Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans
September 12th, 2020
Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.
De snelheid van eiwitsynthese wordt verstoord tijdens ziekte en veroudering. Fluorescentie herstel na fotobleaching, of FRAP, maakt het mogelijk de snelheid van eiwitsynthese in vivo. We gebruiken transparante C.elegans wormen, die GFP uitdrukken, als een model om de nieuwe eiwitsynthese te monitoren na het fotoblelen.
We bieden praktische richtlijnen om fluorescentieherstel te meten met behulp van transgene wormen, die GFP uitdrukken onder verschillende promotors, hetzij op grote schaal uitgedrukt of in specifieke cellen of weefsels. Ook biedt deze methode eiwitsynthese snelheid monitoring in real time. Gebruik een ontledende stereomicroscoop om de ontwikkelingsstadia en groei van wilde en gemuteerde transgene aaltjes te beoordelen.
Kies 10 L4 larven van wilde en gemuteerde transgene dieren die de gewenste fluorescerende reporter op nematode groeimediaplaten met E.coli. Incubeer en kweek de aaltjes bij de standaardtemperatuur van 20 graden Celsius. Vier dagen later bevat de plaat een gemengde populatie transgene wormen.
Selecteer en breng 15 L4 larven van elke stam over op vers gezaaide OP50 NGM-platen. Voer FRAP-test uit en controleer de eiwitsynthesesnelheid op dag één van de volwassenheid. De volgende dag, voor te bereiden en te gebruiken cycloheximide-bevattende NGM platen als een positieve controle.
Dood bacteriën door het blootstellen van de gezaaide NGM platen gedurende 15 minuten met UV-licht. Voeg cycloheximide op de top van bacteriële gezaaide platen ook 500 microgram per mL uiteindelijke concentratie in de agar volume. Laat platen drogen.
Breng transgene aaltjes over die GFP uitdrukken op voertuig- en cycloheximide-bevattende platen. Twee uur lang dieren uitbroeden bij de standaardtemperatuur van 20 graden Celsius. Kies en breng eendaagse volwassen transgene dieren naar individuele NGM-platen gezaaid met een OP50-daling van 20 microliters in het midden.
Verwijder het deksel en plaats elke plaat onder een 20H objectieve lens van een epifluorescente microscoop. Focus en leg een referentieafbeelding vast voordat je fotobleekt. Photobleach elk monster gedurende 10 minuten.
Maak een afbeelding na photobleaching. Houd dieren in individuele NGM-platen, en laat ze herstellen. Beeld en neem het herstel van elke tl-reporter elk uur gedurende ten minste zes uur op een epifluorescente stereomicroscoop.
Bereid 2%agarose pads, en voeg 10 microliter druppel M9 buffer in het midden van de agarose pad. Breng vijf transgene aaltjes die pan-neuronale cytoplasmatische GFP uitdrukken over in een druppel M9-buffer. Gebruik een wimper om de vloeistof te verspreiden.
Dieren vertonen verminderde bewegingen binnen twee minuten als gevolg van M9 absorptie in de agar. Verander de positie van nematode met behulp van een wimperpluk. Plaats het monster op de 40H objectieve lens van een epifluorescent microscoop zonder gebruik te maken van een cover slip.
Focus en leg een referentieafbeelding vast. Photobleach een gericht gebied van belang voor 90 seconden. Maak een afbeelding na photobleaching.
Voeg een 10 microliter druppel M9 buffer op fotobleached aaltjes. Laat de dieren vijf minuten herstellen. Gebruik de wimper pick of een pipet om de aaltjes over te brengen naar individuele NGM platen gezaaid met 20 microliters OP50 daling in het midden.
Leg elk uur een beeld vast van elk monster onder een epifluorescente stereomicroscoop. Wild-type en fe-2 mutant wormen uitdrukken cytoplasmatische GFP in hun somatische weefsels met behulp van de fe-2 promotor werden vergeleken vóór, onmiddellijk na fotobleaching, en vijf uur na herstel. Wilde dieren volledig hersteld, terwijl fe-2 mutanten had de mini's herstelcapaciteit.
Dus wild type wormen initiëren van de normale eiwitsynthese na photobleaching, terwijl wormen ontbreekt mRNA vertaling initiatie factor fe-2 zijn niet in staat om dit te doen, wat aangeeft dat de snelheid van fluorescerend herstel illustreert de snelheid van eiwitsynthese in vivo. Cycloheximide, een specifieke remmer van mRNA vertaling kan worden gebruikt als een positieve controle voor eiwit vertaling remming. Cycloheximide-behandelde transgene dieren die cytoplasmisch GFP onder de promotor uitdrukken, herstellen hun fluorescentie niet bij het fotobleaching.
mRNA-verwerkingsorganen beïnvloeden de snelheid van eiwitvertaling. Wild-type en edc-3 mutantaaltjes die GFP pan-neuronaal uitdrukken werden onderzocht op hun herstelcapaciteit bij gerichte fotobleaching op het hoofdgebied. Fluorescerend herstel is veel langzamer bij edc-3-deficiënte dieren in vergelijking met wild-type wormen.
