Name: Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer een fluorometrische test op basis van klikchemie voor apolipoproteïne N-acyltransferase. Deze methode maakt enzymkarakterisatie en high-throughput screening van remmers mogelijk voor antibioticumontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Fabrice Agou en Alix Boucharlat van het Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) van Institut Pasteur Paris voor nuttige suggesties over het protocol, alle leden van de BGPB-eenheid voor ondersteuning en wetenschappelijke discussies, en Simon Legood voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd gefinancierd door Global Care Initiatives van het Institute Carnot Infectious diseases en het Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 en 16 CARN 0023-01).

1. Enzym- en substraatvoorbereiding
<ol><li>Zuivering van enzym
	<ol><li>Produceren en zuiveren van Lnt-enzym uit wasmiddel opgeloste membranen zoals eerder beschreven 4,8. In het kort, induceer expressie van het lnt-strep-gen, coderend voor Lnt met een C-terminal Strep-tag, bij OD600 van 0,6 met watervrij tetracycline (200 ng/ml) bij 37 °C gedurende 16 uur.</li>
		<li>Oogst cellen door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellet in buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) tot 100 OD600 eenheden per ml.</li>
		<li>Breek de cellen door twee passages door een Franse drukcelpers op 10.000 psi.</li>
		<li>Verwijder ongebroken cellen en vuil door centrifugeren bij 13.000 x g gedurende 20 minuten. Bewaar het supernatant en gooi de pellet weg.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatant bij 120.000 x g gedurende 60 minuten en verzamel de membraanblaasjes (doorschijnende bruin gekleurde pellet). Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Verzacht de integrale membraaneiwitten uit de membraanpellet met 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) in buffer WA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer en verwijder onoplosbaar materiaal bij 120.000 x g gedurende 30 minuten. Gebruik de supernatantfractie voor zuivering.</li>
		<li>Zuiver Lnt-strep op een affiniteitschromatografiekolom (zie Tabel van Materialen) en een S400-gelfiltratiekolom (zie Tabel van Materialen) zoals beschreven door Nozeret et al.8.</li>
		<li>Bewaar het gezuiverde enzym in buffer WA met 0,05% DDM en 10% glycerol bij -80 °C. OPMERKING: Het enzym is meer dan 5 jaar stabiel.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van alkyn-fosfolipiden en gebiotinyleerde Fibroblast Stimulerende Ligand (FSL-1-biotine) substraten
	<ol><li>Aliquot 100 μL op maat gesynthetiseerde alkyn-POPE (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, zie Materiaaltabel) opgelost in chloroform in buizen van 1,5 ml.</li>
		<li>Prik de buisjes door met een spuit en verdamp de chloroform in een speed-vac bij RT gedurende 2 uur. Bewaar de droge fosfolipidemonsters bij -20 °C.</li>
		<li>Los alkyne-POPE vóór gebruik op in 0,1% Triton X-100 bij 500 μM. Voeg indien nodig een ultrasoon waterbad van 3 minuten toe in een ultrasoon waterbad bij RT om alkyne-POPE op te lossen.</li>
		<li>Resuspendeer FSL-1-biotine in water bij 445 μM. OPMERKING: Beide oplossingen kunnen minstens 2 maanden bij -20 °C worden bewaard.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Buistest
OPMERKING: Stel op dag 1 de Lnt-reactie in 1,5 ml buizen in (stap 2.1) en bekleed 96 putplaten met streptavidin (stap 2.2).
<ol><li>Bereiding van reagensmengsel en enzymatische reactie
	<ol><li>Meng voor een standaard Lnt-test alkyne-POPE (laatste 50 μM uit 500 μM-voorraad) en FSL-1-biotine (eindconcentratie van 50 μM uit een voorraad van 445 μM) in Lnt-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 met 1% BSA) bij een eindvolume van 18 μL in buizen van 1,5 ml. Voer alle omstandigheden in drievoud uit.</li>
		<li>Soniceer het substraatmengsel (bereid in stap 2.1.1) gedurende 3 minuten in een ultrasoon waterbad en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten voorafgaand aan de toevoeging van Lnt-enzym (stap 2.1.3). OPMERKING: MTSES (natrium (2-sulfonatoethyl)methaanthiosulfonaat), een thiolspecifiek reagens, remt Lnt8. Voeg 10 mM MTSES (100 mM stockoplossing in 100% DMSO) toe aan de reactiebuizen (stap 2.1.1) om te gebruiken als negatieve controlemonsters. Pas het volume van de Lnt-reactiebuffer aan zodat het totale volume 18 μL is.</li>
		<li>Voeg actieve (1 ng/μL, overeenkomend met 17,2 nM) of inactieve Lnt (C387S) (2 μL van 10 ng/μL voorraad in buffer WA met 0,05% DDM) toe en meng met de substraten (stap 2.1.2) door op en neer te pipetteren.</li>
		<li>Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 16 uur in een thermomixer met verwarmd deksel.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin coating van 96 putplaten
	<ol><li>Bereid een stamoplossing van streptavidin in 2 mg/ml in H2O. OPMERKING: Deze oplossing kan maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.</li>
		<li>Bereid uit de stamoplossing 10 μg/ml streptavidin in water als werkoplossing. Voeg 100 μL van de oplossing toe aan elk putje van de 96 putplaat. Bind streptavidin aan de plaat door een nacht bij 37 °C zonder deksel te broeden om de putjes aan de lucht te drogen.</li>
	</ol></li>
</ol>OPMERKING: Voer op dag 2 klikchemie uit (stap 2.3), bind het Lnt-reactiemengsel aan gestreepte platen (stap 2.4) en detecteer fluorescentie en analyseer de resultaten (stap 2.5).
<ol start="3"><li>Klik-chemie reactie
	<ol><li>Bereid stamoplossingen van Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride; 50 mM bereid in water), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine; 2 mM in tert-butanol:DMSO (4:1)) en CuSO4∙5H2O (50 mM vers bereid in H2O).</li>
		<li>Voer in de buizen van 1,5 ml die het in stap 2.1.4 bereide Lnt-reactiemengsel bevatten, klikchemie uit door de reagentia in de volgende volgorde toe te voegen: 0,2 μL voorraad Azido-FAM (eindconcentratie 50 μM), 0,4 μL voorraad TCEP (eindconcentratie 1 mM), 0,2 μL voorraad TBTA (eindconcentratie 0,02 mM).</li>
		<li>Vortex de oplossing voor 5 s. Voeg vervolgens 0,4 μL voorraad CuSO4 toe (eindconcentratie 1 mM). Vortex opnieuw voor 5 s. Incubeer de monsters in het donker bij RT gedurende 1 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Binding van het Lnt-reactiemengsel aan met streptavidin gecoate platen
	<ol><li>Was de putjes van de met streptavidin beklede platen na de nachtelijke incubatie vanaf stap 2.2.2 3x met 200 μL PBS-T1 (PBS met 0,05% Tween-20). OPMERKING: Streptavidin-platen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of droog worden bewaard bij 4 °C.</li>
		<li>Breng 18 μL uit het klikchemiemengsel uit stap 2.3.3 over naar een putje in een 96 goed gestreepte plaat en voeg 100 μL PBS-T1 toe om N-acyl-FSL-1-biotine-FAM-product aan streptavidinplaten te binden.</li>
		<li>Gebruik biotine-fluoresceïne (0,26 μM uit een voorraad van 3,1 mM in DMSO) als positieve controle voor streptavidinbinding en fluorescentie-uitlezing.</li>
		<li>Incubeer de platen bij RT gedurende 1 uur in het donker in een thermomixer, schuddend bij 300 tpm.</li>
