Worm-align en Worm_CP, Twee Open-Source Pipelines voor straightening en kwantificering van fluorescentie beeldgegevens verkregen van Caenorhabditis elegans

We beschrijven hier een eenvoudige opensource Fiji-gebaseerde workflow genaamd Worm-align, die kan worden gebruikt om single of multi-channel montages van rechtgetrokken wormen van belang van ruwe microscopie beelden te genereren. Omdat deze workflow afhankelijk is van door de gebruiker geselecteerde dieren van belang, kan het vooral handig zijn bij het analyseren van afbeeldingen van C.elegans waar de wormen zich niet allemaal in de juiste fase of conditie bevinden. Opgemerkt moet worden dat de output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering van fluorescentie met Fiji of andere beeldanalyse software.

Hier tonen we fluorescentie kwantificering met behulp van de CellProfiler pijpleiding Worm_CP. Begin met het creëren van een mondmicropipet door het uitbreiden van een dunne glazen capillair in de vlam van een Bunsen brander. Na uitbreiding in de vlam, breek de capillaire in twee stukken als het niet breken in twee stukken na verlenging.

Als het brak in twee stukken, snijd het einde van de langste. Selecteer het langere stuk en test of de capillaire open is door te proberen water aan tezuigen. Maak de adapter los van een siliconen buis van drie millimeter.

Sluit de glazen capillair aan op een capillaire adapter gekoppeld aan een siliconen buis van zes millimeter. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de zes millimeter buis aan in een 0,2 micrometerfilter en een drie millimeter siliconen buis aan de andere kant. Sluit een filterpunt van één millimeter aan op het vrije uiteinde van de drie millimeter siliconen buis om vloeistof aan te trekken.

Verwijder onder een dissectiemicroscoop zoveel mogelijk vloeistof rond een pellet van vaste wormen met de mondmicropipet. Voeg snel 10 microliter montagemedium toe aan de onderkant van de buis. Spoel een 10 microliter tip in PBS met sporen van wasmiddel om te voorkomen dat wormen aan de zijkanten van de plastic pipetpunt blijven plakken.

Snijd vervolgens het uiteinde van de punt met een schaar. Breng acht microliter van montagemedium met de wormen op een eerder voorbereide agarosepad. Tijdens het observeren van de dia onder de microscoop, zachtjes roeren om overlap van de wormen te voorkomen.

Bedek vervolgens de druppel montagemedium op het agarosepad met een 18 bij 18 millimeter coverslip. Om levende wormen te monteren, pipet drie tot vier microliters van drie millimolar levamisole opgelost in M9 op een agarose pad. Kies 30 tot 50 wormen per aandoening in de druppel levamisole.

Bedek vervolgens de daling met een omslag van 18 bij 18 millimeter en beeld de wormen binnen een uur. Installeer het open source image analysis software pakket Fiji van ImageJ, of als het al is geïnstalleerd op de computer, controleren of het versie 1.52A of hoger, download dan de Worm-align repository van GitHub en sla het op de computer. Zodra alle pijplijnonderdelen zijn gedownload en geïnstalleerd, opent u Fiji en voert u de wormuitlijnende macro uit door op plug-ins, macro's en uitgevoerd in de hoofdmenubalk uit te voeren.

Zoek de Worm-align. ijm script en klik open. Navigeer naar de invoermap met de te analyseren afbeeldingen en klik op selecteren, om ervoor te zorgen dat de geselecteerde map alleen afbeeldingsbestanden bevat.

De macro genereert automatisch een uitvoermap waarin alle resultaten worden opgeslagen. De naam van de map is hetzelfde als de invoermap met uitvoer als een post-fix. Laat de macro de eerste afbeelding in de invoermap openen en deze gebruiken als een representatieve afbeelding om de instellingen te extraheren die nodig zijn om de montage te genereren, inclusief de breedte van de wormen, de helderheid en het contrast.

Teken met de rechte lijn tekent u een lijn over de breedte van een worm en klikt op OK. Gebruik de lengte van deze lijn om de hoogte van de bijgesneden gebieden voor enkele wormen te bepalen. Geef voor elk kanaal de naam, opzoektabel op en of deze in de montage moet worden opgenomen en klik op OK. Pas vervolgens de instellingen voor helderheid en contrast voor de kanalen aan met behulp van de schuifregelaars. Herhaal dit proces voor de overige kanalen.

Zodra alle instellingen zijn geconfigureerd, worden ze opgenomen in een instellingentabel en opgeslagen in de CellProfiler-submap van de uitvoermap. Er wordt een afbeelding gegenereerd om te laten zien hoe alle afbeeldingen eruit zien na toepassing van de instellingen. Als de afbeelding bevredigend is, vinkt u het bovenste vakje aan.

Het tweede en derde vakje van het vinkje alle instellingen paneel geven de opties voor montage generatie. Laat beide vakjes aangevinkt en klik op OK om de rest van de macro uit te voeren. Als u het bovenste vakje niet aanvinkt, wordt de installatie opnieuw uitgevoerd door de macro.

