Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van endocardiale cel- en coronaire endotheelcellen afzonderlijk van het hart om mensen te helpen de celtypespecifieke genexpressie en -functie te begrijpen. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van de geïsoleerde EEG- en LIC's en dat de cellen hun fysiologische eigenschappen behouden bij isolatie. CEC's en EDC's verschillen in vele aspecten, dus de mogelijkheid om deze celpopulaties onafhankelijk te onderzoeken, maakt het mogelijk om celtypespecifieke mechanismen in verschillende hartziekten te onderzoeken.

Deze methode zou de studie van transcriptonomische en epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor tal van hartziekten op een cel type-specifieke manier te vergemakkelijken. De lastigste delen van deze methode zijn het bepalen van de verschillende hartgedeelten en het correct timen van de spijsvertering om besmetting van het celtype te voorkomen. Het aantonen van de procedure zal Yifei Miao zijn, een onderzoeker van mijn lab.

Na het oogsten van harten van zes 50 tot 100 gram Sprague Dawley ratten, was de organen met 50 milliliter koude HBSS drie keer om overtollig bloed te verwijderen en plaats een hart onder een ontleden microscoop. Plaats het hart op zijn vlakkere achterste gezicht om de linker- en rechterkant van het weefsel te identificeren en de longslagader te lokaliseren. Gebruik een schaar om door de longslagader naar de rechter ventriculaire kamer te snijden en langs het septum te snijden totdat de top is bereikt.

Blijf snijden vanaf de top tot aan de achterste kant van het hart langs het septum tot de kruising van de longslagader en de rechter ventriculaire kamer is bereikt. Vanaf dit punt, snijd zowel de voorste en achterste zijden van het hart loodrecht op de vorige dissectie punt en uit de buurt van het septum tot de rechter ventriculaire vrije muur is bevrijd van de rest van het hart. Plaats vervolgens de rechter ventriculaire vrije muur in een vijf milliliter buis van DMEM en zoek de aorta opnieuw om het verzamelen van de linker ventriculaire vrije muur te vergemakkelijken op dezelfde manier als zojuist aangetoond.

Wanneer alle ventriculaire vrije wanden zijn verzameld, breng de weefselmonsters in een 60 centimeter cultuur schotel met hun innerlijke oppervlakken liggend gezicht naar beneden in de schotel. Met behulp van een een milliliter pipet tip, voeg 0,5 tot een milliliter van de spijsvertering buffer aan de schotel direct onder de weefselstukken totdat alleen de binnenste oppervlakken van de weefsels worden ondergedompeld. Om ongewenste celverontreiniging te voorkomen, is het belangrijk dat alleen het binnenoppervlak van de ventrikel wordt ondergedompeld in de spijsverteringsbuffer en precies vijf minuten wordt verteerd.

Na vijf minuten in de celcultuur incubator, stop de spijsvertering met vijf keer het volume van endotheelcel medium. Gebruik vervolgens een 1 milliliter pipet om het binnenoppervlak van elke ventrikel door te spoelen met vers medium dat de runoff door een 40 micrometer zeef in een 50 milliliter verzamelingsbuis op ijs overdraagt. Voor coronaire endotheelcelvertering, gesneden langs het buitenoppervlak van de linker ventrikel zonder verontreiniging van de binnenste laag en plaats elk buisfragment in een aparte vijf milliliter buis met een milliliter spijsverteringsbuffer.

Om besmetting door EECs te voorkomen, is het belangrijk om alleen te snijden van het buitenoppervlak van de ventrikel. Met behulp van dissectie schaar, gehakt van de ventriculaire muur in kleine een kubieke millimeter stukken en plaats de buizen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 tot 20 minuten met vortexing om de twee tot drie minuten. Wanneer de gehakte stukken zijn klein, maar zichtbaar, voeg vier milliliter van endotheelcel medium aan de buis en gebruik een vijf milliliter serologische pipet om het hele volume van de oplossing over te brengen door middel van een 40 micrometer zeef in een 50 milliliter collectie buis op ijs.

Om de CD31 positieve celpopulaties na hun spijsvertering te isoleren, pellet de cellen door centrifugatie en het aanzuigen van de supernatants. Als er pellets rood zijn, resuspend de cellen in een tot twee milliliter rode bloedcel lyse buffer per buis voor een vijf minuten incubatie in een 37 graden Celsius waterbad. Aan het einde van de incubatie, stop de lysis met 10 milliliter PBS en verzamel de cellen met een tweede centrifugatie.

Voeg vervolgens 90 microliter sorteerbuffer en 10 microliter anti-CD31 PE-antilichaam toe aan elke buis van cellen. Na het vortexen, incubeer de cellen gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie 10 milliliter sorteerbuffer toe aan de buizen met grondig mengen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie.

Resuspend de pellets in 80 microliter van het sorteren buffer per buis, gevolgd door de toevoeging van 20 microliters van anti-PE microbeads. Na het vortexen, plaats de buizen op vier graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door het wassen in 10 milliliter van sorteren buffer door centrifugatie zoals net aangetoond. Resuspend de pellets in 500 microliters van het sorteren buffer op ijs en plaats een kolom met super paramagnetische bollen in een magnetische separator.

Spoel de kolom af met drie milliliter sorteerbuffer. Wanneer de kolom is geleegd, voeg 500 microliter van de endocardiale endokoepleiale cel suspensie aan de kolom, gevolgd door vier wasbeurten met drie milliliters sorteerbuffer per wasbeurt. Breng na de laatste wasbeurt de kolom over in een nieuwe 15 milliliter opvangbuis en gebruik de kolomzuiger en vijf milliliter vers endotheelcelmedium om de cd31-positieve cellen uit de kolom in de opvangbuis te spoelen.

Verzamel vervolgens de bead geïsoleerde endotheelcellen door centrifugatie. Zoals voorspeld, kwantitatieve PCR blijkt dat ten opzichte van beta actin, endocardial endokoepleiale cellen uitgedrukt hogere niveaus van de endocardial markers Npr3, Hapln1, en Cdn11 in vergelijking met coronaire endotheelcellen. Ook coronaire endotheelcellen uitgedrukt hogere niveaus van de coronaire markers Fabp4, Mgll, en Cd36 in vergelijking met endocardial endotische endotheelcellen.

Bovendien, beide soorten cellen uitgedrukt de pan-endotheelcel marker gen Cdh5 met iets hogere niveaus waargenomen in coronaire endotheelcellen. We kunnen de cellen verder zuiveren met FACS en antilichamen die specifiek zijn voor de celpopulaties. We kunnen bijvoorbeeld anti-Npr3 gebruiken om EECs en anti-Cd36 te sorteren om LMOE's te sorteren.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers om de rol van EEG- en LMOE's in hartontwikkeling en -ziekte op een celtypespecifieke manier te onderzoeken.