Fabricage van Zero Mode Waveguides voor hoge concentratie single molecule microscopie
12 mei 2020
Hier wordt een nanosfeerlithografiemethode beschreven voor parallelle fabricage van zero-mode golfgeleiders, die arrays van nanoapertures zijn in een met metaal beklede glazen microscopie coverslip voor beeldvorming met één molecuul bij nano- tot micromolarconcentraties van fluoroforen. De methode maakt gebruik van colloïdale kristal zelfassemblage om een waveguide sjabloon te maken.
Het nanosfeer litografie protocol dat hier wordt gepresenteerd voor het fabriceren van zero mode waveguides is een toegankelijke, goedkope methode die geen gespecialiseerde fabricagetools of faciliteiten vereist. Deze methode zal nuttig zijn voor biofysica op enkel molecuul niveau en zal meer onderzoekers in staat stellen om experimenten met enkele moleculen uit te voeren bij biologisch relevante concentraties van fluorescerende reagentia. Om een schone oppervlakte te creëren voor evaporatieve afzetting van colloïdale deeltjes, plaatst u optische borosilicaat glas dekglasjes in de gegroefde inzetstukken van een Coplin glas kleuringsvat.
Vul het kleuringsvat met genoeg aceton om de dekglasjes te bedekken en dek het vat af. Soniceer het vat gedurende 10 minuten op 40 graden Celsius. Giet het aceton eruit en spoel de dekglasjes drie keer met gedistilleerd water.
Na het herhalen van de sonicatie en aceton, vul het vat met genoeg kaliumhydroxide om de dekglasjes te bedekken. Soniceer het vat opnieuw, bedekt, gedurende 20 minuten op 40 graden Celsius. Spoel de dekglasjes zes keer met gedistilleerd water, en soniceer ze vervolgens gedurende 10 minuten in ethanol op 40 graden Celsius.
Na het wassen van de dekglasjes drie keer met gedistilleerd water, pakt u elk dekglas voorzichtig bij de rand met behulp van een pincet. Droog elk schoon, droog dekglas en plaats het in zijn eigen petrischaal. Centrifugeer 50 microliters van een micron niet-gefunctionaliseerde polystyreenkralen.
Gooi het supernatant weg, waarbij u zo min mogelijk water overlaat. Resuspendeer de kralen in 50 microliters oplosmiddel, en meng vervolgens grondig door middel van pipetteren. Om een vochtigheidskamer voor afzetting op te zetten, rangschikt u zes petrischalen in een rij.
Plaats één dekglas in elke petrischaal en laat de deksels lichtjes open staan met de dekglasjes gepositioneerd om blootgesteld te worden aan de omgeving. Plaats een hygrometer en een kleine elektrische ventilator centraal achter de petrischalen, en noteer vervolgens de relatieve luchtvochtigheid in het lab. Vul een 200 milliliter beker met 150 tot 200 milliliter water op ongeveer 75 graden Celsius en plaats de beker achter de ventilator.
Schakel de ventilator in en bedek vervolgens de petrischalen, ventilator, beker en hygrometer met een omgekeerde, transparante plastic opslagcontainer. Wanneer de relatieve luchtvochtigheid 70 tot 75% bereikt, heft u de plastic opslagcontainer lichtjes op en sluit u snel de deksels van de petrischalen om overbevochtiging van de dekglasjes te voorkomen. Wanneer de relatieve luchtvochtigheid in de kamer 85% bereikt, pipet 5 microliters van de kralensuspensie op het centrum van elk dekglas.
Dek elke petrischaal onmiddellijk na de afzetting af en houd alles bedekt door de opslagcontainer tussen de afzettingen door. Kralenafzettingen moeten zo snel mogelijk worden voltooid om het verlies van vochtigheid te minimaliseren. Als de afzettingen te droog of nat zijn, is de vochtigheid in de kamer de belangrijkste variabele om te optimaliseren.
Wanneer alle zes de afzettingen voltooid zijn, noteert u de relatieve luchtvochtigheid in de kamer en laat u de kraaldroplets zich verspreiden en drogen gedurende vijf minuten. Om een uniforme temperatuuroppervlakte te bieden voor het annelerende van de polystyreenkralen, plaatst u een platte, gemalen aluminium plaat bovenop een standaard keramische hotplate en stelt u de temperatuur van de hotplate in op 107 graden Celsius, de glastransitie temperatuur van polystyreen. Plaats een dekglas met het kraaltemplate op de hete aluminium plaat.
