Name: In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer genetische manipulatie in het embryonale fretbrein via in utero-elektroporatie. Deze methode richt zich op neurale stamcellen in de ontwikkelende neocortex en biedt inzicht in mechanismen van hersenontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn de diensten en faciliteiten van het Max Planck Instituut voor Moleculaire Celbiologie en Genetica dankbaar voor de uitstekende ondersteuning, met name het hele team van de Biomedische diensten (BMS) voor de uitstekende veeteelt van fretten en J. Peychl en zijn team van de Light Microscopie Facility. We zijn Katrin Reppe en Anna Pfeffer van het BMS bijzonder dankbaar voor uitzonderlijke veterinaire ondersteuning en Lei Xing van de Huttner-groep voor het assisteren bij fretoperaties.

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswetgeving na goedkeuring door de Landesdirektion Sachsen (licenties TVV 2/2015 en TVV 21/2017).
1. Voorbereiding op utero-elektroporatie
<ol><li>Bereid het DNA-mengsel voor. In dit protocol wordt een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL pGFP gebruikt. Los DNA op in PBS en vul aan met 0,1% Fast Green om visualisatie te vergemakkelijken. Eenmaal bereid, meng het DNA-mengsel door pipetten op en neer meerdere malen of door vinger te tikken. Bewaar op kamertemperatuur tot gebruik. OPMERKING: Voor coelectoraties is het DNA-mengsel bereid om een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL plasmide te bevatten die een be belang is, samen met 0,5 μg/μL pGFP verdund in PBS.</li>
	<li>Bereid de operatietafel voor met alle benodigde gereedschappen en instrumenten.</li>
	<li>Trek glazen haarvaten met behulp van de micropipet trekker. Pas de diameter van de capillaire punt aan door het distale deel van de capillaire af te snijden met tangen zoals eerder beschreven41.</li>
</ol>2. Voorbereiding van fretten voor chirurgie
<ol><li>Houd de zwangere jills met embryo's op E33 vasten voor ten minste 3 uur voor de operatie om het risico van braken te verminderen.</li>
	<li>Voorafgaand aan de operatie steriliseren alle instrumenten door autoclaving. Voer de operatie uit in een speciaal toegewezen ruimte in aseptische omstandigheden om mogelijke bronnen van besmetting te elimineren.</li>
	<li>Plaats de zwangere jill in de narcose box met 4% isoflurane.</li>
	<li>Wanneer verdoofd, plaats de fret op de operatietafel met een warmtekussen en bevestig het narcosemasker met een constante 2-3% isoflurane stroom naar de neus. Controleer om het juiste niveau van anesthesie te waarborgen, op het ontbreken van de volgende reflexen:<ol>
<li>De palpebral reflex door het aanraken van de perioculaire huid</li>
		<li>De flexor reflex door knijpen de huid tussen de2e en 3e, of 3e en 4e teen van beide achterste ledematen</li>
		<li>Als de palpebral reflex afwezig is en flexor reflex is duidelijk verminderd, controleer op de pijnreflex door knijpen een teen van elke achterste ledemaat. LET OP: Zorg ervoor dat u een stethoscoop bij de hand hebt om de hartslag en het ritme indien nodig te controleren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteer de fret onderhuids met pijnstillend (0,1 mL metamizol, 50 mg/kg lichaamsgewicht), antibioticum (0,1 mL/kg lichaamsgewicht van 20 mg/kg amoxicilline + clavulanic acid) en glucose (10 mL van 5% glucoseoplossing).</li>
	<li>Plaats een druppel oogzalf oplossing op de ogen om uitdroging van de ogen te voorkomen tijdens de chirurgische ingreep.</li>
	<li>Scheer de fretbuik met een scheerapparaat.</li>
	<li>Reinig de huid met water en zeep, desinfecteer de buik met 70% ethanol scrub, desinfecteer 2x met jodium en laat het drogen.</li>
</ol>3.
