Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse

Methoden voor verschillende deeltjeskwantificering vertegenwoordigen een kritisch aspect van de meeste biologiestudies. Dit protocol maakt een nauwkeurige kwantificering van de virale gegevens in realtime mogelijk. Deze techniek vervangt de traditionele meting van virale gegevens.

Door objectieve realtime gegevens zitten we onder ons betrouwbaarheidsinterval, waardoor arbeidsintensieve eindpunten worden vermeden. Deze methode kan worden gebruikt voor alle virussen die een cytopathisch effect induceren. De procedure wordt gedemonstreerd door Quentin Grassin, een laborant van ons laboratorium.

Om H1N1-virussen te verspreiden en te versterken, zaait u 7,5 keer 10 tot de 6 MDCK-cellen op twee weefselkweekkolven van 75 vierkante centimeter volgens standaardprotocollen en incubeert u de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius om 90 tot 100% confluentie te bereiken. Was de volgende dag de cellen twee keer met vijf milliliter steriel PBS per kolf per wasbeurt en label één kolf als controlemiddel. Verdun vervolgens een ontdooide injectieflacon met influenza A-virusvoorraad tot de juiste experimentele concentratie in een buis van 1,5 milliliter met vers viruspropagatiemedium.

Gebruik één milliliter van de verdunde bouillon om de MDCK-cellen te infecteren bij een veelheid van infectie van 1 maal 10 tot de negatieve 3, of 1 maal 10 tot de negatieve 4 plaquevormende eenheden per cel, en voeg één milliliter virusvoortplantingsmedium toe aan de controlekolf. Adsorbeer het virus gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur aan de cellen, met elke 15 minuten roeren. Verwijder aan het einde van de incubatie het entmateriaal en vervang het door 15 milliliter virusvermeerderingsmedium aangevuld met één microgram per milliliter TPCK-trypsine om de splitsing van virale hemagglutinine HA0 in HA1- en HA2-subeenheden te vergemakkelijken.

Plaats de kolf vervolgens drie dagen in de couveuse van 35 graden Celsius. Vergelijk aan het einde van de incubatie de cellen in elke cultuur onder een 40x objectief op een lichtmicroscoop om de cytopathische effecten op de cellen te beoordelen. Wanneer het cytopathische effect is voltooid, voegt u de celkweeksupernatanten toe aan een buis van 15 millimeter en verzamelt u het cellulaire puin van elke cultuur door centrifugatie.

Breng vervolgens het geklaarde viruscultuursupernatant over naar een buis van 15 milliliter en aliquot de nageslachtsvirussen naar steriele cryogene injectieflacons voor eenmalig gebruik voor opslag van min 80 graden Celsius. Om de juiste celhoeveelheid voor celinfectie te bepalen, bereidt u 24 uur per dag ongeveer 80% confluente MDCK-celculturen zoals aangetoond voordat de cellen met PBS worden gewassen en geoogst met een incubatie van 45 minuten in drie milliliters van 0,25% Trypsine-EDTA per kolf bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met zeven milliliter vers kweekmedium per kolf en tel de cellen van elke cultuur.

Verdun de cellen tot 4 maal 10 tot de 5e cellen per milliliter celkweekmedium en voer tweevoudige seriële verdunningen van de cellen uit zoals aangegeven. Plaats een E-plaat enkele minuten op kamertemperatuur voordat u 100 microliter celkweekmedium aan elke put toevoegt zonder de elektroden van de E-plaat aan te raken. Ontgrendel de houders en steek de voorkant van de plaat in het houdervak van het impedantiemeetinstrument.

Sluit de deur van de incubator en open de software. Markeer in de standaardinstelling voor experimentpatroon de geselecteerde houder en dubbelklik op de bovenste pagina om de naam van het experiment in te voeren. Klik op Lay-out en voer de benodigde voorbeeldinformatie in voor elke geselecteerde put van de plaat.

Klik op Plannen, stappen en Een stap toevoegen. De software voegt automatisch een stap van één seconde toe om de achtergrondimpedantie te meten Klik op Uitvoeren en Starten, Doorgaan. Klik op Plotten en toevoegen om de juiste putjes te selecteren en bevestig dat de achtergrondimpedantie tussen negatief 0,1 en 0,1 ligt voordat u doorgaat naar de volgende stap.

