Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Dit Hep G2-model biedt een relevant alternatief in vitro-testsysteem om de mogelijke inductie van vaste DNA-schade na langdurige blootstelling aan nanomateriaal betrouwbaarder te beoordelen, met als doel het gebruik van dierproeven te minimaliseren. Het Hep G2-sferoïdemodel heeft de mogelijkheid om 14 dagen lang levensvatbaar en functioneel te blijven, evenals een geschikt niveau van proliferatie te behouden. Dit ondersteunt de test van een reeks biochemische en genotoxiciteits-endpoints, inclusief het micronucleus-assay.

Voordat u dit protocol probeert, raad ik u aan eerst een paar oefenrondes te doen. Wees voorzichtig bij het zaaien van cellen of het verversen van media, omdat dit een delicate aanpak vereist. Begin met het toevoegen van 100 microliter steriele PBS op kamertemperatuur in de putjes van een 96-well cultuurplaat.

Keer de deksel van de plaat om en pipet gedurende 20 microliter druppels van de celsuspensie voorzichtig in het midden van elke putgroef van het deksel. Gebruik een multikanaals pipet en voeg twee tot vier druppels tegelijk toe om de nauwkeurige plaatsing te garanderen. Zaai slechts vier steroïden tegelijk en zorg ervoor dat de pipettips allemaal uitgelijnd zijn voordat u begint.

De hoek waaronder u de multikanaals houdt, maakt een verschil in de manier waarop de sferoïds worden gevormd. Zorg ervoor dat de druppels gecentreerd zijn in de groeven van de putjes op het deksel, draai vervolgens het deksel voorzichtig bovenop de plaat zodat de druppels boven de putjes met PBS hangen. Incubeer de plaat gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voorafgaand aan de overdracht van de sferoïds naar agarose.

Na de incubatie, haalt u de plaat uit de incubator en tilt u voorzichtig het deksel van de plaat, gooit u het PBS weg, klopt u op de plaat om eventuele restvloeistof te verwijderen en laat u de platen twee tot drie minuten aan de lucht drogen. Na het smelten van de agarose, zwiep er voorzichtig mee om eventuele luchtbellen te verwijderen en voeg 50 microliter toe aan de bodem van elke put. Laat de plaat twee minuten op kamertemperatuur staan en voeg vervolgens 100 microliter voorverwarmde DMEM toe bovenop de vaste agaroselaag in elke put.

Plaats het deksel met deze sferoïd druppels weer bovenop de plaat zodat de sferoïds weer hangen en centrifugeer vervolgens de plaat gedurende drie minuten bij 200 keer G om de sferoïds in de individuele putjes van de plaat over te brengen. Incubeer de plaat nog eens 24 uur om de sferoïds te laten bezinken. Na het verspreiden van de gemodificeerde nanomaterialen of ENM's, verdun ze tot de gewenste eindconcentratie met voorverwarmde DMEM.

Zuig 50 microliter medium uit elke put met de sferoïds en vervang het door 50 microliter medium met de ENM. Om de sferoïds te oogsten, gebruikt u een 200 microliter pipet om de 100 microliter celcultuurmedium met het sferoïdweefsel uit elke put te zuigen, en zorgt u ervoor dat u geen contact met de agarose maakt. Verzamel de sferoïds in een steriele 15 milliliter centrifugeerbuis.

Centrifugeer de sferoïdsuspensie gedurende vijf minuten bij 230 keer G, verwijder vervolgens het supernatant en bewaar het bij minus 80 graden Celsius tot verdere analyse. Was de pellet sferoïds in één milliliter steriele PBS op kamertemperatuur, centrifugeer ze vervolgens gedurende drie minuten bij 230 keer G en gooi het supernatant weg. Breng de sferoïds opnieuw op in 500 microliter 0,05% Trypsin-EDTA oplossing en incubeer ze gedurende zes tot acht minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Na de incubatie, pipet de trypsiniseerde Hep G2 cellen voorzichtig op en neer om ze volledig te dissociëren en op te schorten voordat u ze neutraliseert met één milliliter DMEM. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 230 keer G, gooi het supernatant weg en breng de celpellet opnieuw op in twee milliliter PBS. Om een cuvette-trechter op te zetten, plaatst u de voorbereide microscoopglaas in de metalen ondersteuning, plaatst u een filterkaart op de glaas en bevestigt u vervolgens de cuvette-trechter erop.

Schik de cuvette-trichters in de cytocentrifuge met de trichter naar boven, zodat 100 microliter celsuspensie direct in elke trichter kan worden toegevoegd. Ga vervolgens verder met het fixeren van de slides volgens de richtlijnen in het manuscript. Bereid een 20% Giemsa-kleuroplossing verdund in fosfatasefbuffer voor.

Pipet de oplossing voorzichtig op en neer om het te mengen, en filter het vervolgens met gevouwen filterpapier in een trechter. Gebruik een Pasteur-pipet om drie tot vijf druppels gefilterde Giemsa-oplossing op de cytodot op elke glaas te druppelen en laat het gedurende acht tot tien minuten op kamertemperatuur staan. Was de glaasjes in twee opeenvolgende fosfatasefbuffer wasbeurten.

Spoel ze vervolgens kort onder koud water om eventueel overtollig kleurmiddel te verwijderen en laat ze vervolgens aan de lucht drogen. Voorafgaand aan elke in vitro toxicologische beoordeling, is het belangrijk om te controleren of de 3D HepG2 sferoïds correct zijn gevormd. Vier dagen na het zaaien, zouden compacte, sferische sferoïds met een glad oppervlak en geen zichtbare uitsteeksels moeten worden gevormd.

Sferoïden van goede kwaliteit en van slechte kwaliteit vier dagen na het zaaien worden hier getoond. Typisch zal 90 tot 95% van de sferoïds die per plaat worden gevormd, correct worden gevormd en levensvatbaar zijn voor verder experimenteren. Levensvatbaarheid en leverachtige functionaliteit werd beoordeeld gedurende een 14 dagen durende kweekperiode om de levensduur van het lever-sferoïdmodel te bepalen en vast te stellen of het langdurige ENM- of chemisch gebaseerde risicobeoordeling zou kunnen ondersteunen.

De albumineconcentratie bleef consistent over de duur van de kweekperiode, terwijl de ureumproductie per sferoïd toenam voordat de