		<li>Voer handmatige wasstappen uit van de 96 putplaten met een meerkanaals elektronische pipet als volgt: zes wasbeurten met 200 μL PBS-T2 (PBS met 1% Tween-20), drie spoelingen met een pipet, drie wasbeurten met 200 μL PBS, drie spoelingen met een pipet.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescentie detectie en analyse
	<ol><li>Voeg 200 μL PBS toe en noteer de fluorescentie bij 520 nm in een fluorescentiemicroplaatlezer. Sla resultaten op in spreadsheetsoftware. OPMERKING: Biotine-fluoresceïne wordt gebruikt als een positieve controle voor streptavidinbinding en fluorescentiedetectie bij 520 nm. Een reproduceerbare uitlezing van 30.000-40.000 A.U. met 0,26 μM biotine-fluoresceïne wordt verwacht. Alle monsters worden in drievoud geanalyseerd, inclusief controles.</li>
		<li>Bereken de standaarddeviatie voor elke reactie en bereken P-waarden voor negatieve controles en positieve monsters met behulp van ongepaarde t-test met behulp van statistische software.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Multiwell plaat assay
OPMERKING: Zet op dag 1 de Lnt-reactie op in 384 putplaten (stap 3.1) en bekleed 384 putplaten met streptavidin (stap 3.2).
<ol><li>Bereiding van reagensmengsel en enzymatische reactie OPMERKING: De hoeveelheid reagentia en enzym is verminderd in vergelijking met de buistest en de Lnt-reactie wordt direct uitgevoerd in 384 putplaten. Dit maakt het gebruik van minder materiaal en een vermindering van stappen mogelijk die verder kunnen worden geautomatiseerd.<ol><li>Meng de substraten als volgt: alkyn-POPE (eindconcentratie 50 μM uit 500 μM-voorraad) en FSL-1-biotine (laatste 50 μM uit 500 μM-voorraad) in Lnt-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 met 1% BSA) bij een volume van 13,5 μL per reactie per put in een 384 putplaatformaat. Voer alle omstandigheden in drievoud uit. Bereken de totale hoeveelheid reagentia die nodig is voor het aantal uit te voeren reacties (d.w.z. 5.184 μL voor één 384 putplaat).</li>
		<li>Soniceer het substraatmengsel gedurende 3 minuten in een ultrasoon waterbad.</li>
		<li>Aliquot 13,5 μL van het substraatmengsel per put in een plaat met 384 putten. OPMERKING: Als negatieve controle kan 10 mM MTSES (625 mM stockoplossing in 100% DMSO) per put worden toegevoegd. Pas het volume van de Lnt-buffer (stap 3.1.1) aan om een eindreactievolume van 13,5 μL te bereiken.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten voorafgaand aan de toevoeging van Lnt enzym (stap 3.1.5).</li>
		<li>Voeg 0,5 ng/μL (overeenkomend met 8,6 nM) actief Lnt-enzym of inactieve variant (C387S) (1,5 μL uit 5 ng/μL voorraad in buffer WA met 0,05% DDM) toe in Lnt-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) aan elk putje met het reactiemengsel uit stap 3.1.3. Meng reagentia door op en neer te pipetteren. Het totale reactievolume is 15 μL.</li>
		<li>Sluit de plaat af met plastic folie voor multiwell platen.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 16 uur in een thermomixer met verwarmd deksel.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin coating 384 putplaten<ol><li>Gebruik 75 μL streptavidin (10 μg/ml in H2O) uit stap 2.2.2 om putjes van een 384 putplaat te coaten. Laat streptavidin aan de plaat binden door een nacht bij 37 °C zonder deksel te broeden om de putjes aan de lucht te drogen.</li>
	</ol></li>
</ol>OPMERKING: Voer op dag 2 klikchemie uit (stap 3.3), bind het Lnt-reactiemengsel aan gestreepte platen (stap 3.4), detecteer fluorescentie en analyseer de resultaten (stap 3.5).
<ol start="3"><li>Klik-chemie reactie<ol><li>Bereid stamoplossingen van Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride; 24 mM bereid in H2O), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine; 0,48 mM in tert-butanol:DMSO (4:1)) en CuSO4∙5H2O (24 mM vers bereid in H2O).</li>
		<li>Combineer de drie klikchemische reagentia: een mengsel van Azido-FAM (eindconcentratie 50 μM), TCEP (1 mM final) en TBTA (0,02 mM final), elk bij 0,75 μL in eindvolume van 2,25 μL per putje. Bereken het vereiste volume per 384 putplaat (d.w.z. gebruik 864 μL wanneer alle putten van de 384 putplaat worden gebruikt). Meng krachtig.</li>
		<li>Voeg 2,25 μL van de reagensoplossing per putje rechtstreeks toe aan de voltooide Lnt-reactie in de 384 putplaat uit stap 3.1.7.</li>
		<li>Mix door op en neer te pipetteren met een meerkanaals elektronische pipet.</li>
		<li>Voeg CuSO4 toe (0,75 μL uit 24 mM voorraad voor een eindconcentratie van 1 mM) en meng door op en neer te pipetteren met een meerkanaals elektronische pipet.</li>
		<li>Incubeer bij RT gedurende 1 uur in het donker.</li>
	</ol></li>
	<li>Binding van Lnt-reactiemengsel aan 384 putplaten met streptavidincoating
	<ol><li>Was de putjes van de met streptavidin beklede platen na de nachtelijke incubatie vanaf stap 3.2.1 1x met 85 μL PBS-T1.</li>
		<li>Breng 11 μL van de klikchemiereactie over van elke put van de incubatieplaat vanaf stap 3.3.6 naar de met streptavidin gecoate plaat uit stap 3.4.1 om het N-acyl-FSL-1-biotine-FAM-product aan de streptavidinplaten te binden.</li>
		<li>Voeg 64 μL buffer PBS-T1 toe.</li>
		<li>Neem biotine-fluoresceïne (0,19 μM uit een voorraad van 3,1 mM in DMSO) op als controle voor binding aan gestreepte putten met streptavidin.</li>
		<li>Incubeer de 384 putplaten bij RT gedurende 1 uur in het donker in een thermomixer, schuddend bij 300 tpm.</li>
		<li>Was de platen met een geautomatiseerde platenwasser als volgt: 10 wasbeurten met 85 μL PBS-T2, platen worden tussen de wasbeurten geschud; 5 wasbeurten met 85 μL PBS, platen worden tussen de wasbeurten geschud.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescentie detectie en analyse
	<ol><li>Voeg PBS (85 μL) toe en registreer fluorescentie in een fluorescentiemicroplaatlezer bij 535 nm.</li>
		<li>Analyseer gegevens zoals beschreven (stap 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li>
<li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li>
<li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li>
<li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li>
<li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147(2017).</li>
<li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+%28Lnt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978(2019).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecules+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198(2016).</li>
<li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li>
<li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952(2017).</li>
<li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol voor de Lnt-test, gebaseerd op fluorescentiedetectie van het getriagyleerde product, is gevoelig en reproduceerbaar. De specifieke en efficiënte binding van biotine aan streptavidin is een belangrijk element in de test. Het alkyne-POPE-substraat dat overblijft na voltooiing van de Lnt-reactie wordt ook fluorescerend gelabeld met FAM, maar wordt efficiënt verwijderd na binding aan de streptavidinplaten door meerdere wasstappen. Bovendien heeft toevoeging van DMSO geen invloed op de Lnt-activit...

