Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Het bewerken van genen in humane pluripotente stamcellen is een uitdaging. Dit protocol biedt de gedetailleerde procedure voor genoombewerking in deze cellen met behulp van een gepaarde Cas-90 case gecombineerd met de targeting vector. Het is betrouwbaar en gemakkelijk te volgen.

Het grote voordeel van dit protocol is dat het naadloze genomische bewerking is. De selectie in twee stappen helpt om het aantal doelwitten te verhogen en heeft het genotyperingsonderzoek efficiënter gemaakt. Onderhoud humane pluripotente stamcellen op recombinante laminine 21-gecodeerde oppervlakken in mTeSR1-medium.

De cellen moeten 70 tot 85% confluency bereiken, 72 uur na een splitsingsverhouding van één tot drie. Op de dag van de transfectie coat u voldoende putjes van een 24-wellplaat met 300 microliter van de laminine 521-oplossing en incubeer de plaat gedurende ten minste twee uur bij 37 graden Celsius. Verwijder na de incubatie voorzichtig de coatingoplossing en voeg onmiddellijk 300 microliter vers mTeSR1-medium toe, aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer in elk putje.

Plaats vervolgens de plaat terug in de incubator. Haal de stamcellen uit de incubator. Verwijder het gebruikte medium en was de cellen eenmaal met één milliliter steriele DPBS.

Voeg vervolgens één milliliter zacht celdissociatiereagens toe aan elk putje en incubeer het gedurende zes tot acht minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te dissociëren. Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen gemakkelijk loslaten. Gebruik vervolgens een P1000-tip om de cellen op te tillen door op en neer te pipetteren.

Voeg twee milliliter mTeSR1-medium met ROCK-remmer toe om de dissociatie te beëindigen. Meng de suspensie goed en breng deze over naar een 50 milliliter buisje. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 200 G.

Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer de cellen in twee milliliter mTeSR1-medium met ROCK-remmer. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en trypanblauw. Breng 800.000 tot 1 miljoen cellen over naar een 1,5 milliliter buisje voor elke nucleofectiereactie en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij 200 G.

Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant af. Meng drie microgram van de gepaarde Cas-9n single guide RNA expressieplasmiden en vijf microgram van de targeting vector plasmiden in 100 microliter gemengde nucleofectieoplossing uit het nucleofectiekit voor humane stamcellen. Bereid ook een GFP controleplasmidemix voor.

Resuspendeer de cellen met de DNA-mix en breng ze over naar een elektroporeringscuvet, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Elektroporeer de cellen met het nucleofectieapparaat met behulp van de geoptimaliseerde omstandigheden voor humane pluripotente stamcellen. Voeg onmiddellijk 500 microliter vers en warm mTeSR1-medium toe, aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer, aan de geëlektroporeerde cellen.

Breng vervolgens het mengsel over naar twee putjes van de eerder voorbereide 24-wellplaat. Plaats de plaat in een 37 graden Celsius incubator voorzien van 5% koolstofdioxide om de cellen te laten herstellen. Vervang het celonderhoudsmedium na 12 tot 16 uur, trek de ROCK-remmer terug als de cellen cel-celcontact maken.

Na 24 tot 48 uur controleert u de nucleofectie-efficiëntie door de GFP-expressie in de controlecellen te onderzoeken. Begin met het selecteren van cellen door het mTeSR1-medium aan te vullen met één microgram per milliliter puromycine, 48 uur na nucleofectie. Na 72 uur vult u het medium aan met 0,5 microgram per milliliter puromycine.

Als de cellenconfluency lager is dan 30%, vult u het medium ook aan met 10 micromolar ROCK-remmer. Vier tot zes dagen na nucleofectie passeer de puromycine-resistente cellen naar 10 tot 15 96-well platen met een concentratie van 0,8 cellen per putje. Zorg ervoor dat het medium wordt aangevuld met ROCK-remmer en puromycine.

Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius en 10% koolstofdioxide gedurende 10 tot 12 dagen om enkelcellige afgeleide kolonies te vormen. Vul het medium zeven dagen na het zaaien aan. Markeer putjes met een enkele kolonie en vervang het medium door vers mTeSR1-medium, dat 0,5 microgram per milliliter puromycine bevat, maar geen ROCK-remmer.

Laat de cellen nog twee dagen groeien bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Ververs vervolgens het medium voor putjes met ongedifferentieerde kolonies. Schraap voorzichtig de kolonies af en breng de celsuspensie van één kolonie over naar twee nieuwe putjes op afzonderlijke 96-well platen.

Een voor genotypering en een voor onderhoud. Zodra de confluency van de genotyperingcellen 50% of hoger is, gooit u het gebruikte medium weg en wast u de cellen eenmaal met DPBS. Lyseer de cellen met Bradley Lysis Buffer en isoleer genomisch DNA uit elk putje.

Na het uitvoeren van drie primer-junction PCR en het sequencen van de producten, bewaart u de kolonies met de juiste genotype en gooit u de rest weg. Breid de juiste kolonies uit onder continue selectie van puromycine en vriest u ze in bij de vroegst mogelijke passage. Dit protocol werd gebruikt om twee puntmutaties in Exon8 van het hepatocytennucleaire factor vier alfa-gen te introduceren.

Een PCR-methode met drie primers werd gebruikt om correct gerichte cellen te screenen en Sanger-sequencing werd uitgevoerd om de PCR-resultaten te bevestigen. Na het verwijderen van de selectiecassette werd de gemodificeerde regio opnieuw gesequenced om de correcte introductie van gewenste puntmutaties te bevestigen. Kolonieën met het juiste genotype werden geselecteerd en de cellen werden gekarakteriseerd voorafgaand aan verdere analyse.

De bewerkte cellen hebben dezelfde morfologie als de oudercellen en tonen representatieve humane pluripotente stamcelmarkers, waaronder transcriptiefactoren Nanog en Oct4, evenals celoppervlaktemarkers, SSEA-4 en TRA-160. Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om de cellenconfluency na selectie met puromycine gedurende de eerste