Name: Voorbereiding van celextracten door Cryogrinding in een geautomatiseerde vriesmolen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Leer cryogene cellysate van gist bereiden met een geautomatiseerde vriesmolen bij -196°C. Deze methode behoudt eiwitintegriteit en minimaliseert denaturatie voor functionele biochemische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in het Gunjan lab wordt ondersteund door financiering van de National Institutes of Health, National Science Foundation en het Florida Department of Health. Wij danken student John Parker voor technische bijstand.

1. Bereiding van gist popcorn
<ol><li>Kweek gistcellen in 0,5 L YPD-media tot een dichtheid van 1 x 107 cellen/mL. Tel cellen met behulp van een Coulter Counter of een andere manier.</li>
	<li>Centrifugecellen gedurende 10 minuten bij 2.400 g en 4 °C.</li>
	<li>Was elk monster één keer met 500 mL ijskoud gedeïmiseerd 18 mega Ohm Milli-Q water.</li>
	<li>Resuspend pellets in 15 mL ijskoude Lyse Buffer [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycerol, met vers toegevoegde reduceermiddel 10 mM β-mercaptoethanol, proteaseremmerscocktail, 10 μM proteasome inhibitor MG-132, 1 mM deacetylase inhibitor natrium butyrate en fosfataseremmers (1 mM natrium vanadate, 50 mM natriumfluoride, 50 mM natrium β-glycerofosfat)]. Zie de tabel met materialen voor meer informatie. Houd geresuspended cellen op ijs totdat de monsters klaar zijn voor de volgende stap. OPMERKING: Op basis van de downstreamtoepassing kan een breed scala aan lysisbuffers worden gebruikt die een aantal niet-ionische detergentia bevatten. Opname van protease en proteasomale remmers zijn cruciaal voor het voorkomen van eiwitafbraak, vooral zodra de extracten ontdooid zijn.</li>
	<li>Maak snap bevroren gist popcorn door langzaam toe te voegen van de cel suspensie een druppel per keer met behulp van een voorgekoelde serologische pipet in een of meer 50 mL centrifuge buizen bewaard op droog ijs en gevuld met LN2 tot net onder de velg. Herladig regelmatig vloeibare stikstof in de buis om het verlies als gevolg van snelle verdamping te compenseren. Werk in een goed geventileerde ruimte om de gevaren van stikstofverstikking te voorkomen.<ol>
<li>In plaats van een 50 mL buis, gebruik meerdere 50 mL buizen aan elkaar gebonden (of een container met een grote mond, zoals een grote plastic centrifuge fles die cryogene temperaturen kan verdragen) voor pop-maïs voorbereiding(Figuur 1A). Hoe groter de container en de opening, hoe makkelijker is de popcorn voorbereiding als dit voorkomt dat klonteren van de popcorn om grote aggregaten te vormen. Een grootte bereik van 0,3-0,5 cm voor de popcorn is ideaal voor het bereiken van een goede slijpen / verpulveren met behulp van de vriesmolen (Figuur 1B).</li>
		<li>Zorg ervoor dat de LN2 volledig is verdampt uit de buisjes die de popcorn bevatten voordat u ze op -80 °C opslaat. Het is mogelijk om te stoppen na de voorbereiding van de gist popcorn als ze stabiel zijn voor meerdere jaren wanneer gehandhaafd op -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> Figuur 1: Gist popcorn voorbereiding. (A) Gist "popcorn" wordt gemaakt door de dropwise bevriezing van de cel suspensie in LN2. We gebruiken een tot drie 50 mL buizen bij elkaar gehouden met een elastiekje en geplaatst in een ijsemmer gevuld met droogijs. De buizen zijn gevuld met LN2 tot net onder hun velgen en zijn aangevuld met vloeibare stikstof vaak om ze bijna vol totdat alle cel suspensie was gemaakt in popcorn(B) De grootte van de popcorn is een belangrijke determinant van optimale slijpefficiëntie. Het groottebereik van de popcorn moet tussen 0,3 en 0,5 cm in diameter liggen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
2. Cryogrinding
<ol><li>Om te beginnen, zorg ervoor dat er voldoende LN2 beschikbaar is om de vriesmolen te koelen, flacons te malen, te leveren en de machine voor alle monsters te bedienen. Voor minder dan vijf monsters moet 30-35 L LN2 volstaan. Vul de vriesmolenkamer met LN2 tot aan de vullijn. WAARSCHUWING: Alle stappen met betrekking tot LN2 moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte en de vriesfabriek zelf moet zich in een dergelijk gebied bevinden om verstikkingsgevaar te voorkomen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder goed schoeisel, labjas, veiligheidsbril, een basislaag van nitrilhandschoenen, dan thermische handschoenen, gevolgd door een ander paar nitrilhandschoenen. Wees uiterst voorzichtig bij het hanteren van LN2.</li>
	<li>Sluit het deksel van de vriesmolen langzaam, vermijd de plons van LN2 en laat een paar minuten voor de machine afkoelen. Het kan nodig zijn om de kamer bij te vullen met LN2 om het verlies als gevolg van verdamping te compenseren alvorens door te gaan naar de volgende stap. OPMERKING: Vul LN2 indien nodig alleen tot aan de vullijn. Vul de kamer niet te veel, omdat dit zowel gevaarlijk als schadelijk voor de machine kan zijn. Geautomatiseerde navulsystemen zijn beschikbaar voor vriesfabriek die de verdampende LN2 kan aanvullen, indien nodig rechtstreeks vanuit een opslagtank die is aangesloten op de vriesfabriek.</li>
	<li>Pre-chill de grote slijpen flacons en de magnetische impactor bar door ze te dunken in LN2 bewaard in een aparte kleine dewar. Decanteer alle LN2 wanneer de LN2 stopt borrelen. Voeg vervolgens het monster / gist popcorn aan de slijpen flacon en sluit het strak met de twee roestvrij stalen eindpluggen.<ol>
<li>Vul niet meer dan een derde van de slijpbladje met het monster, omdat dat de efficiëntie van het slijpen kan verminderen. In plaats daarvan kunnen grotere monsters worden verwerkt door ze in twee of meer flesjes te verdelen en ze achtereenvolgens te slijpen. Kleinere slijpbladeren kunnen worden gebruikt voor kleinere monsters (tot 3 mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de slijpbladl in de vrieskamer en sluit deze op zijn plaats. Sluit het deksel.</li>
	<li>Voor ontluikende gist, maal de monsters voor een totaal van drie cycli voor 2 min / cyclus (met 2 min pauze voor het koelen tussen cycli) met een verpletterende snelheid van 14. Wanneer de machine stopt na het voltooien van de cycli, open de vriezer molen deksel langzaam en voorzichtig ontgrendelen van de flacon met de in poedervorm bevroren cel lysate en verwijder het uit de vriesmachine. Als meerdere kleine flesjes worden gebruikt, werk dan snel om één flesje tegelijk te verwijderen en plaats ze in droogijs. OPMERKING: Het is meestal niet nodig om de slijpparameters aan te passen bij het gebruik van flesjes van verschillende grootte met hetzelfde type monster. De slijpparameters, zoals het aantal cycli en de slijpsnelheid, moeten echter empirisch worden bepaald voor verschillende monstertypen, afhankelijk van het gemak waarmee ze lyse. De meeste zoogdiercellen en zachte weefsels zullen lyse in 1-2 cycli met een verpletterende snelheid van 10. Moeilijker om monsters zoals bacteriën, gist, vlieglarven en volwassen fruitvliegjes te lyse vereisen 3-6 cycli tegen de maximale snelheid, terwijl harde weefsels zoals bot, tanden, enz. Een kleine aliquot van het ontdooide monster kan worden bekeken onder de microscoop voor en na het malen om het aantal intacte, ongelyseerde cellen te tellen om de lyse-efficiëntie te bepalen. Een uitstekende analyse van de impact van cryogrinding parameters op het vrijkomen van eiwitten en DNA van ontluikende gist is eerder gepubliceerd15.</li>