Bacteriële lipoproteïnen worden gekenmerkt door covalent gebonden vetzuren op hun amino-termini waardoor ze worden verankerd in membranen 1,2. Het volwassen deel van het eiwit is zeer divers in structuur en functie, waardoor de rol van lipoproteïnen in verschillende biologische processen in de bacteriële celenvelop wordt verklaard.
Lipoproteïnen worden gemodificeerd door fosfolipide-afgeleide vetzuren na inbrenging in het cytoplasmamembraan. De prolipoproteïnen bevatten een kenmerkend motief, de lipobox, die een invariant cysteïneresidu bevat dat wordt geacyleerd en het eerste aminozuur in het rijpe eiwit. De eerste stap van deze route wordt gekatalyseerd door prolipoproteïnefosfatidylglycerol::d iacylglyceryltransferase (Lgt), dat de diacylglycerylgroep overbrengt van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne via een thioetherverbinding tussen diacylglyceryl en cysteïne. Signaal peptidase II (Lsp) splitst het signaalpeptide van diacylglyceryl prolipoproteïne, wat resulteert in een apolipoproteïne dat via zijn diacylglycerylgroep in het membraan is verankerd. De derde en laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt), dat een vetzuur uit de sn-1-positie van fosfolipide toevoegt aan apolipoproteïne, wat resulteert in getriacyleerd rijp lipoproteïne (figuur 1)3. De Lnt-reactie is een pingpongreactie in twee stappen waarbij een stabiel thioester-acyl-enzymtussenproduct wordt gevormd. Het bijproduct van lysofosfolipide wordt vrijgegeven voorafgaand aan de acylering van het apolipoproteïnesubstraat in de tweede stap van de reactie.
De specificiteit van het fosfolipidensubstraat wordt bepaald in een Lnt-test op basis van de mobiliteitsverschuiving van N-acyldiacylglycerylpeptide op een hoog percentage Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Fosfolipiden met kleine polaire kopgroepen, verzadigd [sn-1] en niet-verzadigd [sn-2], hadden de voorkeur als substraten4. De gelverschuivingstest is niet geschikt voor uitgebreide kinetische studies van apolipoproteïne N-acyltransferase, noch voor HTS om remmende moleculen te identificeren. Klikchemie met behulp van alkynvetzuren is met succes gebruikt om lipoproteïnemodificatie in bacteriën5 en vetzuurmetabolisme in eukaryoten6 te bestuderen. Onlangs werd een in vitro test van Ras-palmitoylering gemeld om remmers te identificeren7.
In de hier beschreven methode wordt gezuiverde actieve Lnt in wasmiddel geïncubeerd met substraten in gemengde micellen om alkyn-getristacyleerd peptide te vormen dat vervolgens wordt gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie.

