Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking
May 10th, 2020
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).
Het bewerken van genen in humane pluripotente stamcellen is een uitdaging. Dit protocol biedt de gedetailleerde procedure voor genoombewerking in deze cellen met behulp van een gepaarde Cas-90 case gecombineerd met de targeting vector. Het is betrouwbaar en gemakkelijk te volgen.
Het grote voordeel van dit protocol is dat het naadloze genomische bewerking is. De selectie in twee stappen helpt om het aantal doelwitten te verhogen en heeft het genotyperingsonderzoek efficiënter gemaakt. Onderhoud humane pluripotente stamcellen op recombinante laminine 21-gecodeerde oppervlakken in mTeSR1-medium.
De cellen moeten 70 tot 85% confluency bereiken, 72 uur na een splitsingsverhouding van één tot drie. Op de dag van de transfectie coat u voldoende putjes van een 24-wellplaat met 300 microliter van de laminine 521-oplossing en incubeer de plaat gedurende ten minste twee uur bij 37 graden Celsius. Verwijder na de incubatie voorzichtig de coatingoplossing en voeg onmiddellijk 300 microliter vers mTeSR1-medium toe, aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer in elk putje.
Plaats vervolgens de plaat terug in de incubator. Haal de stamcellen uit de incubator. Verwijder het gebruikte medium en was de cellen eenmaal met één milliliter steriele DPBS.
Voeg vervolgens één milliliter zacht celdissociatiereagens toe aan elk putje en incubeer het gedurende zes tot acht minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te dissociëren. Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen gemakkelijk loslaten. Gebruik vervolgens een P1000-tip om de cellen op te tillen door op en neer te pipetteren.
Voeg twee milliliter mTeSR1-medium met ROCK-remmer toe om de dissociatie te beëindigen. Meng de suspensie goed en breng deze over naar een 50 milliliter buisje. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 200 G.
Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer de cellen in twee milliliter mTeSR1-medium met ROCK-remmer. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en trypanblauw. Breng 800.000 tot 1 miljoen cellen over naar een 1,5 milliliter buisje voor elke nucleofectiereactie en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij 200 G.
Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant af. Meng drie microgram van de gepaarde Cas-9n single guide RNA expressieplasmiden en vijf microgram van de targeting vector plasmiden in 100 microliter gemengde nucleofectieoplossing uit het nucleofectiekit voor humane stamcellen. Bereid ook een GFP controleplasmidemix voor.
Resuspendeer de cellen met de DNA-mix en breng ze over naar een elektroporeringscuvet, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Elektroporeer de cellen met het nucleofectieapparaat met behulp van de geoptimaliseerde omstandigheden voor humane pluripotente stamcellen. Voeg onmiddellijk 500 microliter vers en warm mTeSR1-medium toe, aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer, aan de geëlektroporeerde cellen.
Breng vervolgens het mengsel over naar twee putjes van de eerder voorbereide 24-wellplaat. Plaats de plaat in een 37 graden Celsius incubator voorzien van 5% koolstofdioxide om de cellen te laten herstellen. Vervang het celonderhoudsmedium na 12 tot 16 uur, trek de ROCK-remmer terug als de cellen cel-celcontact maken.
Na 24 tot 48 uur controleert u de nucleofectie-efficiëntie door de GFP-expressie in de controlecellen te onderzoeken. Begin met het selecteren van cellen door het mTeSR1-medium aan te vullen met één microgram per milliliter puromycine, 48 uur na nucleofectie. Na 72 uur vult u het medium aan met 0,5 microgram per milliliter puromycine.
Als de cellenconfluency lager is dan 30%, vult u het medium ook aan met 10 micromolar ROCK-remmer. Vier tot zes dagen na nucleofectie passeer de puromycine-resistente cellen naar 10 tot 15 96-well platen met een concentratie van 0,8 cellen per putje. Zorg ervoor dat het medium wordt aangevuld met ROCK-remmer en puromycine.
Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius en 10% koolstofdioxide gedurende 10 tot 12 dagen om enkelcellige afgeleide kolonies te vormen. Vul het medium zeven dagen na het zaaien aan. Markeer putjes met een enkele kolonie en vervang het medium door vers mTeSR1-medium, dat 0,5 microgram per milliliter puromycine bevat, maar geen ROCK-remmer.
Laat de cellen nog twee dagen groeien bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Ververs vervolgens het medium voor putjes met ongedifferentieerde kolonies. Schraap voorzichtig de kolonies af en breng de celsuspensie van één kolonie over naar twee nieuwe putjes op afzonderlijke 96-well platen.
