Name: Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer ChIP-Exo voor hoge-resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muizenneuronen. Deze methode bereikt bijna base-pair resolutie en verbetert het begrip van genregulatie in neurale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het lid van het Rhee-laboratorium voor het delen van ongepubliceerde gegevens en waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door De Raad van het Onderzoek van de Natuurwetenschappen en van de Techniek van Canada (NSERC) toekenning RGPIN-2018-06404 (H.R.).

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatten%2C+DK+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biology. 14 (12), 147(2013).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).</li>
<li>Starick, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+signal+associated+with+DNA-binding+motifs+provides+insight+into+the+genomic+binding+of+the+glucocorticoid+receptor+and+cooperating+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors.</a> Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).</li>
<li>Han, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Organization+of+GATA1+and+TAL1+Determined+at+High+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution.</a> Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+Structures+and+Nucleosome+Asymmetry+across+a+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome.</a> Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).</li>
<li>Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+regulon+of+a+GntR+family+regulator+via+transcriptome+and+ChIP-exo+analyses+and+its+contribution+to+virulence+in+Xanthomonas+citri%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri.</a> Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+assessment+of+transcriptional+regulation+on+central+carbon+metabolism+by+Cra+and+CRP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP.</a> Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).</li>
<li>Niu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+binding+interactions+of+mouse+and+human+constitutive+androstane+receptors+reveal+novel+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets.</a> Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).</li>
<li>Uuskula-Reimand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+beta+interacts+with+cohesin+and+CTCF+at+topological+domain+borders%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders.</a> Genome Biology. 17, (2016).</li>
<li>Rhee, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Terminal+Effector+Genes+in+Mammalian+Neurons+Is+Maintained+by+a+Dynamic+Relay+of+Transient+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers.</a> Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> Plos One. 11 (2), (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+Gene+Network+Mediates+Cellular+Response+to+the+Anticancer+PAD+Inhibitor+YW3-56+in+Triple-Negative+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).</li>
<li>Barfeld, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Myc+Antagonises+the+Transcriptional+Activity+of+the+Androgen+Receptor+in+Prostate+Cancer+Affecting+Key+Gene+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Ebiomedicine%22%5BJournal%5D)">c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks.</a> Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).</li>
<li>McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+ChIP-exo+profiling+of+Pol+II%2C+H2A.Z%2C+and+H3K4me3+in+human+K562+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells.</a> Scientific Data. 5, 180030(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+transcriptional+profiling+of+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer.</a> Scientific Data. 6, 190033(2019).</li>
<li>Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+ChIP-exo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Simplified ChIP-exo assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChIP-exo+Method%3A+Identifying+Protein-DNA+Interactions+with+Near+Base+Pair+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+Histone+Modifications+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li>
<li>Terranova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Platform+for+Genome-wide+Mapping+of+Chromatin+States+Using+High-throughput+ChIP-sequencing+in+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).</li>
<li>Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Parameters+for+Efficient+Sonication+and+Improved+Chromatin+Immunoprecipitation+of+High+Molecular+Weight+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins.</a> PLos One. 11 (1), (2016).</li>
<li>Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein-DNA+binding+event+subtypes+in+ChIP-exo+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data.</a> Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).</li>
<li>Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWR-C+and+INO80+chromatin+remodelers+recognize+nucleosome-free+regions+near+%2B1+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes.</a> Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).</li>
<li>Vinayachandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+precise+reprogramming+of+yeast+protein-genome+interactions+in+response+to+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock.</a> Genome Research. , (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol wordt ChIP gevolgd door exonucleasevertering gebruikt om DNA-bibliotheken te verkrijgen voor de identificatie van eiwit-DNA-interacties in zoogdiercellen met een ultrahoge kaartresolutie. Veel variabelen dragen bij aan de kwaliteit van het ChIP-exo experiment. Kritieke experimentele parameters omvatten de kwaliteit van antilichamen, optimalisatie van sonicatie en het aantal LM-PCR-cycli. Deze kritische experimentele parameters zijn ook wat ChIP-exo experimenten kan beperken en zullen hieronder worden besp...