<table><tbody><tr><td>&Auml;kta Purifier FPLC system</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Purity: NA Lnt-zuivering</td></tr><tr><td>alkyne-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Purity: >99% Lnt-substraat</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Purity: 100% (zuiver) Klik-reagens</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Purity: NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td><td>BioTek</td><td>N&deg; serie 115800, n&deg; materiel 405 Select</td><td>Purity: NA Wasstap</td></tr><tr><td>biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Purity: &ge;90% Fluorescerend controle</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Purity: &ge;98% Klik-reagens</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Purity: &ge; 99% &beta;+&alpha;; &lt; 15% &alpha; Detergent voor Lnt-zuivering</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Purity: watervrij Solbilisatie Klik-reagens</td></tr><tr><td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Purity: NA Hanteren van reagentia</td></tr><tr><td>French Pressure Cell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purity: NA Celruptuur</td></tr><tr><td>FSL-1-biotin</td><td>EMC microcollections</td><td>L7030</td><td>Purity: NA Lnt-substraat</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Purity: NA Zwart met transparante bodem (boven- of onderaan lezen)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Purity: NA Zwart met transparante bodem (boven- of onderaan lezen)</td></tr><tr><td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA Fluorescerende detectie</td></tr><tr><td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Purity: ~100% Thiol-specifieke remmer</td></tr><tr><td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Purity: NA Folie voor het verzegelen van multi-well platen</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Purity: NA Lnt-zuivering</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Purity: NA Lnt-zuivering</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Purity: &ge;13 units/mg proteïne Biotine binding</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Purity: 97% Klik-reagens</td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Purity: &ge;98% Klik-reagens</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA Fluorescerende detectie</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Purity: NA Fluorescerende detectie</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Purity: NA Verwarmd deksel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Purity: 10% in H2O Lnt-reactiebuffer</td></tr><tr><td>Ultra centrifuge</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Purity: NA Celfractie</td></tr></tbody></table>

