Een gnotobiotisch systeem voor het bestuderen van microbioomassemblage in de Phyllosfeer en in plantaardige fermentatie

Met behulp van dit protocol kunnen we belangrijke vragen beantwoorden over hoe microben zich in de phyllosfeer verzamelen en met elkaar omgaan. Het heeft als bijkomend voordeel dat we door het steriele groenteextract de structuur van phyllo-bolgemeenschappen kunnen koppelen aan hun functie tijdens de plantaardige gisting. Deze technieken stellen wetenschappers in staat om te testen hoe microben interageren in de phyllo-sfeer en vervolgens bij te houden hoe deze phyllo-bolgemeenschappen fermentatie kunnen beïnvloeden.

Om de koolzaadjes te steriliseren, begin met het plaatsen van 100 zaden in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg een milliliter van 70% ethanol aan de buis en vortex gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een pipet om de ethanol weg te gooien.

Voeg een milliliter van 50% bleekmiddel en vortex de buis gedurende vijf minuten, dan gooi het bleekmiddel. Spoel de zaden vier keer, door het toevoegen van een milliliter van autoclaved gedeïmiseerd water vortexing de buis, dan het weggooien van het water. Na de laatste spoeling, weken de zaden in gesteriliseerd gedeïmplanteerd water gedurende twee tot acht uur om de zaadlaag te verzachten voor het planten.

Weeg 10 gram schone calciumklei af in een glazen buis van 15 bij 2,5 centimeter. Voeg ongeveer negen milliliter bereide MS Bouillon aan elke buis om de calciumklei te dekken. Dop de glazen buizen losjes met 22 millimeter tweerichtingstestbuisdoppen.

Autoclave de buizen op 121 graden Celsius gedurende 60 minuten. Bij het verwijderen van de buizen uit de autoclave, duw de doppen op de glazen buizen om ze te verzegelen, dan koel de buizen op kamertemperatuur voor gebruik. Wanneer de buizen zijn afgekoeld, gebruikt extra lange tangen om voorzichtig een steriel koolzaad in het midden van elke buis.

Kant de buizen in een zevenweg lade en plaats de lade onder lichte rekken met een 16 uur durende lichtcyclus op 24 graden Celsius. De zaden zullen hun eerste echte blad ontwikkelen na vijf dagen, dat is het eerste vasculaire blad nadat de cotyledons zich hebben gevormd. Het heeft een gerimpelde rand en is bedekt met tricombs.

Om de kiemvrije kool op steriliteit te testen, moet u de basis van de plant voorzichtig vastpakken met gesteriliseerde tangen en eruit trekken. Voordat u de kool volledig uit de buis haalt, moet u de wortels voorzichtig afsnijden met een gesteriliseerde dissectieschaar. Compact vervolgens de koolbladeren in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Voeg 400 microliter PBS toe aan elke microcentrifugebuis en gebruik een steriele micro stamper om de kool te homogeniseren. Blade 100 microliter van de kool homogenaat op agar platen, zorg ervoor dat een brede opening pipet tip te gebruiken. Om glycerol voorraden van inentende stammen, voorzichtig streep uit individuele kolonies op twee of drie nieuwe platen van dezelfde media.

Rij de kolonies twee tot vijf dagen en schraap ze vervolgens van de platen in een conische buis van 15 milliliter met 15 milliliter van 15%glycerol. Vortex de buis grondig te mengen. Aliquot een milliliter van de gemengde glycerol voorraad in een micro centrifuge buis en bewaar het 80 graden Celsius tot klaar voor gebruik, samen met de resterende 14 milliliter glycerol voorraad.

Een week voorafgaand aan het gebruik, ontdooien de een milliliter aliquot op ijs en plaats het op verschillende verdunningen om de concentratie van de inenting voorraad te bepalen. Wanneer u klaar bent om de kool te inenten, ontdooit u de glycerolvoorraad op ijs en verdunt u deze tot de gewenste concentratie. Voeg 10 milliliter van de verdunde voorraad toe aan de steriele pompfles en pomp vijf sprays in een groot afvalinzamelbeker.

Haal het deksel uit de koolbuis en kantel de kool naar de spuitfles. Spray elke kool met drie pompen van de inentingsoplossing en oogst vervolgens een deelverzameling van de kool om de werkelijke inentingsconcentratie te beoordelen. Om de kool te oogsten, verwijder deze uit de buis met gesteriliseerde tangen.

Snijd de wortels af met steriele dissectieschaar en plaats deze voorzichtig in een voorge weighte steriele microcentrifugebuis. Noteren van het gewicht van de kool voor toekomstige berekeningen. Voeg 400 microliter PBS toe aan elke buis met de kool en maal het 30 keer met een micro stamper en plaat het koolhomogenaat met brede opening pipettips.

Verwijder en gooi de buitenste bladeren van de kool weg en hak alle resterende kool om in een blender te passen. Meng het tot een fijne pulp en weeg het koolhomogenaat. Voeg twee milliliter gedestilleerd water per gram kool toe.

Vervolgens filteren de kool drijfmest door twee lagen van mand koffie filters. Doseer de drijfmest in centrifugebuizen en vercentrifugeren op 20.000 keer G gedurende 20 minuten of totdat grote deeltjes zich uit de oplossing nestelen. Verwijder de supernatant, oppassen dat de pelleted kool puin niet verstoren.

Om de fermentatieomstandigheden met standaardzoutconcentraties opnieuw te maken, voegt u 2% gewicht toe aan het volume natriumchloride aan het extract. Bilder het groenteextract met een 0,2 micrometer filter bevestigd aan een vacuüm, afzien van het in steriele buizen en bevriezen bij min 80 graden Celsius. De zaadsterilisatiemethode werd getest met verschillende Napa kool en ze toonden allemaal vergelijkbare groeicijfers aan.

Echter, andere soorten brassica gaf beperkt succes, omdat de planten ofwel had lage kieming tarieven na sterilisatie of de stengel snel langwerpig om een stekelige ongezonde plant te maken. Microbiële isolaten werden ingeënt als isolaten van één stam of in combinatie met een ander isolaat. In totaal werden 15 kiemvrije kool voor elke behandeling getest en onmiddellijk geoogst, op vier dagen of op 10 dagen na inenting.

De isolaten toonden een snelle groei in de Napa kool Phyllosphere. Twee gisten en drie bacteriën werden ingeënt in drie verschillende soorten steriele plantaardige extract of SVE gemaakt van rode, groene en Napa kool. De groei van de inentingen werd gedurende 14 dagen geregistreerd door vijf microliter van elke behandeling op MRS- of YPD-agarplaten te plaatsen.

Metingen van de pH tijdens de fermentatie toonden aan dat de melkzuurbacteriën in staat waren om de SVE te verzuren tot een niveau onder de pH vier, wat wijst op een gisting die veilig is voor consumptie. Deze methoden zijn specifiek toegepast op het koolmicrobioom, maar kunnen nuttig zijn in andere plantaardige systemen. Het kan een uitdaging zijn om het systeem steriel te houden, onze overzichtsprotocollen zijn gedetailleerd, maar we vonden elke stap belangrijk.