Na het 20 seconden annelerende, verwijdert u het dekglas van de aluminium plaat en plaatst u het onmiddellijk op een aluminium oppervlak op kamertemperatuur om af te koelen. Gebruik thermische evaporatieve afzetting om 300 nanometer koper te deponeren bij twee angstrom per seconde over dekglasjes met de kraaltemplates. Dit zal posten genereren in de tussenruimtes tussen de kralen.
Om het overtollige koper van de kralen te verwijderen, drukt u voorzichtig een stukje plakband op het oppervlak en trekt u het vervolgens langzaam af. Los de polystyreenkralen op door de dekglasjes in tolueen te plaatsen en ze een nacht lang te laten staan. Behandel de dekglasjes voorzichtig, spoel ze eenmaal af met chloroform en tweemaal met ethanol.
Droog de templates met stikstof. Plaats ze gedurende 30 minuten in een zuurstofplasma cleaner om resterend polymeer en verontreinigingen te verwijderen. Gebruik thermische evaporatieve afzetting om drie nanometer van een titanium adhesiegelaag te deponeren bij één angstrom per seconde, vervolgens deponeert u 100 tot 150 nanometer aluminium bij vier angstrom per seconde rond en bovenop de koperposten.
Zorg ervoor dat de monsters niet draaien tijdens de afzetting zoals automatisch wordt gedaan in sommige afzettingseenheden. Om de koperposten op te lossen, laat u de dekglasjes twee uur weken in koper etser. Na het spoelen van de dekglasjes in gedistilleerd water, droogt u ze met stikstof en polijst u het oppervlak voorzichtig met lenspapier om eventuele posten bloot te leggen die nog steeds bedekt zijn met cladding.
Laat de dekglasjes nogmaals twee uur weken in koper etser, spoel ze vervolgens weer af met gedistilleerd water en droog ze met stikstof. Na oppervlaktepassivatie kunnen zero mode waveguide dekglasjes worden gekoppeld met kwartsplaten met behulp van dubbelzijdige plakband om microfluïdische stromingskamers voor enkel molecuul beeldvorming te maken. Het succes van de zelf-assemblerende colloïdale template hangt kritiek af van de relatieve luchtvochtigheid.
In een goed gevormde template is het gebied van kralen circulair met randen gedefinieerd door een ondoorzichtige meerlagige ring. In goed gevormde templates moeten de meeste templates hexagonaal dicht gepakte kralen bevatten. Er zullen enkele defecten tussen de korrels zijn als gevolg van klemming tijdens de evaporatieve sedimentatie.
Na koperafzetting en oplossing van de polystyreenkralen, moeten koperposten kleiner zijn dan 150 nanometer in diameter. Voor een koperafzettingsdiepte van 300
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nanosfeer-lithografiemethode voor de parallelle fabricage van zero mode waveguides, wat single molecule imaging mogelijk maakt bij lage concentraties fluoroforen. De methode maakt gebruik van zelfassemblage van colloïdale kristallen om een waveguide-sjabloon op een glazen dekglasplaat te creëren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Biofysica
- Nanotechnologie
- Single-molecule imaging
Achtergrond
- Zero-mode waveguides zijn essentieel voor het bestuderen van enkelvoudige moleculen.
- Traditionele fabricagemethoden kunnen kostbaar zijn en vereisen gespecialiseerde instrumenten.
- Deze methode beoogt het proces te vereenvoudigen.
- Colloïdale zelfassemblage is een veelbelovende techniek voor het creëren van nanostructuren.
Doel van de studie
- Om een toegankelijke methode te presenteren voor het vervaardigen van zero mode waveguides.
- Om meer onderzoekers in staat te stellen experimenten met enkelvoudige moleculen uit te voeren.
- Om studies bij biologisch relevante concentraties van fluorescerende reagentia te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van optische borosilicaatglas dekglasjes.
- Sonicatie in aceton voor oppervlaktereiniging.
- Evaporatieve depositie van colloïdale deeltjes.
- Creatie van een golfleidertemplate voor beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- De methode is kostenefficiënt en vereist geen gespecialiseerde instrumenten.
- Het produceert effectieve golfgeleiders voor single-molecule imaging.
- Onderzoekers kunnen beeldvorming bereiken bij nano- tot micromolaire concentraties.