op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor apolipoproteïne n-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteïnen uit proteobacteriën worden posttranslationeel gemodificeerd door vetzuren afgeleid van membraanfosfolipiden door de werking van drie integrale membraanenzymen, wat resulteert in getriacyleerde eiwitten. De eerste stap in de lipoproteïnemodificatieroute omvat de overdracht van een diacylglycerylgroep van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne, wat resulteert in diacylglycerylprolipoproteïne. In de tweede stap wordt het signaalpeptide van prolipoproteïne gesplitst en vormt het een apolipoproteïne, dat op zijn beurt wordt gewijzigd door een derde vetzuur afgeleid van een fosfolipide. Deze laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt). De lipoproteïnemodificatieroute is essentieel in de meeste γ-proteobacteriën, waardoor het een potentieel doelwit is voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen. Hier wordt een gevoelige test voor Lnt beschreven die compatibel is met high-throughput screening van kleine remmende moleculen. Het enzym en de substraten zijn membraan-ingebedde moleculen; daarom is de ontwikkeling van een in vitro test niet eenvoudig. Dit omvat de zuivering van het actieve enzym in aanwezigheid van wasmiddel, de beschikbaarheid van alkynfosfolipiden en diacylglycerylpeptidesubstraten en de reactieomstandigheden in gemengde micellen. Om de activiteitstest te gebruiken in een high-throughput screening (HTS) opstelling, heeft directe uitlezing van het reactieproduct bovendien de voorkeur boven gekoppelde enzymatische reacties. In deze fluorometrische enzymtest wordt het alkyn-getriagyleerde peptideproduct fluorescerend gemaakt door een klikchemiereactie en gedetecteerd in een multiwell-plaatformaat. Deze methode is van toepassing op andere acyltransferasen die vetzuurhoudende substraten gebruiken, waaronder fosfolipiden en acyl-CoA.

