Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)
14 augustus 2020
Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.
Het grootste voordeel van onze ChIP-exo-methode is de verbeterde mappingresolutie van eiwit-DNA-interacties in de cel in vergelijking met de conventionele chromatine-immunoprecipitatiemethode. Om de magnetische kralen van eiwit G voor ChIP voor te bereiden, meng de magnetische kralen tot ze homogeen zijn. Voeg vervolgens 25 microliter van de magnetische kralen toe aan een twee milliliter eiwit-low bind buis.
Voeg een milliliter blokkeringsoplossing toe aan de kralen. Meng goed door te pipetten, plaats vervolgens de buis een minuut op een magnetisch rek. Zodra het supernatant helder is, verwijder het.
Voeg vervolgens een milliliter blokkeringsoplossing toe aan de kralen. Plaats de buis op een wiebelplatform op vier graden Celsius en wiebel gedurende 10 minuten, draai vervolgens kort door de buis. Plaats de buis op het magnetisch rek en verwijder het supernatant.
Voeg 500 microliter blokkeringsoplossing toe aan de magnetische kralen. Draai kort door het antilichaam tegen Islet-1, voeg vervolgens vier microgram van het antilichaam toe aan de buis met de magnetische kralen. Plaats de buis met magnetische kralen en Islet-1-antilichaam op een wiebelplatform op vier graden Celsius en wiebel gedurende zes tot 24 uur.
Om de chromatine-immunoprecipitatie te beginnen, was de antilichaam-gecoate kralen in een milliliter blokkeringsoplossing. Plaats de buis met de antilichaam-gecoate kralen vijf minuten op een wiebelplatform op vier graden Celsius. Na kort doordraaien, plaats de buis op een magnetisch rek en verwijder het supernatant.
Resuspendeer de antilichaam-gecoate kralen in 50 microliter blokkeringsoplossing. Voeg een milliliter gesoniseerde lysaten toe aan de antilichaam-gecoate kralen en incubeer vervolgens het monster op een wiebelplatform op vier graden Celsius overnacht. Nadat het monster overnacht is ingecubeerd, verzamel het vocht uit de dop door kort door de buis te draaien en plaats de buis vervolgens op een magnetisch rek.
En na een minuut, verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet. Voer vervolgens een reeks wasbeurten uit zoals hieronder. Voeg een milliliter koude wasbuffer met CPI toe aan het monster.
Meng het monster op een wiebelplatform op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Draai kort door de monsterbuis, plaats vervolgens op een magnetisch rek. Na een minuut, verwijder het supernatant met een pipet.
Voor de eerste enzymatische reactie en reparatie en DA-staartvorming, voeg 38 microliter autoclaved dubbel gedistilleerd water toe aan het monster, voeg vervolgens end prep reactiemix en end prep enzymmix toe. Meng de inhoud van de buis door te pipetten en incubeer het monster gedurende 30 minuten op 20 graden Celsius. Was vervolgens de monsterkralen met hoge zout wasbuffer, lithiumchloride wasbuffer en 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer zoals eerder beschreven.
Voer de indexadapter ligatie uit door 27 microliter koude 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer toe te voegen aan het monster. Voeg vervolgens indexadapter, ligatie versterker en ligase master mix toe. Incubeer het monster gedurende 15 minuten op 20 graden Celsius.
Was opnieuw de monsterkralen met hoge zout wasbuffer, lithiumchloride wasbuffer en 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer. Voeg vervolgens 47 microliter koude 10 millimolar Tris waterstofchloride buffer toe aan het monster. Om de snede in het DNA te repareren die het gevolg is van de ontbrekende fosfodiësterbinding, voeg 11,1 microliter van de vulmix toe aan het monster.
Incubeer het monster gedurende 20 minuten op 30 graden Celsius. Na een reeks wasbeurten, voeg 50 microliter koude autoclaved dubbel gedistilleerd water toe aan het monster. Om de ChIP DNA in de vijf prime naar drie prime richting te verteren, voeg lambda exonuclease buffer en lambda exonuclease toe en meng het monster door te pipetten.
Incubeer het monster gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Nadat de vertering voltooid is, herhaal de drie wasbeurten nog een laatste keer. Om ChIP-monster uit de kralen te elueren, resuspendeer het monster in 75 microliter ChIP elutiebuffer en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende 15 minuten bij 130 keer G.Voeg 2,5 microliter van 20 milligram per milliliter proteinase K toe aan het monster.
Vortex het monster kort en incubeer overnacht op 65 graden Celsius. Draai kort door het monster en plaats op een magnetisch rek. Na een minuut, breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis.
Zuiver en elueer het DNA. Na zuivering van het elueerde DNA, breng 16 microliter van het geëxtraheerde DNA-monster over naar een PCR-buis. Voeg 1,2 microliter denaturerende en primer anneering mix toe aan het monster.