	<li>Werken snel om niet toe te staan het monster te ontdooien, zorgvuldig losschroeven een van de eindstukken (kies degene die lijkt te zijn geworden enigszins los tijdens het slijpen) met behulp van de opening tool. Gebruik vervolgens een paar lange tangen (die vooraf zijn gekoeld in een emmer met droogijs) om de impactor bar te verwijderen. Verzamel het verpulverde monster door het slijpfblad om te keren en op een polystyreen weegschaal voorgekoeld met LN2 te tikken en op droog ijs te houden.</li>
	<li>Zodra alle bevroren cellysaat in poedervorm uit de maalblad is teruggewonnen, giet je het poedervormige lysaat uit de weegschaal terug in de 50 mL buis en ga je meteen door naar de langzame ontdooiingsstap die hierna wordt beschreven voor de beste resultaten. Als alternatief u het bevroren poedervormige lysaat 's nachts opslaan bij -80 °C, hoewel dit kan leiden tot enige degradatie.</li>
	<li>Bereid een ijsemmer met een 50% drijfmest van ijs en water en leg deze op een roerplaat met een magnetische roerder. Dompel een draadrek of een ander geschikt rek in de ijsdrijfmest onder om de monsters vast te houden.<ol>
<li>Ontdooi vervolgens langzaam de monsters op een ijsdrijfmestbad met constante agitatie van de drijfmest met behulp van een magnetische roerder. Voeg meer ijs toe om het smeltende ijs te vervangen (het kan nodig zijn om wat water weg te gooien om te voorkomen dat de ijsemmer overloopt). Aangezien verschillende remmers een korte halveringstijd hebben in waterige buffers, voeg extra proteaseremmercocktail (zie Tabel van Materialen)en 10 μM proteasome remmer MG-132 toe aan het lysaat zodra de monsters beginnen te ontdooien (na ongeveer 30 min).</li>
		<li>Verwijder ijs gevormd aan de buitenkant van de buizen om de 5 minuten om het ontdooien proces te versnellen. Houd er rekening mee dat snelle ontdooiing van de monsters bij kamertemperatuur of hoger kan leiden tot aanzienlijke afbraak.</li>
	</ol></li>
	<li>Nadat de monsters volledig ontdooid zijn (het kan meer dan een uur duren, afhankelijk van de hoeveelheid monster), centrifuge het lysaat op ~ 3.220 g gedurende 20 minuten in een gekoelde tafelblad centrifuge bij 4 °C om het grootste deel van het celpuin uit het lysaat te verwijderen.</li>
	<li>Breng de supernatant over op 50 mL polycarbonaatcentrifugebuizen die voorgekoeld zijn op ijs en vercentrifugeer de monsters gedurende 20 minuten bij 4 °C op 16.000 g (zie tabel met materialen).</li>
	<li>Breng alleen de heldere supernatant bestaande uit het verduidelijkte hele celextract uit het midden van de vloeibare kolom in de buis heel langzaam en zorgvuldig over, zonder de troebele lipidelaag(figuur 2)in een gekoelde buis van 15 mL met voorgekoelde serologische pipetten te verstoren. Vermijd het verwijderen van alle lysaat in de centrifuge buis om overdracht van lipiden en puin te voorkomen. Het restant lysaat in de centrifugebuis kan meerdere keren worden gecentrifugeerd om kleine hoeveelheden extract na elke spin terug te vorderen. OPMERKING: Lipiden samen met eventuele gedenatureerde eiwitten zou lijken troebel / melkachtig en bevinden zich aan de bovenkant van de vloeistof / lucht-interface, en af en toe boven de pellet zelf dat bestaat uit onoplosbare cellulaire puin (Figuur 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> Figuur 2: Haal lagen in een centrifugebuis. De belangrijkste zichtbare kenmerken van het hele celextract in een buis na centrifugatie bij 16.000 g gedurende 20 min worden aangegeven. De relatieve overvloed van elke functie is afhankelijk van het monstertype, de groeifase van de cellen (exponentieel versus stationair), de hoeveelheid lysebuffer die wordt gebruikt om cellen opnieuw op te hoogte houden en de lyse-efficiëntie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="12"><li>Centrifugeer de resterende lysaat gedurende 5 minuten om meer van het extract te herstellen. Herhaal deze 5 minuten centcentrifugatie meerdere keren indien nodig om zo veel van het duidelijke extract mogelijk te herstellen. Gooi het troebele lysaat met lipiden dicht bij de bodem van de buis in de buurt van de pellet.</li>
	<li>Gebruik deze extracten voor downstream toepassingen zoals eiwitcomplexe zuivering, immunoprecipitatie en proteomische analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li>
<li>Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+B+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 13, Unit 13 (2001).</li>
<li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li>
<li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li>
<li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Archives+of+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li>
<li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Techniques%22%5BJournal%5D)">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+yeast+mitochondrial+DNA+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).</li>
<li>Bzducha-Wróbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+%CE%B2-glucan+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li>
<li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+sampling+of+dental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the sampling of dental DNA.</a> Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).</li>
<li>Sweet, D., Hildebrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+human+teeth+by+cryogenic+grinding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding.</a> Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+%28P.+taeda+L.%29+and+other+conifer+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).</li>
<li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li>
<li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li>
<li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295(2012).</li>
<li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li>
<li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li>
<li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments%3A+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li>
<li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).</li>
<li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101(2014).</li>
<li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li>
<li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li>
<li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS%2FMS+determination+in+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li>
<li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li>
<li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+method+for+the+determination+of+copper%2C+manganese+and+iron+in+seafood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Composition+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li>
<li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+B-Atomic+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li>
<li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sr-87%2FSr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley%3A+Implications+for+early+hominid+habitat+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+Et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li>
<li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka%5BTitle%5D)+AND+%22Geology%22%5BJournal%5D)">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een beperking van het bestuderen van inheemse eiwitten uit gist is de inefficiënte lyse van gistcellen als gevolg van hun taaie celwand. Hoewel verschillende methoden zijn ontwikkeld, de meest consistente en efficiënte methode in onze handen is de cryogrinding van gistcellen flash bevroren als popcorn. Deze methode maakt de betrouwbare voorbereiding van hoogwaardige hele cel extracten uit ontluikende gist in vergelijking met andere lyse methoden. De representatieve resultaten toonden aan dat cryogrinding superieur is aan...