De locaties van eiwit-DNA interacties geven inzicht in de mechanismen van genregulatie. Chromatine immunoprecipitatie in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-seq) wordt al tien jaar gebruikt om genoombrede eiwit-DNA-interacties in levende cellen te onderzoeken1,2. De ChIP-seq-methode wordt echter beperkt door heterogeniteit in DNA-fragmentatie en ongebonden DNA-besmetting die leiden tot een lage mappingresolutie, valse positieven, gemiste oproepen en niet-specifiek achtergrondsignaal. De combinatie van ChIP met exonucleasevertering (ChIP-exo) verbetert de ChIP-seq-methode door ChIP-DNA bij te snijden tot de eiwit-DNA-crosslinkingpunten, wat een bijna basispaarresolutie en een laag achtergrondsignaal3,4,5biedt. De sterk verbeterde kaartresolutie en lage achtergrond van ChIP-exo maken het mogelijk om nauwkeurige en uitgebreide eiwit-DNA-bindingslocaties in het hele genoom te bepalen. ChIP-exo is in staat om functioneel verschillende DNA-bindende motieven, coöperatieve interacties tussen transcriptiefactoren (TF) en meerdere eiwit-DNA-crosslinking sites op een bepaalde genomische bindingslocatie te onthullen, niet detecteerbaar door andere genomische mapping methoden3,4,6,7.
ChIP-exo werd aanvankelijk gebruikt in ontluikende gist om de sequentiespecifieke DNA-binding van TF 's te onderzoeken, om de precieze organisatie van het transcriptie pre-initiatiecomplex en subnuclesosomale structuur van individuele histonen in het genoom4,8,9te bestuderen . Sinds de introductie in 20114, ChIP-exo is met succes gebruikt in vele andere organismen, waaronder bacteriën, muizen en menselijke cellen7,10,11,12,13,14,15,16,17. In 2016 gebruikten Rhee et al.14 ChIP-exo in zoogdierneuronen voor het eerst om te begrijpen hoe neuronale genexpressie werd gehandhaafd na de downregulatie van het programmeren van TF Lhx3, dat een heterodimercomplex vormt met een andere programmering TF Isl1. Deze studie toonde aan dat bij afwezigheid van Lhx3 Isl1 wordt gerekruteerd naar nieuwe neuronale versterkers gebonden door Onecut1 TF om genexpressie van neuronale effectorgenen te behouden. In deze studie onthulde ChIP-exo hoe meerdere TF's celtype en celfasespecifieke DNA-regulerende elementen dynamisch herkennen op een combinatorische manier bij de mappingresolutie van near-nucleotide. Andere studies gebruikten ook de ChIP-exo-methode om het samenspel tussen eiwitten en DNA in andere zoogdiercellijnen te begrijpen. Han et al.7 gebruikten ChIP-exo om genoombrede organisatie van GATA1 en TAL1 TFs in muis erythroid cellen te onderzoeken met behulp van ChIP-exo. Deze studie vond dat TAL1 direct wordt gerekruteerd naar DNA in plaats van indirect door eiwit-eiwit interacties met GATA1 tijdens erythroid differentiatie. Recente studies gebruikten ook ChIP-exo om de genoombrede bindingslocaties van CTCF, RNA Polymerase II en histonsporen te profileren om epigenomische en transcriptionele mechanismen in menselijke cellijnen18,19te bestuderen .
Er zijn verschillende versies van het ChIP-exo protocol beschikbaar3,5,20. Deze ChIP-exo-protocollen zijn echter moeilijk te volgen voor onderzoeken die niet bekend zijn met de voorbereiding van de volgende generatie sequencingbibliotheek. Een uitstekende versie van het ChIP-exo-protocol werd gepubliceerd met gemakkelijk te volgen instructies en een video21, maar bevatte veel enzymatische stappen die een aanzienlijke hoeveelheid tijd nodig hebben om te voltooien. Hier rapporteren we een nieuwe versie van het ChIP-exo-protocol met verminderde enzymatische stappen en incubatietijden, en uitleg voor elke enzymatische stap21. Eindreparatie en dA-tailingreacties worden in één stap gecombineerd met behulp van endprep-enzym. De incubatietijden voor index- en universele adapter ligatiestappen worden verminderd van 2 uur tot 15 minuten met behulp van een ligatieversterker. De kinasereactie na de indexadapter ligatiestap die in het vorige ChIP-exo-protocol wordt beschreven, wordt verwijderd. In plaats daarvan wordt tijdens de oligo-DNA-synthese een fosfaatgroep toegevoegd aan een van de 5'-uiteinden van de indexadapter (tabel 1), die zal worden gebruikt voor de lamda-exonucleaseverteringsstap. Terwijl het vorige ChIP-exo-protocol recjf exonucleasevertering gebruikte om enkelstrengs DNA-verontreinigingen te elimineren, wordt deze spijsverteringsstap hier verwijderd omdat het niet van cruciaal belang is voor de kwaliteit van de ChIP-exo-bibliotheek. Bovendien wordt voor het zuiveren van omgekeerd gekruist DNA na ChIP-elutie een magnetische kralenzuiveringsmethode gebruikt in plaats van de extractiemethode fenol:chloroform:isoamylalcohol (PCIA). Dit vermindert de incubatietijd van DNA-extractie. Belangrijk is dat het de meerderheid van de adapterverteerders verwijdert die zijn gevormd tijdens indexadapter ligatie, wat van invloed kan zijn op de efficiëntie van ligatiegemedieerde PCR.
Het hier gepresenteerde ChIP-exo-protocol is geoptimaliseerd voor de detectie van nauwkeurige eiwit-DNA-interacties in zoogdierneuronen die zijn onderscheiden van embryonale stamcellen (ES)-cellen van muizen. Kort, geoogste en gekruiste neuronale cellen worden gelyseerd, zodat chromatine kan worden blootgesteld aan sonicatie, vervolgens gesoniceerd zodat dna-fragmenten van de juiste grootte worden verkregen (figuur 1). Antilichaamomhulde kralen worden vervolgens gebruikt om selectief gefragmenteerde, oplosbare chromatine te immunoprecipiteren aan het eiwit van belang. Terwijl het immunogeprecipiteerde DNA nog op de kralen zit, worden eindreparatie, ligatie van sequencingadapters, invulreactie en 5' tot 3' lambda exonucleaseverteringsstappen uitgevoerd. De exonucleaseverteringsstap geeft ChIP-exo zijn ultrahoge resolutie en hoge signaal-ruisverhouding. Lambda exonuclease trimt het immunogeprecipiteerde DNA een paar baseparen (bp) van de crosslinking site, waardoor besmet dna wordt afgebroken. Het met exonuclease behandelde ChIP-DNA wordt ontlokt uit de met antilichamen bedekte kralen, eiwit-DNA-crosslinks worden omgekeerd en eiwitten worden afgebroken. DNA wordt geëxtraheerd en gedenatureerd tot enkelstrengs ChIP-DNA, gevolgd door primergloeien en uitbreiding om dubbelstrengs DNA (dsDNA) te maken. Vervolgens wordt ligatie van een universele adapter naar de met exonuclease behandelde uiteinden uitgevoerd. Het resulterende DNA wordt gezuiverd, vervolgens PCR versterkt, gel gezuiverd en onderworpen aan sequencing van de volgende generatie.
Het ChIP-exo protocol is langer dan het ChIP-seq protocol, maar is technisch gezien niet erg uitdagend. Elk succesvol immunogeprecipiteerd ChIP-DNA kan worden onderworpen aan ChIP-exo, met verschillende extra enzymatische stappen. De opmerkelijke voordelen van ChIP-exo, zoals ultrahoge kaartresolutie, een verminderd achtergrondsignaal en verminderde vals-positieve en negatieven, met betrekking tot genomische bindingssites, wegen zwaarder dan de tijdskosten.