De macro gaat vervolgens verder met het openen van alle afbeeldingen in de invoermap. Teken voor elke afbeelding lijnen op de lengteas van alle wormen die in de montage moeten worden opgenomen met behulp van het gesegmenteerde of het freehandlijngereedschap. Teken lijnen consequent van kop naar staart of vice versa langs de volledige lengte van de wormen en voeg elke regel toe aan de ROI-manager door op Control T.Once alle gewenste wormen zijn toegevoegd, klik op OK. Worm-align genereert vervolgens bijgesneden afbeeldingen van enkele geselecteerde wormen, die worden opgeslagen in de enkele wormsubmap van de uitvoermap.

Montages van alle geselecteerde wormen worden opgeslagen in de uitgelijnde map. Download en installeer CellProfiler 2.2.0 door op de koppeling voor eerdere CellProfiler-releases op de downloadpagina te klikken en het vereiste besturingssysteem te selecteren. Voordat u de Worm_CP pijplijn start, moet u ervoor zorgen dat alle verwachte uitvoerafbeeldingen aanwezig zijn in de cellprofiler-submap van de map Worm-align output.

Een verwerkte kopie van de oorspronkelijke afbeelding, een binair afbeeldingsmasker van de wormpopulatie, uitlijnen masker als de lijn is getekend op geselecteerde wormen en een afbeelding die elk van de kanalen in de oorspronkelijke afbeelding moet aanwezig zijn. Open CellProfiler, klik vervolgens op de invoermodule voor afbeeldingen en sleep de modulemap CellProfiler naar het venster met de tekst drop files and folders hier. Als een lijst met afbeeldingen uit een vorige analyse aanwezig is, verwijdert u deze eerst door met de rechtermuisknop in het venster te klikken en de lijst met bestanden wissen te selecteren.

Klik op de module met metadata-invoer en klik op de tweede extractiemethode op de gele map en navigeer naar de cellprofiler-submap van de map Worm-align output. Selecteer het instellingenbestand en klik op bijwerken. Klik vervolgens op de invoermodule voor namen en typen en zorg ervoor dat alle afbeeldingen die nodig zijn voor de pijplijn aanwezig zijn.

Voordat u de pijplijn uitvoert, selecteert u een bestemming voor de uitvoerresultaten in de uitvoermodule. Gebruik de testmodus om te zien hoe de pijplijn presteert door op de starttestmodus te klikken en deze door de eerste afbeelding in de map te laten lopen. Wanneer u tevreden bent met de prestaties van de pijplijn, klikt u op de testmodus afsluiten en afbeeldingen analyseren.

Voordat u met de analyse begint, moet u ervoor zorgen dat alle ogen voor de analysemodule gesloten zijn. Wanneer de analyse is voltooid, opent u de Worm_CP uitvoermap die bestaat uit twee CSV-bestanden, wormen CSV en lijnen CSV. Culturing and imaging C.elegans volgens de in dit protocol beschreven methode levert grote overzichtsbeelden op van wormpopulaties.

De uitvoer van de pijplijn hangt grotendeels af van de kwaliteit van de lijnen die bovenop de afbeeldingen zijn getekend. Verschillende lijnvoorbeelden en hun output van Worm-align worden hier getoond. Bij het gebruik van de Worm-align script, visuele identificatie van kruisende wormen is mogelijk van de overlay beelden gevonden in de gegevens submap, evenals van de panelen van individuele wormen in de montage.

De QC-tabel kan ook worden gebruikt om overlappende wormen te identificeren. Kruislijnen zijn echter problematisch voor de Worm_CP-pijplijn. Dit komt omdat Worm_CP lijnmasker gebruikt, niet regio's van belang, om individuele wormen te identificeren.

Daarom segmenteert CellProfiler een van de wormen als twee objecten. De Worm_CP pijpleiding is gebruikt om fluorescentieintensiteit te kwantificeren van vaste dieren gelabeld met een fluorescerende kleurstof die is opgenomen in lipide druppels. Het lipidedruppelgehalte wordt verminderd met 17% tussen wilde type en gemuteerde DBL1 dieren met behulp van handmatige kwantificering, en met 12% met behulp van de Worm_CP pijpleiding.

Worm_CP werd ook gebruikt om de reactie van de hitteschok te kwantificeren bij levende wormen die GFP uitdrukken onder controle van een hitteshock-induceerbare gen. Bij afwezigheid van hittestress induceren de wormen geen GFP-expressie. Wanneer de wormen worden blootgesteld als een korte hitteschok, wordt de GFP-expressie geïnduceerd.

De output van Worm_CP hangt grotendeels af van de kwaliteit van de lijnen die u tekent met behulp van Worm-align. Zorg ervoor dat uw lijnen niet raken of overlappen en teken al uw lijnen in dezelfde richting. Als u de QC-tabel controleert, u lijnen identificeren die elkaar raken of overlappen, zodat u deze gevallen uitsluiten van uw analyse.

De output van Worm-align kan worden gebruikt voor latere kwantificering, hetzij in Fiji of in andere softwarepakketten voor beeldanalyse. We hebben hier een zeer eenvoudige CellProfiler-pijpleiding getoond waarin andere analysemodules heel gemakkelijk kunnen worden opgenomen, bijvoorbeeld om het aantal lipidedruppels te tellen of om de intensiteit van individuele druppels in een worm te kwantificeren. Een van het voordeel van deze techniek is een mogelijkheid om fluorescentie van individuele wormen snel te kwantificeren.

In ons lab hebben we een belang bij individuele levensvatbaarheid met behulp van fluorescentie verslaggevers en we gebruiken Worm-align en Worm_CP routinematig voor dit doel.