Gist is een populair model organisme voor eiwitstudies, want het is een eenvoudig eukaryotisch organisme met een overvloed aan genetische en biochemische hulpmiddelen beschikbaar voor onderzoekers1. Door hun stevige celwand is een uitdaging waar onderzoekers voor staan om de cellen efficiënt te lyseren zonder de cellulaire inhoud te beschadigen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het verkrijgen van eiwitextracten door verstoring van gistcellen, waaronder enzymatische lyse (zymolyase)2,3, chemisch lysis4, fysisch lyse door vries-dooi5, drukgebaseerd (Franse pers)6,7, mechanisch (glazen kralen, koffiemolen)8,9, sonicatiegebaseerde10 en cryogene2,11. De efficiëntie van cellyse en de eiwitopbrengst kan sterk variëren afhankelijk van de gebruikte techniek, wat het eindresultaat of de geschiktheid voor de gewenste downstream-toepassing voor het lysaat beïnvloedt. Bij het bestuderen van eiwitten die instabiel zijn, vluchtige posttranslational wijzigingen hebben, of temperatuurgevoelig zijn, is het bijzonder belangrijk om een methode te gebruiken die monsterverlies of afbraak tijdens de voorbereiding minimaliseert.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Extractpreparaattechniek</td>
			<td>Details</td>
			<td>Voordelen</td>
			<td>Nadelen</td>
			<td>Downstream-analyse</td>
			<td>Verwijzing</td>
		</tr><tr><td>Franse pers: Hogedrukhomogenisator (aka Microfluidizer) met enzymatische voorbehandeling met Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, een Microfluidizer hogedrukhomogenisator. De disruptor bestaat uit een luchtaangedreven hogedrukpomp (verhouding 1:250; vereiste luchtdruk 0,6-l MPa) en een speciale storingskamer met een extra terugdrukeenheid. Voor de verwerking is een minimale steekproefgrootte van 20 mL vereist.</td>
			<td>De uiteindelijke totale verstoring die werd verkregen met behulp van het gecombineerde protocol naderde 100 % met 4 passen bij een druk van 95 MPa, in vergelijking met slechts 32 % verstoring met 4 passen op 95 MPa met alleen homogenisatie zonder de Zymolyase.</td>
			<td>Niet geschikt voor kleinschalige toepassingen. De enzymen kunnen duur worden voor grootschalige preparaten.</td>
			<td>Eiwitzuivering</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Kraalklopper: Zymolyase behandelde cellen met glazen kralen in een fastprep-instrument</td>
			<td>Ongeveer een gelijk volume van koude, droge, zuur gewassen 0,5 mm glazen kralen wordt toegevoegd aan een bepaald volume van de cel pellet in lyse buffer en de cellen worden verstoord door krachtige handmatige agitatie.</td>
			<td>Het is vooral handig bij het maken van extracten uit veel verschillende kleine gistculturen voor testdoeleinden in plaats van voor eiwitzuivering.</td>
			<td>Tijdens de glaskraalprocedure worden eiwitten hard behandeld, waardoor uitgebreid schuimen leidt tot eiwitdenaturatie. De hoeveelheid celbreuk varieert, terwijl proteolyse en modificatie van de eiwitten het gevolg kunnen zijn van het verwarmen van het extract boven de 4°C tijdens de mechanische breuk.</td>
			<td>Meestal DNA & RNA-analyses, maar ook eiwitanalyse door het denatureren van gelelektrofe, met of zonder westerse blotting.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Zymolyase behandeling gevolgd door lyse met behulp van een combinatie van osmotische shock en Dounce homogenisatie</td>
			<td>Na enzymatische vertering van celwanden worden spheroplasten lysed met 15 tot 20 slagen van een nauwsluitende stamper (klaring 1 tot 3 μm) in een Dounce homogenisator.</td>
			<td>Voordelig om protease-deficiënte stammen zoals BJ926 of EJ101 te gebruiken. Dit is de zachtste manier om gistcellen te breken en daarom is het het meest geschikt voor het voorbereiden van extracten die complexe enzymatische functies kunnen uitvoeren (bijvoorbeeld vertaling, transcriptie, DNA-replicatie) en waarin de integriteit van macromoleculaire structuren (bijvoorbeeld ribosomen, splicesomen) moet worden gehandhaafd. Het is ook nuttig voor het isoleren van intacte kernen die kunnen worden gebruikt voor chromatinestudies (Bloom and Carbon, 1982) of voor nucleaire eiwitextracten (Lue en Kornberg, 1987).</td>
			<td>De belangrijkste nadelen van de spheroplast lyse procedure zijn dat het relatief vervelend en duur, vooral voor grootschalige preparaten (>10 liter), en de lange incubatieperioden kan leiden tot proteolyse of eiwit modificatie.  Voor chromatinepreparaten lijken ze van verschillende of lagere kwaliteit te zijn dan die welke door de differentiële centrifugatie worden geproduceerd (gebaseerd op nucleosoomladderintegriteit).</td>
			<td>Het isoleren van intacte kernen voor chromatinestudies, extracten die complexe enzymatische functies kunnen uitvoeren, extracten die de integriteit van macromoleculaire structuren, nucleaire eiwitextracten.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Cel verstoring van flash bevroren cellen door slijpen in vloeibare stikstof met behulp van een mortier / stamper of een blender</td>
			<td>Cellen worden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens lysed door handmatig slijpen in een mortel met behulp van een stamper, of met behulp van een Waring blender in de aanwezigheid van vloeibare stikstof.</td>
			<td>Het protocol is snel en eenvoudig. Het is geschikt voor verschillende hoeveelheden gistcellen, waaronder zeer grote culturen. Het belangrijkste voordeel is dat cellen onmiddellijk uit de actief groeiende toestand in vloeibare stikstof (−196°C) worden genomen, afnemende degradatieve enzymactiviteiten zoals proteasen en nucleases, evenals activiteiten die eiwitten wijzigen (bijvoorbeeld fosforsataden en kinases). Het is bijzonder geschikt voor het maken van hele cel extracten uit een enkele gistcultuur voor grootschalige eiwitzuivering.</td>
			<td>Een beetje rommelig en potentieel gevaarlijk voor de onzorgvuldige onderzoeker. Kleine monsters (d.w.z. 10- tot 100-ml gistculturen) worden niet gemakkelijk verwerkt omdat er niet genoeg massa bevroren celklontjes zijn om effectief in de blender te breken. Het is tijdrovend om individuele monsters te verwerken en de apparatuur tussen het gebruik door schoon te maken.</td>
			<td>Hele cel extracten uit een enkele gistcultuur voor grootschalige eiwitzuivering.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolyse, Parelmolen</td>
			<td>pH 5,0, 50 °C, 24 uur, 200 tpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Snelle en efficiënte lysis, vooral voor kleinschalige extractvoorbereiding</td>
			<td>Warmteopwekking leidt tot denaturatie en afbraak van macromoleculen. Kraal slaan apparatuur vereist.</td>
			<td>Kleinschalige analyses.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolyse, Sonicatie</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 tpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, vermogen 80%</td>
			<td>Sonicatie apparatuur is meestal beschikbaar in de meeste instellingen.</td>
			<td>Warmteopwekking leidt tot denaturatie en afbraak van macromoleculen. Sonicatie-apparatuur vereist. Langzaam lysis kan meer dan 24 uur duren.</td>
			<td>Gistcelwandpreparaten.</td>
		</tr><tr><td>Kokend en vriesdooiproces</td>
			<td>Geen gespecialiseerde apparatuur nodig, andere dan een standaard vriezer en een verwarmingsblok of warmwaterbad.</td>
			<td>Efficiënt, reproduceerbaar, eenvoudig en goedkoop.</td>
			<td>Warmteopwekking leidt tot denaturatie en afbraak van macromoleculen.</td>
			<td>DNA-analyses door PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Vergelijking van de beschikbare methoden voor de bereiding van gistextracten.
Cryogrinding (ook bekend als cryogene slijpen / cryogene frezen) wordt vaak gebruikt om nucleïnezuren, eiwitten of chemicaliën te halen uit temperatuurgevoelige monsters op een betrouwbare manier voor kwantitatieve of kwalitatieve analyses. Het is met succes gebruikt voor meerdere toepassingen op verschillende gebieden, waaronder biotechnologie, toxicologie, forensische wetenschap12,13, milieuwetenschappen, plantenbiologie14 en voedingswetenschap. Isolatie van intacte biologische macromoleculen is meestal van cruciaal belang voor de temperatuur. Extreem lage temperaturen zorgen ervoor dat de proteases en nucleases inactief blijven, wat resulteert in een betrouwbare isolatie van intacte eiwitten, nucleïnezuren en andere macromoleculen voor latere analyses. Een vriesfabriek houdt meestal een monstertemperatuur van -196 °C (het kookpunt van LN2),waardoor DNA/RNA of eiwitdenaturatie en -afbraak tot een minimalisering en afbraak worden geminimaliseerd.
De vriesmolen maakt gebruik van een elektromagnetische slijpkamer die snel een stevige metalen staaf of cilinder heen en weer beweegt in een flacon met het monster dat moet worden verpulverd tussen roestvrijstalen eindpluggen. Het instrument creëert en keert snel een magnetisch veld in de slijpkamer. Terwijl het magnetisch veld heen en weer verschuift, verplettert de magneet het monster tegen de pluggen en bereikt zo het 'cryogrinding' en de verpulvering van de popcorn. De vriesmolen vervangt de mortel en stamper en maakt de sequentiële verwerking van meerdere monsters (of tot 4 kleinere monsters tegelijk) met een hoge reproduceerbaarheid mogelijk en vermijdt de variabiliteit van gebruiker tot gebruiker in verband met handmatig slijpen. Zodra de monsters zijn verwerkt, kunnen de celextracten worden gebruikt voor een verscheidenheid aan downstream-toepassingen.