<table><tbody><tr><td>Agarose, UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td>Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)</td></tr><tr><td>Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98%</td><td>BioShop</td><td>ALB003</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Antibody against Isl1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>Antibody incuation with beads (Section 5.6)</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>Sonicating Chromatin (Section 3.3)</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade</td><td>New England BioLabs</td><td>B9000S</td><td>Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td>Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4)</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1)</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer</td></tr><tr><td>dATP Solution</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440S</td><td>dA-Tailing Reaction (Section 15.1)</td></tr><tr><td>Deoxycholic Acid Sodium Salt</td><td>fisher scientific</td><td>BP349</td><td>Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer</td></tr><tr><td>dNTP Mix, Molecular Biology Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)</td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td>Ligation-Mediated PCR (Section 18.1)</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td>Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol Anhydrous, 100%</td><td>Commercial alcohols</td><td>P006EAAN</td><td>Checking Sonication (Section 4.3.3)</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1)</td></tr><tr><td>Glycerol, Reagent Grade, min 99.5%</td><td>BioShop</td><td>GLY002</td><td>Lysis Buffer 1</td></tr><tr><td>Glycine, Biotechnology Grade, min. 99%</td><td>BioShop</td><td>GLN001</td><td>Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2)</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td>Checking Sonication (Section 4.3.3)</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>HEP003</td><td>Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3->5 exo-)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>dA-Tailing Reaction (Section 15.1)</td></tr><tr><td>Lambda exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262S</td><td>Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2)</td></tr><tr><td>Ligase Enhancer</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)</td></tr><tr><td>Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)</td></tr><tr><td>Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade</td><td>Bioshop</td><td>LIT704</td><td>LiCl Wash Buffer</td></tr><tr><td>Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G)</td><td>Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)</td><td>Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)</td><td>Antibody incubation with beads (Section 5)</td></tr><tr><td>Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1)</td></tr><tr><td>Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet)</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28604</td><td>Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2)</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, &ge;97.0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>61747</td><td>Lysis Buffer 3</td></tr><tr><td>Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1)</td><td>BioShop</td><td>PHE512</td><td>Checking Sonication (Section 4.3.1)</td></tr><tr><td>phi29 DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269L</td><td>Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4)</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td>Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1)</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)</td></tr><tr><td>ProFlex PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>ProFlex PCR System</td><td>Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube, 2.0 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3)</td></tr><tr><td>Proteinase K Solution, RNA Grade</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)</td></tr><tr><td>Qubit 4.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)</td></tr><tr><td>Quibit dsDNA BR assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)</td></tr><tr><td>Rnase A, Dnase and Protease-free</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td>Check

