assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van de effecten van ethanol op het gedrag.
- Het kan helpen bij het identificeren van moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij alcoholgebruiksstoornissen.
- De assay is toegankelijk voor onderzoekers op verschillende opleidingsniveaus.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De Flypub-assay vult een kritisch gat in het onderzoek naar alcoholgebruiksstoornissen door zich te richten op ethanol-geïnduceerde gedragsmatige ontremming, een belangrijke adaptieve verandering die ten grondslag ligt aan verslaving. Door het mogelijk maken van de meting van verhoogde ontremde balts bij Drosophila melanogaster, ondersteunt de assay targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. De eenvoud, schaalbaarheid en compatibiliteit met genetische instrumenten vergroten het voorspellend vertrouwen bij het onderzoeken van signaalpaden en circuits in verslavingsmechanismen.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door verhoogd ontremd gedrag te meten als proxy voor sensitisatie voor ethanol.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van genetische targets mogelijk, zoals componenten van het octopamine-pad, via verminderde ontremmingsfenotypes.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door gedragssensitisatie over genotypes te kwantificeren, wat helpt bij de prioritering van targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door baseline- en gesensitiseerde disinhibitiereacties vast te stellen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de toediening van ethanol en de gedragsscore, wat de reproduceerbaarheid tussen experimentele sets en laboratoria waarborgt.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt het gelijktijdig testen van meerdere vliegenpopulaties mogelijk, wat de parallelle beoordeling van genetische of farmacologische manipulaties faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Verbindt disinhibitiesensitisatie bij vliegen met zoogdiermodellen van verslaving, wat bijdraagt aan doelwitvalidatie over verschillende soorten heen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt dissectie mogelijk van moleculaire spelers, cellulaire paden en hersencircuits die bijdragen aan ethanol-geïnduceerde gedragsveranderingen.
- Predictieve continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door doelwitmodulatie te koppelen aan disinhibitie-fenotypen bij herhaalde blootstelling.
Integratie van Pipeline & Workflow
De Flypub-assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van hypothesen over targets tot aan de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor targets gerelateerd aan verslaving die de gedragsregulatie beïnvloeden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van genen en signaalpaden die betrokken zijn bij de ethanolrespons, zoals tyramine beta-hydroxylase en octopamine-signalering.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde kamers, consistente ethanolpreparatie en kwantificeerbare courtship-scoring elke 10 seconden.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele — het percentage intermale courtship per pub — wat vergelijking tussen condities en genotypen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt desinhibitiesensitisatie met preklinische relevantie door het modelleren van escalerende responsen die vergelijkbaar zijn met verslavingsgedrag.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het evalueren van genetische, farmacologische of omgevingsmodificatoren van de ethanolrespons over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit rond disinhibitie-sensitisatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde assemblage van de kamer, ethanol-toediening en geblindeerde gedragsscoren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het leveren van kwantitatieve, escalatiegebaseerde fenotypen die verslavingsrelevante neuroadaptaties weerspiegelen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van hun invloed op gedragssensitisatie-trajecten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, gedragsobservatie en videogebaseerde scoring.
- Is afhankelijk van instrumentatie voor de toediening van ethanol, videoregistratie en omgevingscontrole (25°C, 50% luchtvochtigheid, 12u licht/donker-cyclus).
- Maakt standaardisatie van hofmakingscriteria en scoring-intervallen tussen teams noodzakelijk om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het uitbreiden van de assay om andere ethanol-geïnduceerde gedragingen naast ontremming van de hofmakerij te meten.
- Omvat praktische beperkingen zoals bias van de scorer en variabiliteit in de motivatie van de vliegen, wat wordt beperkt door de maximale hofmakerij over opeenvolgende tijdsblokken te gebruiken.
