Een high-throughput elektrochemiluminescentie 7-Plex-test die tegelijkertijd screent op type 1 diabetes en meerdere auto-immuunziekten
29 mei 2020
We modelleren een eenvoudige multiplexed ECL-test die 7 autoantilichaamtests samen combineert. De test is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere andere auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en auto-immuun polyglandulair syndroom 1.
Elektrochemiluminiscentie-assay kan tegelijkertijd screenen op type-1 diabetes en andere relevante auto-immuunziekten, inclusief auto-immuuncryo-ziekte, coeliakie en auto-immuun polyglandulair syndroom-1. De veel complexere ECR-assay combineert tot 10 meerdere antilichaam-assays in één kuip, wat resulteert in een hoge doorvoer, minder bibliotheken en een goedkopere assay die minder breed volume vereist. Het demonstreren van de procedure zal Xiaofan Jia zijn, een post van mijn laboratorium.
Om een gemengde linker-gekoppelde antigeenoplossing te bereiden, selecteert u eerst de optimale concentratie voor elk antigeen, gebaseerd op de checkerboard-assay, en verdunt u het biotine en ruthenium gelabelde antigeen tot de rationele werkconcentratie. Om verschillende linkers aan elk van de uniek gebiotineerde antigenen te binden, mengde u voor één 96-well gespeelde assay 240 microliter van een geschikte STREPTAVIDIN-geconjugeerde linker met 4 microliter van de biotinyleerde eiwitten van belang. Voeg vervolgens 156 microliter van 1%BSA per buis toe en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Aan het einde van de incubatie, voegt u 160 microliter stopoplossing toe aan elke buis en incubeert u de buizen gedurende nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, verwijdert u 400 microliter van het koppelingsantigen uit elke buis en trekt u alle zeven van de antigeensuspensies in één buis. Voeg vervolgens 1,2 milliliter stopoplossing en 4 microliter Ru sulfaat-NHS-gelabeld GAD65, TPO, tTg, ThG, Proinsulin interferon-alfa en IA-2 antigeen toe aan het mengsel.
Voordat u serummonsters incubeert met het gelabelde antigeenmengsel, voegt u 15 microliter serum per put toe aan een 96-well PCR-plaat, en mengt u 18 microliter van 0,5 molaire zure zuur met elke put serum voor een 45-minuten incubatie bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie, voegt u 35 microliter antigeen en 13 microliter van één molaire Tris-buffer per put toe aan een nieuwe 96-well PCR-plaat. Aan het einde van de incubatie, draagt u onmiddellijk 25 microliter van het zuurbehandelde serum over in elke put van de antigeenplaat.
Dek de plaat af met PCR-plafondfolie en plaats de plaat op een shaker met lage snelheid bij kamertemperatuur gedurende één uur. Aan het einde van de incubatie, plaatst u de plaat gedurende 18 tot 24 uur op 4 graden Celsius. Haal de plaat uit de koelkast en laat deze op kamertemperatuur komen.
Voeg vervolgens 150 microliter van 3% blocker A-buffer toe aan elke put. Wanneer alle putten zijn behandeld, dek de plaat af met plafondfolie en plaats de plaat een nacht in een koelkast van 4 graden Celsius. De volgende ochtend, draait u de plaat ondersteboven en wast u de monsters drie keer met 150 microliter PBS-T per put, per wasbeurt.
Dek de plaat af totdat er geen buffer meer in een van de putten aanwezig is. Voeg 30 microliter van serum-antigeen incubatie toe aan elke put. Wanneer alle incubaten zijn toegevoegd, dek de plaat af met folie en plaats de plaat op een shaker met lage snelheid gedurende één uur, bij kamertemperatuur.
Aan het einde van de incubatie, verwijdert u de incubaten door te klappen en wast u de putten drie keer met 150 microliter PBS-T per put, zoals gedemonstreerd. Voeg na de laatste wasbeurt 150 microliter leesbuffer toe aan elke put en lees de plaat op een plate-reader, in tellingen per seconde. In deze analyse van een grote groep monsters van 1026 nieuw gediagnosticeerde type-1 diabetespatiënten, werden de niveaus van auto-antilichamen van een zeven plus elektro-luminescentie-assay vergeleken met de niveaus van elke corresponderende gevestigde enkele elektro-luminescentie-assay en van elke overeenkomstige enkele standaard radiobindingstest en ELISA.
De specificiteit van de assay was identiek op de 99e percentiel voor alle auto-antilichaam-assays, behalve voor schildklierauto-antilichamen, waarvoor de 95e percentiel werd gebruikt. Een klein aantal discrepantiemonsters voor elk van de zeven auto-antilichamen werd gevonden rond de grens van de snijvlakken voor elke assay. Hier kunnen de corresponderende gegevens voor 1022 gezonde controles voor elke assay worden waargenomen.
Het belangrijkste om te onthouden is om een andere linker te vinden voor elk van de uniek gebiotineerde antigenen, en om elk antigeen te mengen met de eigenschappen om geconjugeerd linker te bieden. Deze assaytechniek zal onderzoekers in staat stellen om screening voor meerdere auto-immuunziekten tegelijkertijd te plannen in grote populaties en zal klinieken in staat stellen om gemakkelijk meerdere relevante ziekten met type-1 diabetes te screenen.