hoge resolutie mapping van eiwit-dna interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (chip-exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identificatie van specifieke eiwit-DNA-interacties op het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Chromatine immunoprecipitatie in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-seq) wordt veel gebruikt om genoombrede bindingslocaties van DNA-bindende eiwitten te identificeren. De ChIP-seq-methode wordt echter beperkt door zijn heterogeniteit in lengte van gesoniceerde DNA-fragmenten en niet-specifiek achtergrond-DNA, wat resulteert in een lage mappingresolutie en onzekerheid op DNA-bindende locaties. Om deze beperkingen te overwinnen, maakt de combinatie van ChIP met exonucleasevertering (ChIP-exo) gebruik van 5' tot 3' exonucleasevertering om het heterogene formaat immunogeprecipiteerde DNA te trimmen naar de eiwit-DNA-crosslinking site. Exonuclease behandeling elimineert ook niet-specifiek achtergrond DNA. Het door de bibliotheek voorbereide en exonuclease verteerde DNA kan worden verzonden voor sequencing met hoge doorvoer. De ChIP-exo-methode maakt een bijna base-pair mapping resolutie mogelijk met een grotere detectiegevoeligheid en een verminderd achtergrondsignaal. Een geoptimaliseerd ChIP-exo-protocol voor zoogdiercellen en sequencing van de volgende generatie wordt hieronder beschreven.