<table><tbody><tr><td>50 mL polycarbonate tubes with screw caps</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Centrifuge tubes</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>Gist YPD-media component</td></tr><tr><td>BD Bacto Yeast Extract</td><td>BD Biosiences</td><td>212750</td><td>Gist YPD-media component</td></tr><tr><td>Beckman Avanti centrifuge</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Hogesnelheidscentrifuge</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-Dextrose Anhydrous</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td>Gist YPD-media component</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Zwingende emmer rotor</td></tr><tr><td>Eppendorf koelcentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Gekoelde centrifuge</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Volume uitsluiting en cryoprotectant</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HIS6 antilichaam</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>Antilichaam voor HIS-tag</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>Zout voor het handhaven van ionische sterkte</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Proteasome Inhibitor</td></tr><tr><td>Fosfatase remmer cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Fosfatase remmer cocktail</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td>Eiwitvlek</td></tr><tr><td>Protease remmer cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>Protease remmer cocktail</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Sodium Butyrate</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Histone Deacetylase Inhibitor</td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Fosfatase Inhibitor</td></tr><tr><td>Sodium Vanadate</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Fosfatase Inhibitor</td></tr><tr><td>Sodium &beta;-glycerophosphate</td><td>Alfa Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Fosfatase Inhibitor</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 vriesmolen</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>6850</td><td>Vriesmolen</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>Voor het trekken van HIS gelabelde eiwitten</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Nionogene detergent</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>Reductiemiddel</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van celextracten door cryogrinding in een geautomatiseerde vriesmolen