<ol><li>Zorg ervoor dat het chirurgische gebied steriel is: plaats steriele chirurgische hulpmiddelen op steriele weefsels en verander jas en handschoenen.</li>
	<li>Plaats een steriel chirurgische gordijn op het dier.</li>
	<li>Met behulp van een scalpel, operatief open de buik op de linea alba met een ~ 5 cm lange snede.</li>
	<li>Snijd de spierlaag met een schaar.</li>
	<li>Plaats gaastentjes rond de incisieplaats en maak ze nat met PBS. De gaastenstaafjes absorberen de extra PBS die tijdens de operatie worden toegevoegd. LET OP: Houd warmte- en PBS-ondersteuning tijdens de operatie.</li>
	<li>Bloot de fret baarmoeder en plaats het op de gaas wattenstaafjes.</li>
	<li>Laad een glazen capillair met de injectieoplossing met behulp van een pipet met een lange laadpunt. Zorg ervoor dat het laadvolume ongeveer tussen 5-20 μL ligt, afhankelijk van het aantal embryo's en het aantal verschillende experimentele omstandigheden. Het gemiddelde geïnjecteerde volume per embryo is 3-5 μL. Bevestig de geladen glazen capillaire aan een houder en sluit de andere kant van de houder aan op een buis en een mondstuk.</li>
	<li>Inspecteer het eerste embryo en vind het hoofd.</li>
	<li>Plaats de glasvezellichtbron naast het hoofd van het embryo om visualisatie te vergemakkelijken. OPMERKING: Ferret baarmoederwanden zijn erg donker, en het is moeilijk om te zien door hen, tenzij het licht is direct scheen op hen.</li>
	<li>Voer een enkele intraventriculaire injectie in de hartkamer van een van de hersenhelften en houd de andere hemisfeer intact om te dienen als een interne controle. De ventrikel zelf is niet gemakkelijk te onderscheiden door het oog, dus de locatie wordt geschat op basis van de locatie van de gepigmenteerde iris, die zichtbaar is. De intraventriculaire injectie wordt gedaan door het nemen van de houder aan de glazen capillaire en penetreren van de huid, schedel, en hersenweefsel met de punt van de glazen capillaire. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de placenta niet beschadigt, wat donkerder is dan murine placenta's.<ol>
<li>Wanneer de punt van de glazen capillaire zich in de ventrikel bevindt, injecteer ongeveer 3-5 μL van de injectieoplossing door mond-pipetting met behulp van het mondstuk aangesloten op de glazen capillaire houder. Omdat de geïnjecteerde oplossing 0,1% Fast Green bevat, wordt de geïnjecteerde ventrikel nu donkergroen en zal zichtbaar zijn als niervormige structuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de pincet elektroden op de baarmoeder boven het hoofd van het embryo, zodat de positieve pool wordt geplaatst boven het gebied dat zal worden gericht en de negatieve pool onder het geïnjecteerde gebied.</li>
	<li>Stel de volgende elektroporatievoorwaarden in op de elektroporator: Pulslengte = 50 ms; Pulsspanning = 100 V; Pulsinterval = 1 s; Aantal pulsen = 5. Druk vervolgens op de knop" Pulse" op de elektroporator.</li>
	<li>Laat snel enkele druppels warme 1x PBS vallen op het geëlektreerde embryo.</li>
	<li>Herhaal de procedure voor alle embryo's. Houd de baarmoeder constant nat met warme PBS. OPMERKING: Als de eerste embryo's die naar de vagina staan niet gemakkelijk toegankelijk zijn, is het het beste om ze niet te elektropen.</li>
	<li>Wanneer alle embryo's worden geëlektrooeerd, plaats de baarmoeder terug in de buikholte.</li>
	<li>Hecht de spierlaag met het buikvlies met behulp van een 4-0 hechting.</li>
	<li>Hecht de huid met dezelfde dikte en spuit de wond met aluminium spray.</li>
	<li>Plaats het dier in een kooi en houd het warm met een warmtebron. Houd het dier goed in de gaten tot het wakker wordt.</li>
</ol>4. Postoperatieve zorg en huisvesting van gerichte dieren
<ol><li>Gedurende 3 dagen na de operatie wordt ervoor gezorgd dat de dieren de volgende postoperatieve zorg ondergaan: 20 mg/kg amoxicilline (antibioticum) 1x per dag; 25 mg/kg metamizol (pijnstillend) 3x per dag.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de fretten individueel worden gehuisvest.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de fretten ten minste 1x per dag door een dierenarts worden onderzocht.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de fretten zo min mogelijk gestoord worden tijdens de levering.</li>
	<li>Nadat de pups zijn gespeend of geofferd, bereid de jills voor hysterectomie.</li>
</ol>5. Hysterectomie van fretten
OPMERKING: Een hysterectomie wordt uitgevoerd om het aantal geofferde dieren te verminderen, zodat de gesteriliseerde dieren kunnen worden gedoneerd voor adoptie als huisdier. De prechirurgische procedure voor hysterectomie is hetzelfde als in stap 2.
<ol><li>Scheer en steriliseer de fretbuik zoals beschreven in de stappen 3.1 en 3.2.</li>
