Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)
14 augustus 2020
Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.
Het grootste voordeel van onze ChIP-exo-methode is de verbeterde mappingresolutie van eiwit-DNA-interacties in de cel in vergelijking met de conventionele chromatine-immunoprecipitatiemethode. Om de magnetische kralen van eiwit G voor ChIP voor te bereiden, meng de magnetische kralen tot ze homogeen zijn. Voeg vervolgens 25 microliter van de magnetische kralen toe aan een twee milliliter eiwit-low bind buis.
Voeg een milliliter blokkeringsoplossing toe aan de kralen. Meng goed door te pipetten, plaats vervolgens de buis een minuut op een magnetisch rek. Zodra het supernatant helder is, verwijder het.
Voeg vervolgens een milliliter blokkeringsoplossing toe aan de kralen. Plaats de buis op een wiebelplatform op vier graden Celsius en wiebel gedurende 10 minuten, draai vervolgens kort door de buis. Plaats de buis op het magnetisch rek en verwijder het supernatant.
Voeg 500 microliter blokkeringsoplossing toe aan de magnetische kralen. Draai kort door het antilichaam tegen Islet-1, voeg vervolgens vier microgram van het antilichaam toe aan de buis met de magnetische kralen. Plaats de buis met magnetische kralen en Islet-1-antilichaam op een wiebelplatform op vier graden Celsius en wiebel gedurende zes tot 24 uur.
Om de chromatine-immunoprecipitatie te beginnen, was de antilichaam-gecoate kralen in een milliliter blokkeringsoplossing. Plaats de buis met de antilichaam-gecoate kralen vijf minuten op een wiebelplatform op vier graden Celsius. Na kort doordraaien, plaats de buis op een magnetisch rek en verwijder het supernatant.
Resuspendeer de antilichaam-gecoate kralen in 50 microliter blokkeringsoplossing. Voeg een milliliter gesoniseerde lysaten toe aan de antilichaam-gecoate kralen en incubeer vervolgens het monster op een wiebelplatform op vier graden Celsius overnacht. Nadat het monster overnacht is ingecubeerd, verzamel het vocht uit de dop door kort door de buis te draaien en plaats de buis vervolgens op een magnetisch rek.
En na een minuut, verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet. Voer vervolgens een reeks wasbeurten uit zoals hieronder. Voeg een milliliter koude wasbuffer met CPI toe aan het monster.
Meng het monster op een wiebelplatform op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Draai kort door de monsterbuis, plaats vervolgens op een magnetisch rek. Na een minuut, verwijder het supernatant met een pipet.
Voor de eerste enzymatische reactie en reparatie en DA-staartvorming, voeg 38 microliter autoclaved dubbel gedistilleerd water toe aan het monster, voeg vervolgens end prep reactiemix en end prep enzymmix toe. Meng de inhoud van de buis door te pipetten en incubeer het monster gedurende 30 minuten op 20 graden Celsius. Was vervolgens de monsterkralen met hoge zout wasbuffer, lithiumchloride wasbuffer en 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer zoals eerder beschreven.
Voer de indexadapter ligatie uit door 27 microliter koude 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer toe te voegen aan het monster. Voeg vervolgens indexadapter, ligatie versterker en ligase master mix toe. Incubeer het monster gedurende 15 minuten op 20 graden Celsius.
Was opnieuw de monsterkralen met hoge zout wasbuffer, lithiumchloride wasbuffer en 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer. Voeg vervolgens 47 microliter koude 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer toe aan het monster. Om de snede in het DNA te repareren die het gevolg is van de ontbrekende fosfodiësterbinding, voeg 11,1 microliter van de vulmix toe aan het monster.
Incubeer het monster gedurende 20 minuten op 30 graden Celsius. Na een reeks wasbeurten, voeg 50 microliter koude autoclaved dubbel gedistilleerd water toe aan het monster. Om de ChIP DNA in de vijf prime naar drie prime richting te verteren, voeg lambda exonuclease buffer en lambda exonuclease toe en meng het monster door te pipetten.
Incubeer het monster gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Nadat de vertering voltooid is, herhaal de drie wasbeurten nog een laatste keer. Om ChIP-monster uit de kralen te elueren, resuspendeer het monster in 75 microliter ChIP elutiebuffer en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende 15 minuten bij 130 keer G.Voeg 2,5 microliter van 20 milligram per milliliter proteinase K toe aan het monster.
Vortex het monster kort en incubeer overnacht op 65 graden Celsius. Draai kort door het monster en plaats op een magnetisch rek. Na een minuut, breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis.
Zuiver en elueer het DNA. Na zuivering van het elueerde DNA, breng 16 microliter van het geëxtraheerde DNA-monster over naar een PCR-buis. Voeg 1,2 microliter denaturerende en primer anneering mix toe aan het monster.
Gebruik het programma dat in tabel zes van het manuscript beschreven staat om primers te denatureren en te anneeren aan het sjabloon-DNA. Voeg drie microliter primer extensie mix toe aan het monster en voer het PCR-programma uit dat in tabel zeven van het manuscript beschreven staat. Voeg 4,1 microliter DA staartmix toe aan het monster en voer het monster uit met behulp van het PCR-programma in tabel acht van het manuscript.