Figuur 2A illustreert sonicatieresultaten na cellyse en sonicatie, met verschillende cycli, van motorneuroncellen onderscheiden van muis ES-cellen. Het optimale aantal sonicatiecycli (bijvoorbeeld 12 cycli in figuur 2A)genereerde een sterke DNA-intensiteit in 100−400 bp DNA-fragmenten. Hoogwaardige ChIP-exo bibliotheken zijn gebaseerd op de grootte en kwantiteit van gefragmenteerd chromatine DNA. Optimalisatie van sonicatie wordt dus aanbevolen voor elk celtype ...

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Het grootste voordeel van onze ChIP-exo-methode is de verbeterde mappingresolutie van eiwit-DNA-interacties in de cel in vergelijking met de conventionele chromatine-immunoprecipitatiemethode. Om de magnetische kralen van eiwit G voor ChIP voor te bereiden, meng de magnetische kralen tot ze homogeen zijn. Voeg vervolgens 25 microliter van de magnetische kralen toe aan een twee milliliter eiwit-low bind buis.Voeg een milliliter blokkeringsoplossing toe aan de kralen. Meng goed door te pipetten, plaats vervolgens de buis een minuut op een magnetisch rek. Zodra het supernatant helder is, verwijder het.Voeg vervolgens een milliliter blokkeringsoplossing toe aan de kralen. Plaats de buis op een wiebelplatform op vier graden Celsius en wiebel gedurende 10 minuten, draai vervolgens kort door de buis. Plaats de buis op het magnetisch rek en verwijder het supernatant.Voeg 500 microliter blokkeringsoplossing toe aan de magnetische kralen. Draai kort door het antilichaam tegen Islet-1, voeg vervolgens vier microgram van het antilichaam toe aan de buis met de magnetische kralen. Plaats de buis met magnetische kralen en Islet-1-antilichaam op een wiebelplatform op vier graden Celsius en wiebel gedurende zes tot 24 uur.Om de chromatine-immunoprecipitatie te beginnen, was de antilichaam-gecoate kralen in een milliliter blokkeringsoplossing. Plaats de buis met de antilichaam-gecoate kralen vijf minuten op een wiebelplatform op vier graden Celsius. Na kort doordraaien, plaats de buis op een magnetisch rek en verwijder het supernatant.Resuspendeer de antilichaam-gecoate kralen in 50 microliter blokkeringsoplossing. Voeg een milliliter gesoniseerde lysaten toe aan de antilichaam-gecoate kralen en incubeer vervolgens het monster op een wiebelplatform op vier graden Celsius overnacht. Nadat het monster overnacht is ingecubeerd, verzamel het vocht uit de dop door kort door de buis te draaien en plaats de buis vervolgens op een magnetisch rek.En na een minuut, verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet. Voer vervolgens een reeks wasbeurten uit zoals hieronder. Voeg een milliliter koude wasbuffer met CPI toe aan het monster.Meng het monster op een wiebelplatform op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Draai kort door de monsterbuis, plaats vervolgens op een magnetisch rek. Na een minuut, verwijder het supernatant met een pipet.Voor de eerste enzymatische reactie en reparatie en DA-staartvorming, voeg 38 microliter autoclaved dubbel gedistilleerd water toe aan het monster, voeg vervolgens end prep reactiemix en end prep enzymmix toe. Meng de inhoud van de buis door te pipetten en incubeer het monster gedurende 30 minuten op 20 graden Celsius. Was vervolgens de monsterkralen met hoge zout wasbuffer, lithiumchloride wasbuffer en 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer zoals eerder beschreven.Voer de indexadapter ligatie uit door 27 microliter koude 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer toe te voegen aan het monster. Voeg vervolgens indexadapter, ligatie versterker en ligase master mix toe. Incubeer het monster gedurende 15 minuten op 20 graden Celsius.Was opnieuw de monsterkralen met hoge zout wasbuffer, lithiumchloride wasbuffer en 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer. Voeg vervolgens 47 microliter koude 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer toe aan het monster. Om de snede in het DNA te repareren die het gevolg is van de ontbrekende fosfodiësterbinding, voeg 11,1 microliter van de vulmix toe aan het monster.Incubeer het monster gedurende 20 minuten op 30 graden Celsius. Na een reeks wasbeurten, voeg 50 microliter koude autoclaved dubbel gedistilleerd water toe aan het monster. Om de ChIP DNA in de vijf prime naar drie prime richting te verteren, voeg lambda exonuclease buffer en lambda exonuclease toe en meng het monster door te pipetten.Incubeer het monster gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Nadat de vertering voltooid is, herhaal de drie wasbeurten nog een laatste keer. Om ChIP-monster uit de kralen te elueren, resuspendeer het monster in 75 microliter ChIP elutiebuffer en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende 15 minuten bij 130 keer G.Voeg 2,5 microliter van 20 milligram per milliliter proteinase K toe aan het monster.Vortex het monster kort en incubeer overnacht op 65 graden Celsius. Draai kort door het monster en plaats op een magnetisch rek. Na een minuut, breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis.Zuiver en elueer het DNA. Na zuivering van het elueerde DNA, breng 16 microliter van het geëxtraheerde DNA-monster over naar een PCR-buis. Voeg 1,2 microliter denaturerende en primer anneering mix toe aan het monster.Gebruik het programma dat in tabel zes van het manuscript beschreven staat om primers te denatureren en te anneeren aan het sjabloon-DNA. Voeg drie microliter primer extensie mix toe aan het monster en voer het PCR-programma uit dat in tabel zeven van het manuscript beschreven staat. Voeg 4,1 microliter DA staartmix toe aan het monster en voer het monster uit met behulp van het PCR-programma in tabel acht van het manuscript.Voeg vervolgens 21,5 microliter universele adapter ligatie mix toe aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten op 20 graden Celsius. Voeg 29 microliter LM-PCR mix toe aan het monster en voer het monster uit met behulp van het programma uit tabel 10 van het manuscript. Na 18 cycli van LM-PCR, werden ChIP-exo monsters van muis motor neuronen geëlektroforeerd op een 1,5% agarose gel.De resultaten voor ChIP-exo Islet-1 vertoonden versterkte DNA bibliotheken rond 200 tot 400 base pairs, wat aangeeft dat de ChIP-exo bibliotheken met succes werden versterkt door LM-PCR. De band rond 100 base pairs vertegenwoordigt artefacten van adapters en PCR primers. De controle zonder antilichaam toont aan dat niet-specifiek achtergrond-DNA werd verteerd door de lambda exonuclease behandeling.Met behulp van ChIP-exo en ChIP-seq, werden Islet-1 gebonden locaties geïdentificeerd. Het ChIP-exo signaal was sterk gericht op Islet-1 bindingsplaatsen en detecteerde meerdere geclusterde

