Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)
May 8th, 2020
Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.
Mosaic Analysis met Double Markers technologie is een krachtige methode die zeer kwantitatieve informatie kan bieden over het proliferatiegedrag en kelderoutput van individuen stamcellen. Een uniek kenmerk van deze techniek, is dat het mogelijk maakt afstamming tracing en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op het niveau van de single cell.demontrating aan de procedure zal zijn, Carmen Streicher, uw technicus, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc en Andy Hansen, een promovendus uit mijn laboratorium. Om MADM recombinatie gebeurtenissen in experimentele muizen te induceren, gebruik dan een 1ml spuit uitgerust met een 25-meter naald om een enkele injectie van Tamoxifen Intraperitoneal te leveren in een getimede tot zwangere moeder. Van MADM klonale analyse tot postnatale tijdstippen. Plaats op embryonale dagen 18 tot 19 een zwangere muis in de supinepositie en desinfecteer de vacht met 70%ethanol. Maak een kleine incisie in de huid in de onderbuik boven de baarmoeder en maak een tweede incisie door de spieren en de buikspierwand om het buikvlies te onthullen. Gebruik een schaar om de baarmoeder te scheiden van de omliggende weefsels en plaats de intacte baarmoeder in een handschoen met warm water. Gebruik vervolgens fijne tipschaar en vingers om de baarmoederwanden zorgvuldig te openen om de embryo's vrij te geven. Reinig de pups zachtjes drukken op de borst van tijd tot tijd om de ademhaling te starten voordat de overdracht van de prenatale dieren aan een pleegmoeder. Om neurale MADM Clone Tissue te verzamelen plaats een verdoofd dier in de supine positie op een perfusie operatie lade en desinfecteren de vacht met 70%ethanol. Gebruik schaar en tang om een incisie te maken door de huid en een incisie door de spierlaag. Wanneer de borstholte zichtbaar is, snuiven en til het middenrif om het hart te onthullen en zorgvuldig trim en pin de ribbenkast aan de chirurgische lade.insert een naald aangesloten op een peristaltische pomp buizen gevuld met PBS in de linker linker hartkamer en gebruik kleine Iris schaar om een incisie te maken in het achterste uiteinde van het rechter atrium. Doorsnede het cardiovasculaire systeem met de PBS onmiddellijk gevolgd door perfusie met vers bereide ijskoude 4%paraformaldehyde in PBS. Wanneer de perfusie is voltooid, verwijder de hersenen door zorgvuldige dissectie en plaats het geoogste orgaan in ten minste vijf keer het hersenvolume van verse 4% paraformaldehyde 's nachts op 4
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor lijnagetracering en functionele genetische analyse van kandidaatgenen op het niveau van een enkele cel, gebruikmakend van Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). De MADM clonale analyse maakt kwantitatieve meting mogelijk van het proliferatiegedrag en de cellulaire output van individuele voorlopercellen en hun afstammende cellen.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Onderzoeksgebied
- Lijnagetracering
- Genetische analyse
- Stamcelbiologie
Achtergrond
- MADM-technologie is instrumenteel bij het begrijpen van celproliferatie.
- De methode maakt tracering op het niveau van een enkele cel mogelijk.
- Toepassingen omvatten het beoordelen van cellulaire output en lijnagerelaties.
Gebruikte methoden
- Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)
- Experimenteel model: Muizen
- Technieken omvatten intraperitoneale injecties en weefselperfusie.
Belangrijkste resultaten
- Maakte gedetailleerde onderzoek van voorlopercelgedrachten mogelijk.
- Bijdragende inzichten in de lijnagerelaties van dochtercellen.
- Demonstreerde een betrouwbare methode voor functionele genetische analyse.
Conclusies
- Deze studie biedt een uitgebreid protocol voor het gebruik van MADM in genetische analyse.
- De bevindingen dragen significant bij aan het veld van de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