- Het protocol is eenvoudig en reproduceerbaar.
Conclusies
- Deze methode van nanosfeer-lithografie democratiseert de toegang tot technieken voor single-molecule imaging.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in de single-molecule biofysica.
- Toekomstige studies kunnen deze methode benutten voor diverse toepassingen in de biologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt single-molecule imaging mogelijk bij micromolaire fluorofoorconcentraties, waarmee een belangrijke beperking in biochemische assays wordt overwonnen waarbij achtergrondfluorescentie de bruikbare concentraties beperkt tot pico- tot nanomolaire bereiken. Door de studie van moleculaire processen bij cellulair-relevante concentraties en snelheden te faciliteren, ondersteunt het een fysiologisch relevantere targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. De toegankelijkheid van deze goedkope fabricagebenadering breidt het nut van zero mode waveguides uit voorbij gespecialiseerde kernfaciliteiten naar bredere biopharma R&D-laboratoria.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen en de verduidelijking van signaalpaden mogelijk door observatie van enkelvoudige moleculen bij concentraties die fysiologische ligandniveaus weerspiegelen.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van dure nanofabricageapparatuur, waardoor enzymologie op basis van enkelvoudige moleculen toegankelijk wordt voor meer onderzoeksteams.
- Voorspellend vertrouwen: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van interacties tussen enkelvoudige moleculen onder bijna-natuurlijke omstandigheden.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een platform voor het prepareren van gevalideerde biologische systemen die een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maken bij hogere, relevantere fluorofoorconcentraties.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door de parallelle fabricage van duizenden zero mode waveguides met behulp van gangbare laboratoriumapparatuur.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het hergebruik van het platform en de schaalbaarheid voor downstream screening-workflows door het genereren van uniforme waveguide-arrays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Faciliteert de studie van dynamische biochemische processen zoals transcriptie of translatie bij concentraties en snelheden die dichter bij die in de cel liggen, waardoor de relevantie voor ziektemodellen wordt verbeterd.
- Mechanische risicoreductie: Maakt observatie van single molecule FRET-signalen bij micromolaire concentraties mogelijk, wat onbereikbaar is met traditionele total internal reflection fluorescence (TERF) illuminatie.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt datagestuurde beslissingen door kwantitatieve single molecule read-outs te bieden die het mechanisme verduidelijken en ambiguïteit bij lead-optimalisatie verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot lead-identificatie, waardoor biofysische karakterisering mogelijk wordt die de selectie en optimalisatie van verbindingen informeert voorafgaand aan de preklinische evaluatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en biologische risicoreductie door directe observatie van het gedrag van individuele moleculen in complexe omgevingen mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare nanostructuren met kwantitatieve resultaten die vergelijkingen van ligandbinding of enzymatische activiteit onder verschillende condities mogelijk maken.
- Analytics: Biedt single-molecule fluorescentie- en FRET-metingen die kinetische en mechanistische inzichten met een hoge resolutie bieden die verder gaan dan ensemble-gemiddelden.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische relevantie door studies bij bijna-fysiologische concentraties en moleculaire crowding-condities mogelijk te maken.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een herbruikbare fabricagecapaciteit die tussen afdelingen gedeeld kan worden, waardoor de afhankelijkheid van externe nanofabricagediensten wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via directe visualisatie van enkelvoudige moleculen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid via parallelle fabricage met toegankelijke apparatuur zoals thermische evaporatoren en warmteplaten.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie en maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door betrouwbare biofysische gegevens eerder in de discovery-pipeline te genereren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door mechanistische helderheid te bieden, wat uitval in een laat stadium door onverwacht biologisch gedrag vermindert.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in colloïdale zelfassemblage, thermische verdamping en protocollen voor oppervlaktereiniging.
- Afhankelijk van toegang tot een thermische verdamper, warmteplaat, sonicator en basislaboratoriumuitrusting voor chemie voor metaaldepositie en etsen.
- Maakt standaardisatie van vochtigheidsgecontroleerde bead-depositie noodzakelijk om een consistente vorming van het golfgeleidertemplate te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende substraatmaterialen of golfgeleidermetalen (bijv. aluminium vs. goud).
- Omvat praktische beperkingen, zoals gevoeligheid voor de relatieve vochtigheid tijdens de zelfassemblage van de beads en de noodzaak van zorgvuldige hantering om template-defecten te voorkomen.