In de Lnt-reactie wordt het sn-1 vetzuur uit fosfolipiden overgebracht op een diacylglycerylpeptide, wat resulteert in volwassen getrianacyleerd peptide8. De hier beschreven in vitro Lnt-test is ontworpen om fosfolipiden met een alkynvetzuur (alkyn-POPE) en FSL-1-biotine als substraten te gebruiken, wat resulteert in de vorming van alkyn-FSL-1-biotine. Bij een klikchemiereactie met azido-FAM moet dit product fluorescerend worden gelabeld en gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie (<s...

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Dit protocol behandelt twee belangrijke aspecten, karakterisering van een essentiële integraal membraaneiwit, apolipoproteïne acyltransferase van bacteriën, en ontwikkeling van de test in HDS-formaat om naar remmer van het enzym te screenen. De methode is zeer gevoelig en geschikt voor screeningsdoeleinden. Het kan bijdragen aan de ontwikkeling van potentiële nieuwe antibiotica.Deze video zal helpen om cruciale stappen van dit protocol te benadrukken, zoals mengen, vortexen, soniceren, tijdens het werken met niet-homogene lipiden en detergent bevattende suspensies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Karine Nozeret, Aurelia Pernin, beiden zijn fellows in mijn groep. Begin met het voorbereiden van de reagentiamix voor de apolipoproteïne en acyltransferase of LNT-test.Meng alkyn POPE en FSL-1-biotine met LNT reactiebuffer in 1,5 milliliter buisjes bij een eindvolume van 18 microliter. Bereid drievoudige reagentiamix voor alle geteste omstandigheden voor. Soniceer de reagentiamix gedurende drie minuten in een ultrasoon waterbad en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.Voeg vervolgens actief of inactief LNT toe tot een eindconcentratie van één nanogram per microliter, en pipet omhoog en omlaag om te mengen. Incubeer de reactie gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius in een thermische mixer met een verwarmd deksel. Bereid ondertussen een stamoplossing van twee milligram per milliliter streptavidine.En verdun het tot 10 microgram per milliliter om een werkoplossing te creëren. Voeg 100 microliter van de oplossing toe aan elke put van een 96-puttenplaat. Laat de putten dan een nacht drogen door de plaat te incuberen bij 37 graden Celsius zonder deksel.Op de volgende dag, bereid stamoplossingen van vijf millimolair Azido-FAM, 50 millimolair TCEP, twee millimolair TBTA en 50 millimolair kopersulfaat pentahydraat. Voer click chemie uit door 0,2 microliter stam Azido-FAM, 0,4 microliter stam TCEP en 0,2 microliter stam TBTA toe te voegen aan de 1,5 milliliter LNT reactiebuisjes. Vortex de oplossing gedurende vijf seconden.Voeg vervolgens 0,4 microliter stam kopersulfaat toe. Vortex nogmaals gedurende vijf seconden en incubeer de reactie gedurende één uur op kamertemperatuur in het donker. Terwijl de click chemie mengsel incubeert, was de putten van de streptavidine gecoate platen drie keer met 200 microliter PBST1.Breng 18 microliter van het click chemie mengsel over naar een streptavidine gecoate put en voeg 100 microliter PBST1 toe om het N-acyl-FSL-1-biotine FAM-product aan de plaat te binden. Voeg biotin fluoresceïne toe aan de plaat als positieve controle voor streptavidine binding en fluorescentie readout. Incubeer vervolgens de plaat gedurende één uur op kamertemperatuur in het donker, terwijl geschud wordt bij 300 RPM.Na de incubatie gebruik een multikanaals elektronische pipet om de plaat handmatig zes keer te wassen met 200 microliter PBST2. Spoel het drie keer met de pipet. Was het drie keer met 200 microliter PBS en spoel het nog drie keer.Voeg 200 microliter PBS toe aan elke put en detecteer de fluorescentie bij 520 nanometer in een microplaatlezer. Sla alle resultaten op in een spreadsheet en bereken vervolgens de standaardafwijking voor elke reactie, evenals de P-waarden voor negatieve controles en positieve monsters met een ongepaarde T-test. De in vitro LNT-test die hier wordt beschreven, gebruikt fosfolipiden die een alkyn vetzuur en FSL-1-biotine bevatten als substraten om alkyn FSL-1-biotine te vormen.Na een click chemie reactie met Azido-FAM wordt dit product fluorescerend gelabeld en detecteerbaar door middel van fluorescentiespectrometrie. De reactieomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor maximale fluorescentie readout bij 520 nanometer. Negatieve controles omvatten reacties zonder enzym, met een inactieve variant van het enzym of met thiol specifieke remmer, MTSES.Biotin fluoresceïne werd gebruikt als interne controle voor maximale fluorescentie signaal. Om een hoogdoorvoerschermtest te ontwikkelen, werden de reacties direct uitgevoerd in 384-putten platen. Wasstappen werden geautomatiseerd en de hoeveelheid reagentia werd verminderd.De reactie was gevoelig en reproduceerbaar met een significant verschil in fluorescent signaal tussen de negatieve controle en actief enzym. Voor hoogdoorvoerschermen bepaalt de Z prime factor of een reactie in een test groot genoeg is voor screeningsdoeleinden. De gemiddelde Z prime factor was groter dan 0,6 voor de LNT test uitgevoerd in een 384-putten formaat, wat suggereert dat het uitstekend was.De buistest in deze video is ontwikkeld in een multiplate formaat dat compatibel is met HDS. Het kan worden gebruikt om andere acyltransferases van een verscheidenheid aan organismen te bestuderen.

