Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Dit protocol behandelt twee belangrijke aspecten, karakterisering van een essentiële integraal membraaneiwit, apolipoproteïne acyltransferase van bacteriën, en ontwikkeling van de test in HDS-formaat om naar remmer van het enzym te screenen. De methode is zeer gevoelig en geschikt voor screeningsdoeleinden. Het kan bijdragen aan de ontwikkeling van potentiële nieuwe antibiotica.

Deze video zal helpen om cruciale stappen van dit protocol te benadrukken, zoals mengen, vortexen, soniceren, tijdens het werken met niet-homogene lipiden en detergent bevattende suspensies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Karine Nozeret, Aurelia Pernin, beiden zijn fellows in mijn groep. Begin met het voorbereiden van de reagentiamix voor de apolipoproteïne en acyltransferase of LNT-test.

Meng alkyn POPE en FSL-1-biotine met LNT reactiebuffer in 1,5 milliliter buisjes bij een eindvolume van 18 microliter. Bereid drievoudige reagentiamix voor alle geteste omstandigheden voor. Soniceer de reagentiamix gedurende drie minuten in een ultrasoon waterbad en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens actief of inactief LNT toe tot een eindconcentratie van één nanogram per microliter, en pipet omhoog en omlaag om te mengen. Incubeer de reactie gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius in een thermische mixer met een verwarmd deksel. Bereid ondertussen een stamoplossing van twee milligram per milliliter streptavidine.

En verdun het tot 10 microgram per milliliter om een werkoplossing te creëren. Voeg 100 microliter van de oplossing toe aan elke put van een 96-puttenplaat. Laat de putten dan een nacht drogen door de plaat te incuberen bij 37 graden Celsius zonder deksel.

Op de volgende dag, bereid stamoplossingen van vijf millimolair Azido-FAM, 50 millimolair TCEP, twee millimolair TBTA en 50 millimolair kopersulfaat pentahydraat. Voer click chemie uit door 0,2 microliter stam Azido-FAM, 0,4 microliter stam TCEP en 0,2 microliter stam TBTA toe te voegen aan de 1,5 milliliter LNT reactiebuisjes. Vortex de oplossing gedurende vijf seconden.

Voeg vervolgens 0,4 microliter stam kopersulfaat toe. Vortex nogmaals gedurende vijf seconden en incubeer de reactie gedurende één uur op kamertemperatuur in het donker. Terwijl de click chemie mengsel incubeert, was de putten van de streptavidine gecoate platen drie keer met 200 microliter PBST1.

Breng 18 microliter van het click chemie mengsel over naar een streptavidine gecoate put en voeg 100 microliter PBST1 toe om het N-acyl-FSL-1-biotine FAM-product aan de plaat te binden. Voeg biotin fluoresceïne toe aan de plaat als positieve controle voor streptavidine binding en fluorescentie readout. Incubeer vervolgens de plaat gedurende één uur op kamertemperatuur in het donker, terwijl geschud wordt bij 300 RPM.

Na de incubatie gebruik een multikanaals elektronische pipet om de plaat handmatig zes keer te wassen met 200 microliter PBST2. Spoel het drie keer met de pipet. Was het drie keer met 200 microliter PBS en spoel het nog drie keer.

Voeg 200 microliter PBS toe aan elke put en detecteer de fluorescentie bij 520 nanometer in een microplaatlezer. Sla alle resultaten op in een spreadsheet en bereken vervolgens de standaardafwijking voor elke reactie, evenals de P-waarden voor negatieve controles en positieve monsters met een ongepaarde T-test. De in vitro LNT-test die hier wordt beschreven, gebruikt fosfolipiden die een alkyn vetzuur en FSL-1-biotine bevatten als substraten om alkyn FSL-1-biotine te vormen.

Na een click chemie reactie met Azido-FAM wordt dit product fluorescerend gelabeld en detecteerbaar door middel van fluorescentiespectrometrie. De reactieomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor maximale fluorescentie readout bij 520 nanometer. Negatieve controles omvatten reacties zonder enzym, met een inactieve variant van het enzym of met thiol specifieke remmer, MTSES.

Biotin fluoresceïne werd gebruikt als interne controle voor maximale fluorescentie signaal. Om een hoogdoorvoerschermtest te ontwikkelen, werden de reacties direct uitgevoerd in 384-putten platen. Wasstappen werden geautomatiseerd en de hoeveelheid reagentia werd verminderd.

De reactie was gevoelig en reproduceerbaar met een significant verschil in fluorescent signaal tussen de negatieve controle en actief enzym. Voor hoogdoorvoerschermen bepaalt de Z prime factor of een reactie in een test groot genoeg is voor screeningsdoeleinden. De gemiddelde Z prime factor was groter dan 0,6 voor de LNT test uitgevoerd in een 384-putten formaat, wat suggereert dat het uitstekend was.

De buistest in deze video is ontwikkeld in een multiplate formaat dat compatibel is met HDS. Het kan worden gebruikt om andere acyltransferases van een verscheidenheid aan organismen te bestuderen.