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Het gemak van genetische manipulatie en de sterke evolutionaire instandhouding van eukaryotische cellulaire machines in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae heeft het een vooraanstaande genetische model organisme. Aangezien een efficiënte eiwitisolatie echter afhankelijk is van een optimale verstoring van cellen, wordt het gebruik van gist voor biochemische analyse van cellulaire eiwitten belemmerd door de celwand, die duur is om enzymatisch te verteren (met behulp van lyticase of zymolyase), en moeilijk mechanisch te verstoren (met behulp van een traditionele kraalklopper, een Franse pers of een koffiemolen) zonder verwarming van monsters te veroorzaken, wat op zijn beurt eiwitdenaturatie en afbraak veroorzaakt. Hoewel het handmatig slijpen van gistcellen onder vloeibare stikstof (LN2) met behulp van een mortel en stamper oververhitting van monsters voorkomt, is het arbeidsintensief en onderhevig aan variabiliteit in cellyse tussen operatoren. Al vele jaren bereiden we met succes gistextracten van hoge kwaliteit met cryogrinding van cellen in een geautomatiseerde vriesfabriek. De temperatuur van -196 °C bereikt met het gebruik van LN2 beschermt het biologische materiaal tegen afbraak door proteasen en nucleases, waardoor het ophalen van intacte eiwitten, nucleïnezuren en andere macromoleculen mogelijk is. Hier beschrijven we deze techniek in detail voor ontluikende gistcellen waarbij eerst een suspensie van cellen in een lysebuffer wordt bevroren inbeslagneming in LN2 om bevroren druppels cellen te genereren die bekend staan als "popcorn". Deze popcorn wordt vervolgens verpulverd onder LN2 in een vriesmolen om een bevroren "poeder" extract dat langzaam ontdooid en verduidelijkt door centrifugatie te verwijderen onoplosbare puin te genereren. De resulterende extracten zijn klaar voor downstream toepassingen, zoals eiwit- of nucleïnezuurzuivering, proteomische analyses of co-immunoprecipitatiestudies. Deze techniek is op grote schaal toepasbaar voor celextractberedeiding uit verschillende micro-organismen, planten- en dierlijk weefsels, mariene specimens, waaronder koralen, en het isoleren van DNA/RNA uit forensische en permafrostfosiele specimens.