Voeg vervolgens 21,5 microliter universele adapter ligatie mix toe aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten op 20 graden Celsius. Voeg 29 microliter LM-PCR mix toe aan het monster en voer het monster uit met behulp van het programma uit tabel 10 van het manuscript. Na 18 cycli van LM-PCR, werden ChIP-exo monsters van muis motor neuronen geëlektroforeerd op een 1,5% agarose gel.
De resultaten voor ChIP-exo Islet-1 vertoonden versterkte DNA bibliotheken rond 200 tot 400 base pairs, wat aangeeft dat de ChIP-exo bibliotheken met succes werden versterkt door LM-PCR. De band rond 100 base pairs vertegenwoordigt artefacten van adapters en PCR primers. De controle zonder antilichaam toont aan dat niet-specifiek achtergrond-DNA werd verteerd door de lambda exonuclease behandeling.
Met behulp van ChIP-exo en ChIP-seq, werden Islet-1 gebonden locaties geïdentificeerd. Het ChIP-exo signaal was sterk gericht op Islet-1 bindingsplaatsen en detecteerde meerdere geclusterde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een genomische mappingsmethode die de resolutie van eiwit-DNA-interacties in zoogdierneuronen verbetert. Door gebruik te maken van chromatin-immunoprecipiteerd DNA behandeld met exonuclease-digestie gevolgd door high-throughput sequencing, bereikt de methode een mappingresolutie die bijna op basepaar-niveau ligt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genomica
- Genregulatie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwit-DNA-interacties is cruciaal voor genregulatie.
- Conventionele methoden hebben beperkingen wat betreft de resolutie van de mapping.
- ChIP-exo biedt verbeterde detectiemogelijkheden.
- Deze methode is bijzonder nuttig bij het bestuderen van zoogdierneuronen.
Doel van de studie
- Om de resolutie van het in kaart brengen van eiwit-DNA-interacties te verbeteren.
- Om een betrouwbare methode voor genomische mapping te bieden.
- Om het begrip van genregulatiemechanismen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door exonuclease-digestie.
- High-throughput sequencing voor data-acquisitie.
- Preparatie van proteïne G magnetische beads voor ChIP.
- Meng- en blokkeringsoplossingen voor optimale binding.
Belangrijkste resultaten
- Een resolutie van bijna één basepaar bij de mapping is bereikt.
- Een hoge signaal-ruisverhouding in de resultaten is aangetoond.
- De methode is gevalideerd in neuronale contexten van zoogdieren.
- Er zijn inzichten verkregen in proteïne-DNA-interacties.
Conclusies
- De ChIP-exo-methode verbetert de resolutie van de mapping aanzienlijk.
- Deze techniek is nuttig voor het bestuderen van genregulatie.
- Toekomstige toepassingen kunnen ons begrip van neuronale functies verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Hoge-resolutie mapping van eiwit-DNA-interacties maakt precieze target-validatie mogelijk in de vroege ontdekkingsfase door transcriptiefactor-bindingsplaatsen met een nauwkeurigheid van bijna één basepaar te verduidelijken. Dit vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar genregulatie en ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-candidates voor neurologische ziektemodellen. De methode verbetert het beperken van risico's bij therapeutische hypothesen door specifieke van niet-specifieke genomische signalen te onderscheiden.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar transcriptionele regulatiemechanismen in ziekterelateerde neuronale systemen.
- Operationele waarde: Biedt hooggevoelige detectie van eiwit-DNA-binding met verminderde achtergrondruis.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets door het in kaart brengen van geclusterde bindingspatronen van transcriptiefactoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve bindingsprofielen met een hoge resolutie voor standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Produceert reproduceerbare DNA-bibliotheken die geschikt zijn voor downstream sequencing-workflows.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor meerdere transcriptiefactoren in neuronale modellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt bindingsgegevens uit de ontdekkingsfase aan ziekte-relevante genregulatie in neuronen afgeleid van stamcellen.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van doelwitidentificatie naar preklinische validatie via consistente genomische read-outs.
- Risicobeperking: Ondersteunt het verminderen van risico's bij mechanistische modellen door fout-positieve bindingssignalen te elimineren.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, door nauwkeurige genomische bindingsgegevens te leveren die de selectie en prioritering van targets ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door middel van hoge-resolutie mapping van de bezetting van transcriptiefactoren.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde, met exonuclease verteerde DNA-bibliotheken met uniforme fragmentgroottes.
- Analytics: Levert kwantitatieve bindingssignalen die vergelijking van eiwit-DNA-interacties over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit door het valideren van bindingsplaatsen in ziekte-relevante neuronale systemen.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare genomische mapping-capaciteit voor meerdere targets in neurowetenschappelijke ontdekkingsprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie door mapping-resolutie op bijna basepaar-niveau.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde exonuclease-digestie en library-preparatie.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van fout-positieven bij de identificatie van bindingsplaatsen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van genomische bindingsgegevens met een hoge betrouwbaarheid.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in chromatine-immunoprecipitatie en enzymatische DNA-verwerking.
- Afhankelijk van toegang tot magnetische bead-handling, exonuclease-enzymen en high-throughput sequencing.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor antilichaamvalidatie en wasstrengheid.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten optimalisatie voor verschillende transcriptiefactoren en neuronale subtypen.
- Praktische beperkingen omvatten de kwaliteit van het input-DNA en de specificiteit van antilichamen, wat de signaalhelderheid beïnvloedt.