	<li>Operatief open de buik op de linea alba. Snijd de spierlaag door. Til de spierlaag op en beschut de darm met een vinger terwijl u de spierlaag volledig opent.</li>
	<li>Plaats gaastentjes rond de incisieplaats en maak ze nat met steriele PBS. Bloot de fret baarmoeder en de eierstokken en leg ze op het gaas wattenstaafjes.</li>
	<li>Start de hysterectomie aan de ene kant door het ligating van de arteria ovarica en vena ovarica craniale aan de mesovar. Zet een klem aan elke kant van de ligatie en voer een andere ligatie craniale aan de klemmen. Bevestig de derde klem aan de uiteinden van de ligatie om ze te redden. Herhaal dit aan de andere kant.</li>
	<li>Snijd tussen de klemmen en los de cornua uteri van de mesenterie aan beide zijden.</li>
	<li>Ligate de arteria uterina aan beide zijden van de baarmoeder caudal aan de ostium uteri. Dan ligate de vagina en bevestig de ligatuur. Bevestig de klem aan de uiteinden van de ligaties om ze te redden. Zet twee klemmen craniale aan de ligatuur. Snijd tussen de klemmen en los de baarmoeder van de vagina. Verwijder de baarmoeder en eierstokken en gooi ze weg. Schraap het resterende slijmvlies uit de baarmoederkui.</li>
	<li>Maak alle resterende klemmen los en verkort de ligatuureinden. Zorg ervoor dat u het bloeden onder controle houdt nadat de klemmen zijn verwijderd.</li>
	<li>Hecht de spierlaag en de huid zoals beschreven in stappen 3.16 en 3.17. Volg het postoperatieve protocol zoals in de stappen 3.18 en 4.1–4.3. Bewaar de dieren ten minste 2 weken in de diereninrichting met regelmatige veterinaire bezoeken. Nadat de dieren volledig zijn hersteld, kunnen ze worden gedoneerd voor adoptie.</li>
</ol>

<ol><li>Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalebic%2C+N+%22Evolution+of+Nervous+Systems+2e%22">Evolution of Nervous Systems 2e</a>. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).</li>
<li>Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outer+subventricular+zone+and+primate-specific+cortical+complexification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification.</a> Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).</li>
<li>Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Molnar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of the human cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).</li>
<li>Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-based+gene+transfer+to+the+mammalian+CNS+for+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies.</a> Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+the+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation.</a> Science Reports. 6, 20611(2016).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+gene+expression+in+mouse+embryonic+brain+and+single+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo.</a> EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
<li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Albert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+profiling+and+editing+of+neocortical+progenitor+cells+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development.</a> EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+manipulation+of+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Molecular Brain. 5, 24(2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+manipulation+of+cortical+progenitors+in+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+expansion+due+to+increased+proliferation+of+basal+progenitors+is+linked+to+changes+in+their+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology.</a> Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).</li>
<li>Martinez-Martinez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+period+for+formation+of+outer+subventricular+zone+defined+by+Cdh1+and+Trnp1+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels.</a> Nature Communication. 7, 11812(2016).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Inner+and+Outer+Fiber+Layers+in+the+Developing+Cerebral+Cortex+of+Gyrencephalic+Ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets.</a> Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+Cerebral+Cortex+Requires+Cdk5+in+Upper-Layer+Neurons+in+Gyrencephalic+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals.</a> Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).</li>
<li>Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrification+of+the+cerebral+cortex+requires+FGF+signaling+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain.</a> Elife. 6, 29285(2017).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+induces+hallmarks+of+neocortical+expansion+in+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex.</a> Elife. 7, 41241(2018).</li>