We vergeleken twee verschillende methoden voor gistcellyse, namelijk glaskraalfrezen bij 4 °C en een geautomatiseerde cryogrindingmethode bij -196 °C, om de relatieve hersteleiwitten in de celextracten te beoordelen die met beide methoden zijn bereid. Voor deze studie hebben we ervoor gekozen om een ontluikende giststam YAG 1177 te gebruiken (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ura3 ura3ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])<sup class="x...

We beschrijven een betrouwbare methode voor de bereiding van hele celextracten uit gist of andere cellen met behulp van een cryogene vriesmolen die afbraak en denaturatie van eiwitten minimaliseert. De celextracten zijn geschikt voor zuivering van functionele eiwitcomplexen, proteomische analyses, co-immunoprecipitatiestudies en detectie van labiele eiwitmodificaties.

Voorbereiding van celextracten door Cryogrinding in een geautomatiseerde vriesmolen

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Gist is populair model organisme, niet alleen voor genetische studies, maar ook voor biochemische studies van eiwitten en andere macromoleculen gewonnen uit wilde type en mutant gist stammen. Echter, als gevolg van hun taaie celwanden, een grote uitdaging die onderzoekers gezicht is deze efficiënte lysis van gistcellen zonder beschadiging van de cellulaire inhoud. De isolatie van intacte biologische macromoleculen is meestal van cruciaal belang, afhankelijk van de temperatuur.Het voorbereiden van de extracten bij lage temperatuur zorgt ervoor dat de intracellulaire proteasen en nucleases inactief blijven, wat resulteert in een betrouwbare isolatie van intact eiwit, nucleïnezuren en andere macromoleculen voor voldoende lyse. Verschillende methoden zijn beschikbaar voor het verkrijgen van gistextracten door middel van enzymatische, chemische en fysische lyse. Enzymatische lyse is echter duur vanwege de eis van gezuiverde enzymen om de celwand te verteren, waardoor het gebruik van een kleiner aantal cellen wordt beperkt.Verder moeten de enzymatische reacties nauwlettend worden gevolgd om over spijsvertering en voortijdige lysis van de cellen te voorkomen. Chemische methoden met behulp van sterke denaturerende stoffen, hoewel effectief, resulteren in de denaturatie van eiwitten en als zodanig, zijn niet geschikt voor de isolatie van eiwitcomplexen of functionele enzymen. Fysieke methoden, zoals lyse onder hoge druk in een Franse pers kan worden uitgevoerd in de kou op vier Celsius, maar dat is niet koud genoeg om afbraak en denaturatie van alle inheemse eiwitten te voorkomen.Andere populaire fysieke methoden zijn het gebruik van een mortier en stamper, blender, of koffiemolen om gistcellen te malen resuspended in een lyse buffer en bevroren als druppels of slijpen en mengsel van glas kralen en gist in een snelle prep kraal klopper molen of een lyse door sonicatie. Echter, handmatig slijpen is arbeidsintensief en de resulterende eiwitopbrengst kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de technieken die worden gebruikt, terwijl lysis door sonicatie of slijpen in een blender, koffiemolen, of kraal klopper molen genereert een aanzienlijke hoeveelheid warmte, wat resulteert in een eiwit denaturatie en afbraak. Daarom is het essentieel om gistcellyse met eiwitten in hun eigen staat te verkrijgen met minimale denaturatie en afbraak voor toepassingen zoals zuiveringen van functionele eiwitcomplexen, biochemische testen of detectie van vluchtige post-translationele modificaties, het is essentieel om een gemakkelijk schaalbare lysemethode te gebruiken die warmteopwekking minimaliseert en tegelijkertijd een efficiënte lysis mogelijk maakt, ongeacht de hoeveelheid cellen.Hier beschrijven we een methode waarbij een cryovriesmolen wordt gebruikt voor de lyse van cellen in vloeibare stikstof bij min 196 Celsius om bevroren celextracten te genereren, waardoor intacte functionele macromoleculen, zoals eiwitten of DNA en RNA, kunnen worden teruggevloeid bij een zeer lage temperatuur die denaturatie en afbraak minimaliseert. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met elk type cel of weefselmonster van elke soort, met inbegrip van forensische en zelfs oude monsters die zijn teruggevonden op archeologische locaties of bevroren in permafrost worden aangetroffen. De vriesmolen maakt gebruik van een supergeleidende elektromagnetische slijpkamer die snel een vaste metalen staaf heen en weer beweegt in een polycarbonaatbestand met het monster dat moet worden verpulverd tussen roestvrijstalen eindpluggen.Deze fysieke cellysemethode zorgt voor een efficiëntere lysis en resulteert reproduceerbaar in een kwalitatief betere kwaliteit extract. Gistcellen werden gekweekt met een concentratie van 10 miljoen cellen per mil. Deze gistcellen werden geplaatst voor gekoeldcentrifuge fles en werden gesponnen gedurende 10 minuten op 2, 400 G.Once the spin is voltooid, decanteren de supernatant zonder verstoring van de pelleted cellen.Deze pellet werd opnieuw opgetrokken in een kleine hoeveelheid ijskoud water, ongeveer de helft van het initiële volume van de cultuur om de cellen te wassen. De geresuspended cellen werden weer gesponnen voor nog eens 10 minuten op 2, 400 G.Once de volgende spin is voltooid, we, nogmaals, decanteren alle supernatant zonder verstoring van de pellet. Deze pellet zal dan opnieuw worden opgespend en 15 ML ijskoude lyse buffer.Zorg ervoor dat de pellet volledig opnieuw wordt gemonteerd. De geresuspended cellen moeten op ijs blijven in een voorgetekende buis tot klaar voor de volgende stap. Draag altijd persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van vloeibare stikstof, zoals veiligheidsbrillen, handbescherming en labjassen.Om onze behendigheid te maximaliseren, dragen we vaak een paar witte thermische handschoenen ingeklemd tussen twee paar nitrilhandschoenen. Verander de buitenste en nitril handschoenen vaak, omdat ze rippen gemakkelijk na blootstelling aan vloeibare stikstof. In ons lab brengen we een aliquot vloeibare stikstof over in een kleine vijf liter vloeibare stikstofcontainer.Vloeibare stikstof wordt vervolgens gegoten in een 50 ML buis die is voorgekoeld op droog ijs. Zodra de 50 ML buis is vol vloeibare stikstof, voegen we het gisextract langzaam, in een druppel wijze aan de buis in stappen van 1,5 milliliter. Om de vorming van grote popcornpellets te minimaliseren, wordt de gistsuspensie in een cirkelvormige beweging toegevoegd.Om de vorming van grote popcornpellets verder te voorkomen, gebruiken we grote tangen om ervoor te