Verwijder vervolgens de plaat uit de houder en voeg 100 microliter van elke celsuspensie in tweevoud toe aan de juiste putjes. Laat de E-plaat 30 minuten bij kamertemperatuur in de laminaire stroomkap om een gelijkmatige verdeling van de cellen over de bodem van de putten mogelijk te maken voordat de E-plaat in de houderzak wordt geladen. Klik op Stap plannen en toevoegen en voer waarden in om de cellen elke 30 minuten op 200 herhalingen te controleren voordat u Start, Doorgaan selecteert.

Als u de celimpedantiegegevens wilt controleren en plotten, klikt u op Plot en selecteert u de concentratie cellen die net voor de stationaire fase 24 uur na het zaaien is om cellen te verkrijgen die zich nog in een groeifase bevinden tijdens de virale infectie. Om de correlatie tussen de CIT50-waarden en de veelheid van infectie te bepalen, na het kweken van 3 keer 10 tot de 4e vers gesplitste MDCK-cellen in elke put van de elektronische microtiterplaat gedurende 24 uur, wast u de cellen twee keer met 100 microliter vers virusvoortplantingsmedium per put, per wasbeurt en gebruikt u een pipet met één kanaal om 100 microliter virale suspensie aan elke put toe te voegen. Wanneer alle virusverdunningen zijn toegevoegd, laadt u de plaat voorzichtig in de wiegzak van het instrument bij 35 graden Celsius en begint u de celimpedantie elke 15 minuten gedurende ten minste 100 uur te controleren, zoals aangetoond.

Klik na twee meetcycli om het apparaat te pauzeren en verwijder de E-plaat uit de houder. Voeg 100 microliter viruspropagatiemedium aangevuld met TPCK-trypsine toe aan elke put en breng de E-plaat terug in de wiegzak. Start vervolgens de analyse.

Om de overlevingskinetiek van het influenza A-virus te beoordelen, voegt u natriumchloride toe aan een eindconcentratie van 35 gram per liter in gedestilleerd water en voegt u 900 microliter van de resulterende zoutoplossing toe aan cryobuizen van twee milliliter. Voeg 100 microliter virale bouillon toe aan elke cryobuis en plaats de buizen in de incubator van 35 graden Celsius voor de juiste experimentele periode. De dag voor het einde van de incubatie, zaad 3 keer 10 tot de 4e vers gesplitste MDCK-cellen en 100 microliter viruspropagatiemedium per put in een 16-well microtiterplaat in herhaalde stappen, waardoor de achtergrondimpedantie en uniforme verdeling van de cellen op de bodem van de putten kunnen worden gemeten.

Vervolgens groeien de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Was de volgende dag de cellen twee keer, infecteer vervolgens de cellen met 100 microliter van het zoutoplossing gedestilleerde virus dat 10 keer is verdund in vers kweekmedium, zoals aangetoond, en controleer de celimpedantie elke 15 minuten gedurende ten minste 100 uur. Hier worden ruwe gegevens getoond die na 120 uur zijn verkregen met verschillende concentraties MDCK-cellen.

Na 24 uur onthulden celindexmetingen dat cellen in putten gezaaid met 3 keer 10 tot de 4e cellen zich nog steeds in de exponentiële groeifase bevonden, daarom werd deze celconcentratie gebruikt voor latere experimenten. MDCK-celculturen tonen een duidelijke lineaire relatie tussen de CIT50 en de initiële veelheid van infectie door influenzavirus. De resultaten van een typisch overlevingskinetisch experiment tonen een afname van de celindex als gevolg van virusgeïnduceerd cytopathisch effect.

De CIT50 kan worden gebruikt om de virale inactivatiehelling voor elk virus in elke toestand te berekenen voor de bepaling van welk virus de grootste stabiliteit had in de bestudeerde omgeving. De stabiliteit van het virus correleert indirect met de inactivatiehelling, waardoor bijvoorbeeld aminozuurresiduen in het hemagglutinineglycoproteïne die betrokken zijn bij de overleving van het influenza A-virus buiten de gastheer kunnen worden geïdentificeerd. Deze techniek is erg gevoelig voor kleine variaties.

Daarom wordt het gebruik van een automatische celteller aangemoedigd om reproduceerbare resultaten tussen experimenten te verkrijgen. Deze methode kan ook worden gebruikt om de replicatie van verschillende virussen te vergelijken, om het virustropisme voor meerdere cellijnen tegelijk te onderzoeken of om specifieke stappen van de viruscyclus te bestuderen.