<li>Masuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+cortical+malformation+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals.</a> Science Reports. 5, 15370(2015).</li>
<li>Matsumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+periventricular+nodular+heterotopia+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals.</a> Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).</li>
<li>Barnette, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+brain+development+in+the+ferret+via+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of brain development in the ferret via MRI.</a> Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+in+the+ferret.+I.+Description+of+the+external+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes.</a> Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).</li>
<li>Sawada, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+sulci+and+gyri+in+ferrets+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius).</a> Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).</li>
<li>Reillo, I., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+zones+in+the+developing+cerebral+cortex+of+ferret%3A+ontogeny%2C+cell+cycle+kinetics%2C+and+diversity+of+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors.</a> Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+of+the+ferret.+II.+Description+of+the+internal+histological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes.</a> Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).</li>
<li>Borrell, V., Reillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+neural+stem+cells+in+cerebral+cortex+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution.</a> Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).</li>
<li>Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+intermediate+radial+glia+in+the+tangential+expansion+of+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+progenitor+expansion%2C+self-renewal+and+neurogenesis-a+polarized+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).</li>
<li>De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+domains+of+gene+expression+in+germinal+layers+distinguish+the+development+of+gyrencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly.</a> EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+investigations+of+the+brain+of+higher+mammals+using+gyrencephalic+carnivore+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosciences+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets.</a> Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+to+the+postnatal+ferret+cerebral+cortex+by+DNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).</li>
<li>Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+radial+migration+of+neurons+by+long-distance+somal+translocation+in+the+developing+ferret+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).</li>
<li>Johnson, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspm+knockout+ferret+reveals+an+evolutionary+mechanism+governing+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size.</a> Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).</li>
<li>Vaid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+Hopx-dependent+basal+radial+glial+cells+in+the+developing+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex.</a> Development. 145 (20), 169276(2018).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nature Communications. 4, 2125(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In utero elektroporatie in fret is een belangrijke techniek, met voor- en nadelen met betrekking tot andere methoden. Er zijn kritieke stappen en beperkingen aan deze methode, evenals mogelijke wijzigingen en toekomstige toepassingen om in gedachten te houden.
Sinds het pionierswerk van Victor Borrell en collega's over genetische manipulatie van de postnatale fret neocortex via elektroporatie of virale injectie35,42,<sup cla...

De neocortex is het buitenste blad van de zoogdiercerebrum en de zetel van hogere cognitieve functies1,2,3,4,5. Om een acute genetische manipulatie in de zoogdiernetrocortex in vivo te bereiken tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn twee verschillende methoden onderzocht: virale infectie6 en in utero elektroporatie7. Beide methoden maken efficiënte targeting van neocorticale cellen mogelijk, maar hebben last van enkele beperkingen. Het grote voordeel van in utero elektroporatie in vergelijking met virale infectie is het vermogen om ruimtelijke specificiteit te bereiken binnen de neocortex, die wordt bereikt door het reguleren van de richting van het elektrische veld.
