Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Het algemene doel van het volgende experiment in genetisch traceerbare ontwerp Caenorhabditis elegans is om weefselspecifieke chaperon-interacties te identificeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk te gebruiken assays zoals fitting Golan AI en gedragsindicatoren combineert om nieuwe weefselspecifieke interacties bloot te leggen. Voor een niet-stressvolle embryosynchronisatie, gebruik een wormpick om ongeveer 100 eieren van een niet-gesynchroniseerde wormplaat naar een nieuw geplaatste NGM-plaat te verplaatsen en de dieren te kweken volgens het juiste experimentele schema.

Wanneer de dieren de eerste dag van het leggen van eieren bereiken, voeg langzaam één milliliter M9-buffer toe aan de plaat, op afstand van de bacterie-mat, en draai de plaat zodat de buffer de plaat volledig bedekt. Kantel de plaat op één zijde om de vloeistof te verwijderen en spoel de dieren van de plaat. Wanneer alle wormen van de plaat zijn gewassen, gebruik een standaard plastic pipettentip om een stukje Agar rond de geconcentreerde eieren te snijden en plaats het stukje Agar op een nieuw geplaatste NGM-plaat.

Kweek de eieren onder dezelfde kweekcondities. Aan het einde van de incubatie, zou de plaat bedekt moeten zijn met gesynchroniseerde eieren. Nadat alle dieren van de plaat zijn gewassen zoals net gedemonstreerd, voeg één milliliter verse M9-buffer toe en gebruik een celschraper om de eieren van de plaat los te maken.

Wanneer alle eieren zijn losgemaakt, breng het volledige volume buffer van de plaat over in een conische buis voor centrifugatie. Centrifugeer de buis en gooi het supernatant weg. Na het verwijderen van het supernatant, voeg tot één milliliter verse M9-buffer toe aan de plaat en pipetteer om de eieren opnieuw te suspenderen.

Was de eieren nog vijf keer zoals net gedemonstreerd. Na de laatste wasbeurt, zou de eierpellet wit moeten lijken en kunnen alle maar de laatste 200 microliters supernatant worden verwijderd. Om gesynchroniseerde nematoden voor een experiment te kweken, plaats een druppel van ongeveer 30 eieren dicht bij de bacterie-mat en elke interferentie RNA-geplaatste plaat en ongeveer 30 eieren op een plaat geplaatst met bacteriën die lege vector bevatten.

Kweek vervolgens de dieren onder de juiste kweekcondities volgens het experimentele protocol. Om de embryonale letaliteit van de gesynchroniseerde dieren te beoordelen, wanneer de dieren beginnen eieren te leggen, draag ongeveer 100 eieren over naar een lege plaat en spreid de eieren in rijen om het tellen te vereenvoudigen. Na 24 tot 48 uur, scoor het percentage onuitgekomen eieren.

Voor vergelijking, vergelijk de experimentele dieregeneieren met de eieren van dieren die zijn behandeld met lege vector controlebacteriën. Om een verlammingstest op te zetten, kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren op lege vector controlebacteriën, totdat de dieren volwassenheid bereiken, maar voordat het leggen van eieren begint. Gebruik een fijne marker om een lijn te tekenen op de achterkant van een gewone NGM Agar-plaat, en plaats vijf tot tien dieren op de gemarkeerde lijn.

Stel een timer in voor 10 minuten en scoor het percentage dieren dat op de lijn achterblijft als verlamde wormen. Voor vergelijking, vergelijk deze gegevens met het percentage mutante dieren gekweekt op lege vector controlebacteriën. Voor Validatie van Protein Knockdown, plaats 250 tot 300 gesynchroniseerde eieren op een 60 millimeter NGM interferentie RNA-plaat geplaatst met de relevante dubbelstrengs RNA-expresserende of lege vector bevattende bacteriën, en kweek de eieren gedurende de juiste experimentele periode.

Aan het einde van de incubatie, draag een totaal van 200 jonge volwassen dieren over in de dop van een 1,5 milliliter buis bevattende 200 microliter PBST op de kweektemperatuur van de dieren. Sluit de dop voorzichtig en centrifugeer de dieren gedurende 1 minuut bij 1000 keer G. Aan het einde van de centrifugatie, voeg 800 microliter vers PBST toe aan de buis en centrifugeer de wormen opnieuw.

Verwijder voorzichtig de bovenste 900 microliters van het supernatant en was de nematoden in vers PBST nog 3 keer zoals net gedemonstreerd. Na de laatste wasbeurt, verwijder alles behalve de laatste 100 microliters van het supernatant en voeg 25 microliter 5X monsterbuffer toe aan de dieren. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 92 graden Celsius en 1000 omwentelingen per minuut, voordat u 20 microliter van elk monster op een SDS-pagegel laadt.

Voer vervolgens Western blot-analyse uit met behulp van de juiste antilichamen om de relatieve stabiliteit van het eiwit van belang te bepalen, en gebruik densitometrische software om de intensiteit van de banen te bepalen. HSP6 neergeslagen tijdens ontwikkeling resulteert in een sterke ontwikkelingsstop bij wildtype dieren. Tegelijkertijd veroorzaakt HSP6 neergeslagen in een spierspecifiek interferentie RNA-stam die wild-type RDE1 in spierweefsel tot expressie brengt, geen ontwikkelingsstop.

Terwijl HSP6 neergeslagen in een darmspecifiek RNAI-stam die wild-type RDE1 in darmcellen tot expressie brengt, resulteert in een sterke ontwikkelingsstop en fenotype. Een mutatie in HSP6 MG585 die een milde groeivertraging veroorzaakt, kan daarom worden gebruikt om chaperone-interacties te screenen door het screenen van de chaperone interferentie RNA-bibliotheek door een stam die dat gemuteerde gen bevat te kruisen in een darmspecifiek interferentie RNA-stam. Myosine-organisatie en UNC45 mutante dieren behandeld met STI1 AHSA1 of DAF41 interferentie RNA, is vergelijkbaar met dat van wildtype wormen in het vierde larvale stadium.

Hoewel de mutanten verstoorde sarcomeren vertonen na het bereiken van volwassenheid. In tegenstelling, zowel UNC45 mutante dieren behandeld met een lege vector controle als wildtype dieren blijven onaangetast. Genetische interacties zijn niet indicatief voor fysische interactie.

Dus, follow-up experimenten met behulp van genetische interactiescherm moeten worden uitgevoerd om de aard van de geïdentificeerde interacties te valideren en direct te onderzoeken.