zorgen dat alle pellets tussen de 0,3 en 0,5 centimeter in diameter liggen. Omdat vloeibare stikstof altijd verdampt, moet u de buis vullen met vloeibare stikstof alvorens elke 1,5 mil aliquot van gist suspensie toe te voegen. Zodra alle van de gist suspensie is gemaakt in popcorn laat de buis met popcorn te zitten zonder het deksel voor twee tot drie minuten om alle resterende vloeibare stikstof te laten verdampen.Om er zeker van te zijn dat alle vloeibare stikstof is verdampt, sluit u het deksel bijna volledig en schud voorzichtig. Als er een szinggeluid is, geeft dit aan dat de vloeibare stikstof nog niet volledig is verdampt. Open het deksel nog een minuut of zo om de resterende vloeibare stikstof te laten verdampen voordat het deksel goed wordt gesloten.Restvloeistof in de buis kan een explosie veroorzaken als het deksel voortijdig wordt gesloten. Deze gist popcorn kan worden opgeslagen bijna voor onbepaalde tijd in min 80 graden C.For ten minste vijf monsters, ervoor te zorgen dat u 30 tot 35 liter vloeibare stikstof beschikbaar. Vul de vriesmolen op de volledige lijn en sluit het deksel zodat de vriesmolen een paar minuten kan afkoelen.Nogmaals, altijd onthouden om persoonlijke beschermende kleding te dragen bij het omgaan met vloeibare stikstof. De polycarbonaat slijpen flacons, roestvrij stalen eindpluggen, en impactor bar moet worden voorgekoeld met vloeibare stikstof. Houd deze componenten ondergedompeld totdat de vloeibare stikstof stopt borrelen.Vergeet niet om alle popcorn monsters te houden op droog ijs totdat het hele slijpproces is voltooid. Trek alle vloeibare stikstof uit de slijpen flacons en breng je popcorn in de flacon. Vergeet niet om ook een magnetische impactorbar in de slijpblader te plaatsen.Sluit de slijpfuit door de roestvrijstalen stekker gelijkmatig op het uiteinde van de slijpfuit te plaatsen. We slaan elk uiteinde van de slijpfuit op een houten broodplank met een trillingsabsorberende rubberen rug om ervoor te zorgen dat de eindstekkers correct worden geplaatst en de slijpfijfbakken strak afdichten. Het is belangrijk om de eindstekkers vast te zetten om ervoor te zorgen dat ze niet loskomen en de monsters tijdens het slijpproces in de vriesmolen laten morsen.Plaats een slijpblad in de vriesmolen slijpkamer en slot op zijn plaats. Sluit het deksel van de vriesmolen en maal het monster gedurende drie cycli met twee minuten per cyclus, met een breeksnelheid van 14. Na het slijpen zijn de cycli volledig ontgrendelen van de flacon met de bevroren poeder cel lysate.Om te voorkomen dat het lysaat ontdooit, moet u snel en voorzichtig werken om een van de eindstekkers los te schroeven met behulp van het openingsgereedschap. Zodra de flacon open is, verwijder de impactor bar en snel breng het bevroren poeder extract op een voorgekoelde plastic weegschaal. Herstel zoveel mogelijk van het bevroren extract door het bonzen van de flacon op de houten breadboard.Zodra al het poeder uit de flacon is verwijderd, breng je snel alle poederextracten over in een voorgelabelde 15 mil buis die op droogijs wordt gehouden. Hoewel het het beste is om door te gaan met ontdooien en het gebruik van de extracten meteen om eiwitdegradatie te minimaliseren, kan het bevroren poederlysaat indien nodig 's nachts worden opgeslagen bij min 80. Ontdooi het poeder langzaam in een ijsdrijfmest die continu circuleert met een magnetische roerstaaf in een ijsemmer.Om zelfs ontdooien te vergemakkelijken, verwijder ijs dat zich vaak aan de buitenkant van de buizen ontwikkelt, ongeveer om de vijf minuten of zo. Zodra de extracten beginnen te ontdooien bij 1X proteaseremmer cocktail en 10 micromolar proteasome remmer MG132 om eiwitafbraak te voorkomen. Zodra de monsters volledig ontdooid zijn, wat meer dan een uur kan duren, draai je de monsters op 3, 220 G gedurende 20 minuten op vier Graden Celsius.Deze spin zal het grootste deel van het celpuin uit het lysaat verwijderen. Wanneer de spin is voltooid breng de supernatant in polycarbonaat flessen die zijn voor gekoeld op ijs en gooi de pellet. Centrifugeer de supernate en monsters op 16,000 G bij vier Celsius graad gedurende 20 minuten om het extract te verduidelijken.Nadat de spin is voltooid, herstel alleen de heldere supernatant zorgvuldig uit het midden van de vloeibare kolom zonder de troebele laag met het stuk op de top of het gepelde puin aan de onderkant van de centrifugebuis te verstoren. Breng het heldere lysaat over in een verse voorgekoelde 15 Mil buis. De resterende troebele vloeistof kan vijf minuten lang met dezelfde snelheid worden gesnelld om het herstel van wat meer van het groothandelslysaat mogelijk te maken.De extracten zijn nu klaar voor gebruik in experimenten, zoals zuivering van eiwitcomplexen en immunoprecipitatie. We vergeleken twee verschillende methoden van gistcellyse, namelijk glaskraalfrezen bij vier Celsius en een geautomatiseerde cryoslijfmethode bij min 196 Celsius om de relatieve teruggewonnen eiwitten en celextracten te beoordelen die met beide methoden zijn bereid. Uit deze studie hebben we ervoor gekozen om een ontluikende gist stam die een hoge kopie plasmid uitdrukken van een tandem HIS-MYC gelabeld ubiquitine te gebruiken.Zo kunnen we de affiniteit van herstel van gelabelde polyubiquitinated eiwitten uit groothandelsextracten beoordelen, na affiniteitszuivering met behulp van TALON-kobalt HIS tag affinity kralen gevolgd door westerse blotting met een monoklonal HIS tag antilichaam. Polyubiquidaden eiwitten die normaal gesproken zeer van korte duur zijn vanwege hun snelle afbraak door de ubiquitine proteasoommachines en bieden dus een zeer goede manier om de kwaliteit van groothandelsextracten die met verschillende methoden worden bereid, te vergelijken. Zoals we zien door de rechterhelft van de Ponceau gekleurde membraan, vonden we een hogere totale eiwitopbrengst in de groothandel extracten bereid door de cryo vriezer molen protocol zoals beoordeeld door de meer intensieve Ponceau vlekken in de groothandel extract lane.Dit is vooral duidelijk in de onderste en bovenste delen van de vriesmolen hele extracten rijstroken. Bovendien, zoals blijkt uit de rechterhelft van de HIS tag Western blot, zagen we een beter herstel van HIS-MYC tag ubiquidatie eiwit gevolgd door pull down met behulp van Talon kralen uit de groothandel extracten bereid door cryogene slijpen. We concluderen dat de cryogene vriesmolen superieur is aan andere methoden voor de bereiding van celextracten, vooral wanneer functionele macromoleculen nodig zijn voor downstream-toepassing.

