Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Snelle isolatie van CNS-weefsels inclusief de hersenvliezen maakt een uitgebreide analyse mogelijk van het fenotype, de functie en lokalisatie van immuuncellen in homeostatische en pathogene omstandigheden. De twee gedemonstreerde methoden maken de snelle extractie van CNS-weefsels met de hersenvliezen mogelijk, ideaal voor downstream-analyse met behulp van single-celtechnieken en histologische methoden. Hoewel de representatieve resultaten zich richten op de analyse van immuuncellen, kunnen deze twee methoden worden gebruikt om residente CNS-cellen te analyseren, waaronder microglia, astrocyten, pericten, endotheelcellen, stromale cellen en neuronen.

Begin met het isoleren van hersen- en ruggenmergmonsters van geëuthaniseerde muizen. Na het verwijderen van het hoofd, maak een incisie op de middenlijn in de huid en draai deze over de ogen om de schedel vrij te maken. Snijd bij het neusbeen om de onderkaak van de schedel los te maken.

Verwijder vervolgens de onderkaak, tong en ogen. Snijd langs de laterale aspecten van de schedel om het weefsel langs de uitwendige gehoorgang los te maken en trim het. Om het ruggenmergmonster te verzamelen, scheid de ribbenkast van de wervelkolom door parallel aan de wervelkolom te snijden met scherpe schaar.

Maak een kleine snede in de lagere lendenregio om de wervelkolom te isoleren, snijd vervolgens en verwijder alle resterende spieren langs de wervelkolom om de wervels bloot te leggen. Controleer het bot dagelijks tijdens het decalcificeren om te bepalen of het zacht en buigzaam is. Verwijder het weefsel uit de EDTA-oplossing met een pincet, leg het op een petrischaal en test voorzichtig de zachtheid van het bot met een naald van 25 gauge.

Als de naald gemakkelijk door het bot dringt, is het decalcificatieproces voltooid. Om de schedelkap in de hersenen te verwijderen, maak een middenlijnsnede in de huid en draai de huid over de ogen. Plaats de schaar in het foramen magnum en begin met snijden langs de cortex richting reukbol, waarbij de sneden boven de uitwendige gehoorgang en onderkaak blijven.

Voer dezelfde sneden uit aan de andere kant met sneden die bij de reukbol samenkomen om de schedelkap van de hersenen te scheiden. Gebruik een pincet om de schedelkap terug te pellen en plaats deze in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter koud RPMI-medium aangevuld met 25 millimolair HEPES. Plaats gebogen pincetten onder de basis van de hersenen en til ze op om de hersenen los te maken van de schedelkap.

Extracteer de wervelkolom en het ruggenmergweefsel door parallel aan de wervelkolom te snijden om de ribbenkast van de wervelkolom te scheiden. Maak vervolgens een kleine snede in de lagere lendenregio om de wervelkolom te isoleren. Snijd en verwijder alle resterende spieren langs de wervelkolom om de wervels bloot te leggen.

Plaats vervolgens de extra fijne chirurgische schaar binnen de wervelkolom en snijd langs de laterale rand van de kolom. Snijd de tegenoverliggende laterale rand volledig door om de wervelkolom in een voorste en achterste deel te verdelen. Gebruik een pincet om het ruggenmerg langzaam en voorzichtig van de wervelkolom te pellen en plaats het in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter koud RPMI met 25 millimolair HEPES.

Breng vervolgens de voorste en achterste delen van de wervelkolom over naar een andere buis. Om de hersenvliezen van de schedelkap te verwijderen, haal de schedelkap uit de RPMI-medium en gebruik scherpe pincetten om rond de buitenrand te scoren. Pel de hersenvliezen vanaf de rand van de schedelkap, schraap om de dura en arachnoïde hersenvliezen te verwijderen en plaats de hersenvliezen op een petrischaal.

Om de hersenvliezen van de wervelkolom te verwijderen, haal de kolom uit het medium en score rond de randen van de wervelkolom met scherpe pincetten om de hersenvliezen los te maken. Gebruik gebogen pincetten om de hersenvliezen van de rand van de wervels te pellen en plaats de hersenvliezen op een petrischaal. Plaats een nylon gaasfilter in een conische buis van 50 milliliter.

Om een celsuspensie te maken, beweeg de hersenvliezen naar een filter en voeg drie milliliter HEPES-gesupplementeerd RPMI toe, gebruik vervolgens een zuiger van een vijf milliliter spuit om het weefsel en medium door het filter te malen. Giet het hersen- of ruggenmergweefsel met het medium in een petrischaal van 100 millimeter en gebruik pincetten om het weefsel naar de bodem te verplaatsen. Snijd het hersenweefsel in stukjes met een steriele scheermes en verzamel het weefsel op de bodem van de plaat.

Voeg drie milliliter RPMI toe, gesupplementeerd met 10%FCS, aan de petrischaal en gebruik vervolgens een serologische pipet van 10 milliliter om het weefsel in het medium te resuspenderen en over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Voeg collageenase type 1 en DNase 1 toe aan het weefsel en incubeer de buizen in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 40 minuten. Draai de buizen om de 15 minuten om het weefsel grondig te mengen met de enzymen.

Na incubatie, voeg EDTA toe aan elke buis voor een uiteindelijke concentratie van 0,01 molair en incubeer de buizen gedurende vijf minuten langer om de collageenase te inactiveren. Voeg negen milliliter RPMI toe, gesupplementeerd met 10%FCS, aan elke buis en centrifugeer de buizen vervolgens gedurende vijf minuten bij 450 G op vier graden Celsius. Gebruik een Pasteur-pipet met een vacuüm om het supernatant te aspireren, zorg ervoor dat het celpelletje niet wordt geraakt.

Voeg drie milliliter 100% isotone dichtheidsgradiëntoplossing toe aan het celpelletje, voeg vervolgens extra RPMI 10%FCS-medium toe om het eindvolume op 10 milliliter te brengen en resuspendeer het celpelletje. Draai de buis om en meng goed, steek vervolgens een serologische pipet met één milliliter 70% isotone dichtheidsgradiëntoplossing in de bodem van de buis. Onderlaad de oplossing langzaam, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.

Verwijder