Eiwitsynthese modulatie is essentieel voor organismale homeostase. Tijdens het ouder worden, wordt zowel de wereldwijde als de specifieke eiwitsynthese verstoord. Eiwitvertaalbalans controleert direct senescentie en veroudering.
Met name de kerncomponenten van de vertaalmachines en de interageringscomponenten van de P-body versnellen het verouderingsproces. Verstoring van de vertaling initiatie vertraagt veroudering. Daarom is het meten van wereldwijde eiwitsynthese door FRAP een directe uitlezing van het verouderingsproces.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie introduceert een niet-radioactieve, niet-invasieve methode voor het beoordelen van de novo eiwitsynthese in vivo met behulp van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleking (FRAP). De methode maakt real-time monitoring van eiwitsynthesesnelheden mogelijk en kan worden geïntegreerd met genetische en farmacologische screens om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Eiwitsynthesesnelheden zijn cruciaal tijdens veroudering en ziekte.
- Het gebruik van transgene C. elegans die GFP tot expressie brengen, vergemakkelijkt het monitoren van eiwitsynthese.
- Het begrijpen van eiwitsynthesemodulatie is essentieel voor de homeostase van organismen.
Gebruikte methoden
- Fluorescentieherstel na fotobleking (FRAP)
- Caenorhabditis elegans als modelorganisme
- Gebruik van transgene wormen die GFP tot expressie brengen
Belangrijkste resultaten
- Wild-type wormen herstelden volledig fluorescentie na fotobleking, terwijl fe-2 mutanten een verminderde herstel vertoonden.
- Cycloheximide diende als een positieve controle voor translatieremmering.
- De studie benadrukt de rol van mRNA-verwerkingslichamen in eiwitsynthesesnelheden.
Conclusies
- De bevindingen illustreren dat FRAP effectief eiwitsynthesesnelheden in vivo kan meten.
- Dit onderzoek is relevant voor het begrijpen van verouderingsprocessen en de modulatie van eiwitsynthese in biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Measuring de novo protein synthesis in vivo provides a direct readout of proteostasis dynamics, a key determinant of aging and disease progression. This method enables target validation and mechanistic de-risking by linking translational control to phenotypic outcomes in a genetically tractable system. It supports early discovery workflows by offering quantitative, real-time data for pathway interrogation and compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring protein synthesis rates as a functional readout of translational control.
- Operational Value: Enables biological de-risking through genetic and pharmacological perturbation of translation initiation factors.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying modulators that alter protein synthesis flux in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization using transgenic reporters.
- Operational Value: Delivers quantitative, time-resolved outputs suitable for high-content imaging platforms.
- Scalability Value: Facilitates reproducible compound evaluation across genetic backgrounds and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by connecting protein synthesis modulation to aging phenotypes in a whole-organism context.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via live imaging of functional recovery.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating synthesis rates with proteostatic resilience.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling real-time assessment of pathway activity and compound effects on protein synthesis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying protein synthesis as a dynamic biomarker of pathway engagement.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized FRAP protocols and reproducible fluorescence recovery metrics.
- Analytics: Provides quantitative measurements of recovery kinetics that allow comparison across genetic and pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking synthesis rates to aging-related phenotypes in a disease-relevant system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for longitudinal monitoring of target engagement and pathway modulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in translational control pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined bleaching and recovery imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of synthesis-altering compounds with reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target modulation efficacy in a physiological context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic nematode handling, fluorescence microscopy, and FRAP assay execution.
- Depends on epifluorescent or confocal microscopy systems with photobleaching capability and environmental control.
- Necessitates standardization across labs for worm staging, bleaching duration, and imaging intervals.
- Involves adaptation considerations when extending to tissue-specific promoters or alternative fluorescent reporters.
- Limited by the need for live animal imaging and potential phototoxicity during prolonged bleaching or recovery phases.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Maintenance, Synchronization and Preparation of Transgenic Nematodes for Monitoring de novo Protein Synthesis
2:11
FRAP Assay using Transgenic Animals Expressing Somatic Tissue Reporters plfe-2GFP and psod-3GFP
3:01
Mounting the Samples and Perform FRAP Assay using Transgenic Nematodes Expressing Pan-Neuronally Cytoplasmic GFP, punc-119GFP
4:19
Representative Results: In Vivo Assessment of de novo Protein Synthesis in C. elegans
5:46
Conclusion