Een voor genotypering en een voor onderhoud. Zodra de confluency van de genotyperingcellen 50% of hoger is, gooit u het gebruikte medium weg en wast u de cellen eenmaal met DPBS. Lyseer de cellen met Bradley Lysis Buffer en isoleer genomisch DNA uit elk putje.
Na het uitvoeren van drie primer-junction PCR en het sequencen van de producten, bewaart u de kolonies met de juiste genotype en gooit u de rest weg. Breid de juiste kolonies uit onder continue selectie van puromycine en vriest u ze in bij de vroegst mogelijke passage. Dit protocol werd gebruikt om twee puntmutaties in Exon8 van het hepatocytennucleaire factor vier alfa-gen te introduceren.
Een PCR-methode met drie primers werd gebruikt om correct gerichte cellen te screenen en Sanger-sequencing werd uitgevoerd om de PCR-resultaten te bevestigen. Na het verwijderen van de selectiecassette werd de gemodificeerde regio opnieuw gesequenced om de correcte introductie van gewenste puntmutaties te bevestigen. Kolonieën met het juiste genotype werden geselecteerd en de cellen werden gekarakteriseerd voorafgaand aan verdere analyse.
De bewerkte cellen hebben dezelfde morfologie als de oudercellen en tonen representatieve humane pluripotente stamcelmarkers, waaronder transcriptiefactoren Nanog en Oct4, evenals celoppervlaktemarkers, SSEA-4 en TRA-160. Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om de cellenconfluency na selectie met puromycine gedurende de eerste
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor naadloze genbewerking in humane pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en Cas9 nickase-mutant. De methode introduceert met succes twee puntmutaties in de HNF4α-locus in menselijke embryonale stamcellen.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genbewerking
- Stamcellenbiologie
- Genomics
Achtergrond
- Genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen is complex.
- Gepaarde Cas9 nickase biedt een betrouwbare bewerkingsmethode.
- Naadloze genomische bewerking is voordelig voor nauwkeurige modificaties.
- Efficiënte genotyperingsscreening is cruciaal voor succesvolle bewerking.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor nauwkeurige genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen.
- Om specifieke mutaties in het HNF4α-gen te introduceren.
- Om de efficiëntie van het selecteren van bewerkte cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Onderhoud van stamcellen op recombinante laminine-oppervlakken.
- Nucleofectine van cellen met Cas9 en targeting vector-plasmiden.
- Gebruik van puromycine-selectie om met succes bewerkte cellen te isoleren.
- Genotypering en sequentiebepaling om succesvolle bewerkingen te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Twee puntmutaties werden met succes geïntroduceerd in de HNF4α-locus.
- Cellen behielden pluripotente kenmerken na bewerking.
- Efficiënte selectie- en genotyperingsmethoden werden vastgesteld.
- Bewerkte cellen drukten belangrijke pluripotente markeringen uit.
Conclusies
- Het protocol maakt nauwkeurige genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen mogelijk.
- Het biedt een basis voor het bestuderen van genfunctie en differentiatie.
- Toekomstige toepassingen omvatten het onderzoeken van specifieke genrollen in ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Seamless genome editing in human pluripotent stem cells enables precise interrogation of gene function and disease modeling at the earliest stages of drug discovery. The protocol's efficiency and reliability in introducing point mutations at the HNF4α locus support high-confidence target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical research, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise introduction of disease-relevant mutations for functional genomics studies.
- Supports robust target validation by generating isogenic cell lines with defined genetic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function in human cellular contexts.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined cell systems for assay development and compound screening.
- Ensures reproducibility and standardization through seamless editing and rigorous genotyping.
- Enables quantitative readouts by confirming precise genomic modifications via PCR and sequencing.
- Supports scalable generation of cell lines for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cell models with disease-relevant genotypes for translational biomarker studies.
- Maintains pluripotency and differentiation potential, supporting continuity into preclinical validation.
- Reduces biological risk by confirming genetic and phenotypic fidelity of edited lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated genetic models.
Pipeline & Workflow Integration
This genome editing protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless transition from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene modification.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell lines for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Provides robust genotyping and sequencing outputs for confident comparison of edited versus parental lines.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by generating models with disease-relevant mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating custom-edited pluripotent stem cell lines across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection, and molecular genotyping.
- Needs access to electroporation devices, high-quality plasmids, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell handling and selection protocols.
- Adaptation may be needed for different gene targets or cell line backgrounds.
- Cell viability and confluency must be closely monitored during selection and expansion phases.