Sinds elektroporatie voor het eerst werd aangetoond dat het de binnenkomst van DNA in de cellen in vitro8vergemakkelijkt, is het toegepast om DNA te leveren in verschillende gewervelde dieren in vivo. In de ontwikkelingsneurowetenschappen werd in utero-elektroporatie van de muis neocortex voor het eerst gemeld in 20019,10. Deze methode bestaat uit een injectie van het DNA-mengsel in de laterale ventrikel van de embryonale hersenen en de daaropvolgende toepassing van het elektrische veld met behulp van pincet-elektroden, die ruimtelijke precisie7,11mogelijk maakt . In utero elektroporatie is sindsdien toegepast om nucleïnezuren te leveren om de expressie van endogene of ectopisch toegevoegde genen in de muis neocortex te manipuleren. Belangrijke vooruitgang is onlangs geboekt door de toepassing van de methodologie van CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking via in utero elektroporatie in de muis neocortex uit te voeren (1) genverstoring in postmitotische neuronen12,,13 en neurale voorloper cellen14, en (2) genoom15 en epigenome16 bewerken.
Zeer snel na het eerste rapport in de muis, in utero elektroporatie werd toegepast op de embryonale rat neocortex17,18. Niet-knaagdieren bleven een uitdaging tot de eerste in utero elektroporatie van fretten, een kleine carnivoor, werd gemeld in 201219,20. Sindsdien is in utero elektroporatie van fretten toegepast om de mechanismen van neocortexontwikkeling te bestuderen door neurale voorlopers en neuronen20,21 ,22,2223,te manipuleren, waarbij de expressie van endogene genen wordt gemanipuleerd, inclusief het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie24, en door ectopische genen te leveren21,22,25, inclusief mensspecifieke genen26. Bovendien is in utero-elektroporatie van fretten gebruikt om kenmerken van de ontwikkeling van menselijke neocortex in pathologische omstandigheden27,28aan te pakken .
In de context van de ontwikkeling van neocortex zijn de voordelen van het gebruik van fretten als modelorganisme ten opzichte van muizen te wijten aan het feit dat fretten een reeks menselijke kenmerken beter samenvatten. Op anatomisch niveau vertonen fretten een karakteristiek patroon van corticale vouwen, dat ook aanwezig is in menselijke en meeste andere primaten, maar volledig afwezig is bij muizen of ratten4,29,30,31. Op histologisch niveau hebben fretten twee verschillende subventriculaire kiminale zones, aangeduid als de binnenste en buitenste subventriculaire zones (respectievelijk ISVZ en OSVZ)32,33, gescheiden door de binnenste vezellaag23. Deze functies worden ook gedeeld met primaten, waaronder mensen, maar niet met muizen34. De ISVZ en OSVZ in fretten en mensen zijn bevolkt met overvloedige neurale voorlopercellen, terwijl de subventriculaire zone (SVZ) van muizen bevat slechts schaarse neurale voorlopers21,32,35,36. Op cellulair niveau vertonen fretten een groot deel van een subtype neurale voorlopers die respectievelijk basale of buitenste radialeglia (bRG of oRG) worden genoemd, die als instrumenteel worden beschouwd voor de evolutionaire expansie van de zoogdiernecitator34,37,38. bRG zijn dus zeer overvloedig in de foetale menselijke en embryonale fret neocortex, maar ze zijn zeer zeldzaam in de embryonale muis neocortex35,36. Bovendien vertoont ferret bRG morfologische heterogeniteit vergelijkbaar met die van de menselijke bRG, veel beter dan muis bRG21. Ten slotte vertoont de ontwikkeling van fret neocortex op moleculair niveau genexpressiepatronen die sterk lijken op die van foetale menselijke neocortex, waarvan wordt aangenomen dat ze de ontwikkeling van corticale vouwen controleren, onder andere39.