high-resolution-mapping-protein-dna-interactions-mouse-stem-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video demonstrates the immunoprecipitation of DNA fragments crosslinked with target protein from stem cell-derived motor neuron lysates using target protein-specific antibody-coated magnetic beads.

Immunoprecipitation of Target Protein-DNA Complexes from Motor Neuron Lysate

Source: Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.  (2018).This video demonstrates the isolation of protein-DNA complexes from neurosphere cells derived from a mouse brain tumor using native chromatin immunoprecipitation. It details the steps for chromatin preparation, immunoprecipitation, washing, and protein digestion to release DNA for downstream analysis.

Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

Hier presenteren we een protocol om een resolutie van bijna base-paar te bereiken van eiwit-DNA-interacties. Dit wordt verkregen door exonuclease-behandeling van DNA-fragmenten die selectief zijn verrijkt door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP-exo) gevolgd door high-throughput sequencing.

De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.

CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Een protocol voor het in kaart brengen van de driedimensionale genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met behulp van de genoomwijde chromosoomconformatie-capture-methode Micro-C-XL wordt hier gepresenteerd.

3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

Leer ChIP-Exo voor hoge-resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muizenneuronen. Deze methode bereikt bijna base-pair resolutie en verbetert het begrip van genregulatie in neurale ontwikkeling.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo) (Video) | JoVE Journal

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Meer video's verkennen