Overzicht
Deze studie presenteert een gemultiplexte elektrochemiluminescentie (ECL)-assay die gelijktijdige screening op Type-1 diabetes en diverse auto-immuunziekten mogelijk maakt. De assay combineert meerdere autoantilichaamtesten in één enkele put, waardoor de efficiëntie wordt verhoogd en de kosten worden verlaagd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Auto-immuniteit
- Diagnostiek
- Electrochemiluminescentie-assays
Achtergrond
- Type-1 diabetes (T1D) wordt vaak geassocieerd met andere auto-immuunziekten.
- Traditionele assays vereisen mogelijk meerdere tests, wat de tijd en kosten verhoogt.
- Multiplex-assays kunnen het diagnostische proces stroomlijnen.
- Elektrochemiluminescentie biedt een hoge sensitiviteit en specificiteit.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een gemultiplexte ECL-assay voor het screenen van T1D en verwante auto-immuunziekten.
- Het vergelijken van de prestaties van de gemultiplexte assay met gevestigde enkelvoudige assays.
- Het faciliteren van grootschalige screening in klinische omgevingen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van mengsels van oplossingen van aan linkers gekoppelde antigenen.
- Incubatie van serummonsters met gelabelde antigenen.
- Gebruik van een 96-wells plaatformaat voor high-throughput screening.
- Vergelijking van autoantistofspiegels in T1D-patiënten en gezonde controles.
Belangrijkste resultaten
- De gemultiplexte assay vertoonde een vergelijkbare specificiteit als enkelvoudige assays.
- Een klein aantal discordante monsters werd geïdentificeerd nabij de afkapwaarden.
- Er zijn gegevens verstrekt voor een grote cohort van nieuw gediagnosticeerde patiënten met T1D.
- Efficiënte screening voor meerdere auto-immuunziekten werd mogelijk gemaakt.
Conclusies
- De gemultiplexte ECL-assay is een levensvatbaar instrument voor simultane screening.
- Deze methode kan de diagnostische efficiëntie in de klinische praktijk verbeteren.
- Verdere validatie in grotere populaties wordt aanbevolen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De gelijktijdige detectie van meerdere autoantistoffen in één enkele put lost een kritieke flessenhals op bij grootschalige screening op auto-immuunziekten, waardoor de complexiteit van de assay en het verbruik van middelen worden verminderd. Deze gemultiplexte elektrochemiluminescentie-benadering verhoogt het voorspellende vertrouwen bij vroege ziekteidentificatie door gecorreleerde biomarker-uitlezingen te bieden voor diabetes type 1 en comorbide auto-immuunaandoeningen. De assay ondersteunt portfoliotriage en mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van immunotherapie door efficiënte patiëntenstratificatie mogelijk te maken op basis van multi-autoantistofprofielen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door autoantilichaamclusters te correleren met ziekte-endotypes in preklinische modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van antigeenspecifieke immuunresponsen in ziekterelevante systemen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetselectie door het identificeren van patiëntsubgroepen met convergente autoantilichaamsignaturen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde, kwantitatieve biomarkerpanels voor voor downstream screeningscampagnes die een hoge reproduceerbaarheid vereisen.
- Operationele waarde: Zorgt voor assay-gereedheid via geïmmobiliseerde antigeen-linkercomplexen die een consistente binding in de vloeistoffase over de wells waarborgen.
- Schaalbaarheid: Faciliteert het hergebruik van het platform voor het screenen van maximaal 10 autoantilichamen per well, waardoor de doorvoer wordt verhoogd zonder herformattering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door autoantilichamen te detecteren die gekoppeld zijn aan klinische progressie bij diabetes type 1 en comorbide auto-immuunziekten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door patiënten te identificeren met autoantilichaamprofielen met een hoge penetrantie die voorspellend zijn voor multi-orgaan auto-immuniteit.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit bij de interpretatie van immuunmechanismen door gelijktijdige meting van autoantilichamen tegen eilandjes, schildklier, darm en de interferonroute.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay fungeert als een brug van ontdekking naar translatie, waardoor vroege immuunfenotypering mogelijk wordt die via gemultiplexte autoantistofprofilering bijdraagt aan de fasen van leadidentificatie en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door co-expressiepatronen van autoantilichamen te koppelen aan pathogene routes bij auto-immuunpathogenese.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten die vergelijking van immuunresponsen over verschillende behandelcondities of genetische achtergronden mogelijk maken.
- Analytics: Biedt genormaliseerde 'counts per second' uitlezingen die statistische vergelijking van autoantilichaarniveaus tussen patiëntencohorten en controlegroepen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door biomarkerpanels te valideren in menselijke monsters die ziekte-geassocieerde immuundysregulatie weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar immunoassay-platform dat aanpasbaar is voor andere auto-immuun- of inflammatoire ziektepanels buiten de initiële 7-plex configuratie.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door het aantal fout-negatieven te verminderen via gelijktijdige autoantistofmeting.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door well-to-well variabiliteit te elimineren via geïmmobiliseerde antigeenpresentatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door zeven diagnostische tests te consolideren in één enkele workflowstap.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische kandidaten mogelijk op basis van door biomarkers gedefinieerde patiëntenpopulaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van immunoassays en linker-chemie voor antigeenimmobilisatie.
- Afhankelijk van een plaatlezer die in staat is tot elektrochemiluminescentie-detectie in 96-well formaat.
- Noodzaak tot standaardisatie van blokkeer- en wasprotocollen tussen verschillende locaties voor multicenterstudies.
- Vereist aanpassing van antigeenconcentraties bij uitbreiding naar nieuwe autoantilichaamtargets buiten de oorspronkelijke zeven.
- Beperkt door de noodzaak van geoptimaliseerde linker-antigeenparen om kruisreactiviteit in multiplexformaat te voorkomen.