Gebruik het programma dat in tabel zes van het manuscript beschreven staat om primers te denatureren en te anneeren aan het sjabloon-DNA. Voeg drie microliter primer extensie mix toe aan het monster en voer het PCR-programma uit dat in tabel zeven van het manuscript beschreven staat. Voeg 4,1 microliter DA staartmix toe aan het monster en voer het monster uit met behulp van het PCR-programma in tabel acht van het manuscript.
Voeg vervolgens 21,5 microliter universele adapter ligatie mix toe aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten op 20 graden Celsius. Voeg 29 microliter LM-PCR mix toe aan het monster en voer het monster uit met behulp van het programma uit tabel 10 van het manuscript. Na 18 cycli van LM-PCR, werden ChIP-exo monsters van muis motor neuronen geëlektroforeerd op een 1,5% agarose gel.
De resultaten voor ChIP-exo Islet-1 vertoonden versterkte DNA bibliotheken rond 200 tot 400 base pairs, wat aangeeft dat de ChIP-exo bibliotheken met succes werden versterkt door LM-PCR. De band rond 100 base pairs vertegenwoordigt artefacten van adapters en PCR primers. De controle zonder antilichaam toont aan dat niet-specifiek achtergrond-DNA werd verteerd door de lambda exonuclease behandeling.
Met behulp van ChIP-exo en ChIP-seq, werden Islet-1 gebonden locaties geïdentificeerd. Het ChIP-exo signaal was sterk gericht op Islet-1 bindingsplaatsen en detecteerde meerdere geclusterde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een genomische mappingmethode die de resolutie van eiwit-DNA-interacties in neuronale cellen van zoogdieren verbetert. Door gebruik te maken van chromatine-immunoprecipiteerd DNA dat is behandeld met exonuclease-digestie gevolgd door high-throughput sequencing, bereikt de methode een resolutie van bijna base-paar mapping.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomiek
- Genregulatie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwit-DNA-interacties is cruciaal voor genregulatie.
- Conventionele methoden hebben beperkingen in mappingresolutie.
- ChIP-exo biedt verbeterde detectiemogelijkheden.
- Deze methode is bijzonder nuttig bij het bestuderen van neuronale cellen van zoogdieren.
Doel van de studie
- Om de resolutie van mapping van eiwit-DNA-interacties te verbeteren.
- Om een betrouwbare methode voor genomische mapping te bieden.
- Om het begrip van genregulatiemechanismen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door exonuclease-digestie.
- High-throughput sequencing voor dataverwerving.
- Bereiding van eiwit G magnetische kralen voor ChIP.
- Meng- en blokkeeroplossingen voor optimale binding.
Belangrijkste resultaten
- Bereikt bijna base-paar resolutie in mapping.
- Gedemonstreerd hoge signaal-ruisverhouding in resultaten.
- De methode is gevalideerd in neuronale contexten van zoogdieren.
- Biedt inzichten in eiwit-DNA-interacties.
Conclusies
- De ChIP-exo methode verbetert de mappingresolutie aanzienlijk.
- Deze techniek is gunstig voor het bestuderen van genregulatie.
- Toekomstige toepassingen kunnen ons begrip van neuronale functies verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of protein-DNA interactions enables precise target validation in early discovery by clarifying transcription factor binding sites with near base-pair accuracy. This reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies and supports predictive confidence in lead identification for neurological disease models. The method enhances de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing specific from non-specific genomic signals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory mechanisms in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of protein-DNA binding with reduced background noise.
- Predictive Value: Supports functional target validation by mapping clustered transcription factor binding patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution binding profiles for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible DNA libraries suitable for downstream sequencing workflows.
- Scalability Value: Enables platform reuse across multiple transcription factors in neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage binding data to disease-relevant gene regulation in stem cell-derived neurons.
- Operational Value: Ensures continuity from target identification to preclinical validation via consistent genomic readouts.
- Risk Mitigation: Supports de-risking of mechanistic models by eliminating false-positive binding signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by delivering precise genomic binding data that informs target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution mapping of transcription factor occupancy.
- Screening: Enables assay readiness via standardized, exonuclease-digested DNA libraries with uniform fragment sizes.
- Analytics: Delivers quantitative binding signals that allow comparison of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating binding sites in disease-relevant neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genomic mapping capability for multiple targets in neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through near base-pair mapping resolution.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled exonuclease digestion and library preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in binding site identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on high-confidence genomic binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation and enzymatic DNA processing.
- Dependent on access to magnetic bead handling, exonuclease enzymes, and high-throughput sequencing.
- Needs cross-team standardization for antibody validation and wash stringency.
- Adaptation considerations include optimization for different transcription factors and neuronal subtypes.
- Practical limitations include input DNA quality and antibody specificity affecting signal clarity.