De cel biologische en moleculaire kenmerken van fret bRG maken ze zeer proliferative, vergelijkbaar met de menselijke bRG. Dit resulteert in een verhoogde productie van neuronen en de ontwikkeling van een uitgebreide en zeer complexe neocortex34. Deze kenmerken maken fretten uitstekend model organismen voor het bestuderen van mens-achtige kenmerken van neocortex ontwikkeling die niet kunnen worden gemodelleerd in muizen26,40. Om optimaal gebruik te maken van de fret als modelorganisme werd de gepresenteerde methode ontwikkeld. Het bestaat uit in utero elektroporatie van E33 fret embryo's met een plasmide uitdrukken GFP (pGFP) onder de controle van een alomtegenwoordige promotor, CAG. De geëlektreerde embryo's kunnen vervolgens embryonaal of postnatally worden geanalyseerd. Om het aantal geofferde dieren te verminderen, worden vrouwelijke fretten (jills) gesteriliseerd door hysterectomie en gedoneerd voor adoptie als huisdier. Als de beoogde embryo's in embryonale stadia worden geoogst, wordt een tweede operatie uitgevoerd en worden de embryo's verwijderd door een keizersnede, terwijl de jills hysterectomized zijn. Als de beoogde embryo's worden geanalyseerd in postnatale stadia, worden de jills hysterectomized nadat de pups zijn gespeend of geofferd. Daarom wordt ook een protocol gepresenteerd voor de hysterectomie van jills.

<table><tbody><tr><td>1ml spuit</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Aluminium spray</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Amoxiciline+klavulaanzuur (Synulox RTU)</td><td>WDT</td><td>6301</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Cappilary houder</td><td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Dexpanthenol zalf oplossing</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Lappen 45x75cm</td><td>Hartmann</td><td>2513052</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Elektrode pincet, platina geplateerd 5mm</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Fret Mustela putorius furo</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>Experimenteel organisme</td></tr><tr><td>Vezeloptische lichtbron</td><td>Olympus</td><td>KL1500LCD</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Allgaier instrumente</td><td>08-033-130</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Pincet 3C-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Pincet 55</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Pincet 5-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>5-SA</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Gaasjes grote</td><td>Hartmann</td><td>401723</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Gaasjes kleine</td><td>Hartmann</td><td>401721</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>GFP antilichaam</td><td>Aves labs</td><td>GFP1020</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>Glazen capillairen (Borosilicaatglas met gloeidraad, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm lengte)</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF120-69-10</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Verwarmingspad</td><td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Jodium (Betadine oplossing 100 mg/ml)</td><td>Meda</td><td>997437</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CP</td><td>21311</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Loading tips 20&micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Metzenbaum dissecteer schaar</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Micropipet puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-97</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Van Kalebic et al., eLife, 2018</td></tr><tr><td>PCNA antilichaam</td><td>Millipore</td><td>CBL407</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>pH3 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Aesculap</td><td>294200104</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Braun</td><td>EP100</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Sox2 antilichaam</td><td>R+D Systems</td><td>AF2018</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>Chirurgische klem 13cm</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Chirurgische dubbele lepel (Williger)</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Chirurgische doek</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar klein</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Hechtnaald houder</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Tbr2 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>Transfer pipet 3ml</td><td>Fischer scientific</td><td>13439108</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>Chirurgie</td></tr></tbody></table>