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een protocol voor screening van kleine moleculaire geneesmiddelen op basis van in-situ synthese van ultrakleine fluorescerende gouden nanoclusters (Au NC's) met behulp van een door geneesmiddelen geladen eiwit als sjabloon wordt gepresenteerd. Deze methode is eenvoudig om de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit te bepalen door een zichtbaar fluorescerend signaal dat wordt uitgezonden door de eiwit-gesjabloniseerde Au NC's.

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

Hier beschrijven we een fluorimetrische cel-vrije biochemische bepaling voor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie. Deze snelle en reproduceerbare kwantitatieve analyse kan worden gebruikt om te bepalen van HDL functie in grootschalige studies en kan bijdragen aan ons begrip van HDL functie in ziekten bij de mens.

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Meting van in vitro cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument als een biomarker voor atherosclerose. In de huidige studie, optimaliseren wij en een fluorescerende NBD-cholesterol efflux methode standaardiseren en ontwikkelen van een hoge-doorvoer-analyse met behulp van 96-wells-platen.

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Snelle en nauwkeurige chemische tests om te screenen op specifieke remmers zijn een belangrijk hulpmiddel in het arsenaal aan geneesmiddelenontwikkeling. Hier presenteren we een schaalbare acetyl-klikchemietest om de remming van HAT1-acetyleringsactiviteit te meten.

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

Leer een fluorometrische test op basis van klikchemie voor apolipoproteïne N-acyltransferase. Deze methode maakt enzymkarakterisatie en high-throughput screening van remmers mogelijk voor antibioticumontwikkeling.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer (Video) | JoVE Journal

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Meer video's verkennen