preparation-cell-extracts-cryogrinding-an-automated-freezer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

In this video, we present the protocol to obtain finely ground extracellular matrix powder from lyophilized decellularized tissue by cryomilling. The powdered ECM retains its biochemical composition and can be used for microcarrier synthesis.

Cryomilling of Decellularized Tissue: A Technique to Obtain Fine Extracellular Matrix Powder

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.

Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Dit protocol presenteert een gedetailleerde procedure om biologische cryosamples voor synchrotron-gebaseerde röntgenabsorptiespectroscopie-experimenten voor te bereiden. We beschrijven alle stappen die nodig zijn om de monstervoorbereiding en cryopreservatie te optimaliseren met voorbeelden van het protocol met kanker- en fytoplanktoncellen. Deze methode biedt een universele standaard voor cryo-voorbereiding van monsters.

Biologische monsters voorbereiding voor soortvorming bij cryogene temperatuur met behulp van hoge-resolutie röntgenabsorptiespectroscopie

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).

Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

Leer cryogene cellysate van gist bereiden met een geautomatiseerde vriesmolen bij -196°C. Deze methode behoudt eiwitintegriteit en minimaliseert denaturatie voor functionele biochemische analyses.

Voorbereiding van celextracten door Cryogrinding in een geautomatiseerde vriesmolen

Meer video's verkennen