in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex door in utero electroporation

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulatie van genexpressie in vivo tijdens de embryonale ontwikkeling is de methode van keuze bij het analyseren van de rol van individuele genen tijdens de ontwikkeling van zoogdieren. In utero elektroporatie is een belangrijke techniek voor de manipulatie van genexpressie in de embryonale zoogdier hersenen in vivo. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in utero elektroporatie van de embryonale neocortex van fretten, een kleine carnivoor. De fret wordt steeds vaker gebruikt als een model voor neocortex ontwikkeling, omdat de neocortex vertoont een reeks van anatomische, histologische, cellulaire, en moleculaire kenmerken die ook aanwezig zijn in menselijke en niet-menselijke primaten, maar afwezig in knaagdier modellen, zoals muis of rat. In utero elektroporatie werd uitgevoerd op embryonale dag (E) 33, een midneurogenese stadium in fret. In utero elektroporatie richt neurale voorloper cellen langs de laterale ventrikels van de hersenen. Tijdens neurogenese, deze voorloper cellen aanleiding geven tot alle andere neurale celtypes. Dit werk toont representatieve resultaten en analyses op E37, postnatale dag (P) 1 en P16, wat overeenkomt met respectievelijk 4, 9 en 24 dagen na utero-elektroporatie. In eerdere stadia bestaat het nageslacht van gerichte cellen voornamelijk uit verschillende neurale voorloper subtypes, terwijl in latere stadia de meeste gelabelde cellen postmitotische neuronen zijn. Dus, in utero elektroporatie maakt de studie van het effect van genetische manipulatie op de cellulaire en moleculaire kenmerken van verschillende soorten neurale cellen. Door het effect ervan op verschillende celpopulaties, in utero elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de manipulatie van histologische en anatomische kenmerken van de fret neocortex. Belangrijk is dat al deze effecten acuut zijn en worden uitgevoerd met een spatiotemporale specificiteit bepaald door de gebruiker.

In utero elektroporatie van fretten op E33 resulteerde in targeting van de neurale voorloper cellen langs het ventriculaire oppervlak van de embryonale neocortex (Figuur 1). Deze cellen worden apicale voorlopers genoemd en zijn zeer proliferative, wat aanleiding geeft tot alle andere celtypen tijdens de ontwikkeling. Bij asymmetrische verdeling, apicale voorlopers gegenereerd een andere apicale voorloper en een meer gedifferentieerde cel, meestal een basale voorloper (BP), die gedelamineerd ...

Hier gepresenteerd is een protocol om genetische manipulatie uit te voeren in de embryonale fret hersenen met behulp van in utero elektroporatie. Deze methode maakt het mogelijk om neurale voorlopercellen in de neocortex in vivo te targeten.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Dit protocol stelt ons in staat om een genetische manipulatie in vivo uit te voeren in een belangrijk diermodel dat ons in staat stelt om de expansie en vouwen van een zich ontwikkelende neocortex te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is in het gebruik van hoge ruimtelijke en temporele specificiteit in het richten van die neurale stamcellen die de belangrijkste cel type voor de ontwikkeling van de hersenen. Trek vóór het begin van de procedure glazen haarvaten aan een micropipettrekker en gebruik tangen om het distale deel van de haarvaten af te snijden om de diameter van de haarvatenpunt aan te passen.Voeg op embryonale dag 33 de juiste concentratie DNA toe in PBS, aangevuld met 0,1%Fast Green met zachte menging, en plaats een 3 uur durende vastende, verdoofde, zwangere vrouwelijke fret op een operatietafel met een warmtekussen. Bevestig het juiste sedatieniveau door de perioculaire huid aan te raken en de huid tussen de tweede en derde of derde en vierde tenen van beide achterpoten te knijpen. Isoflurane kan bijwerkingen veroorzaken, waaronder misselijkheid en duizeligheid.Gebruik bij het hanteren van isoflur in vloeibare vorm de beschermingsmiddelen. Gebruik

in-vivo-targeting-neural-progenitor-cells-ferret-neocortex-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo&#39;s

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

Leer genetische manipulatie in het embryonale fretbrein via in utero-elektroporatie. Deze methode richt zich op neurale stamcellen in de ontwikkelende neocortex en biedt inzicht in mechanismen van hersenontwikkeling.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

Meer video's verkennen