Het blokkeren van lymfestroom door het hechten van Afferent Lymfatische bloedvaten in muizen

Deze methode onderbreekt de lymfestroom met minimale schade aan lymfe-endotheelcellen, en met nauwkeurige controle van de blokkadetiming, kan het worden gebruikt om te bestuderen hoe lymfestroom homeostase en immuunreacties in de lymfeklier beïnvloedt. Helpen om de procedure aan te tonen zal Jingna Xue, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om een injectieapparaat voor te bereiden, snijdt u ongeveer 30 centimeter polyethyleenbuizen.

Sluit het puntje van de naald A aan op het ene uiteinde van de slang. Maak voorzichtig een andere naald los en sluit de gebroken kant aan het andere uiteinde van polyethyleenbuizen. Bevestig vervolgens naald A aan een tuberculinspuit van één milliliter.

Bereid onmiddellijk voor gebruik een 10:1 ketamine-xylazinemengsel in zoutoplossing. Na het verdoven van de muis door het injecteren van 250 microliters van de ketamine / xylazine mengsel intraperitoneally, zorgen voor volledige verdoving met een teen snuifje. Scheer de vacht rond de benen met haarknippers en breng vervolgens ontharingscrème rond het been aan.

Na vijf minuten, veeg de resterende vacht en de ontharingscrème met behulp van een vochtig weefsel, dan schoon het been met steriel water. Spray 70% ethanol rond het been om het operatiegebied te steriliseren. Plaats de muis in een gevoelige positie en gebruik chirurgische tape om het operatiegebied op het rechterbeen bloot te leggen.

Intradermally injecteren vijf microliters van 1%Evans blauwe kleurstof, of negen centimeter van de vloeistof uit het injectieapparaat buizen in de rechter voetpad van de muis. Masseer het voetpad voorzichtig om de vloeistof in de lymfevaten te laten komen. Zoek onder een ontledenmicroscoop een incisieplaats van vijf millimeter vanaf de onderrand van de popliteal fossa.

Met behulp van een schaar, maak een kleine incisie ongeveer vijf millimeter in lengte. Gebruik vervolgens fijne werking tangen om de incisie te rekken en bloot de verzamelende lymfevaten. Identificeer beide afferente lymfevaten die leiden tot de popliteale lymfeklieren.

Met behulp van een naaldhouder, voorzichtig steek de hechtaald tussen de afferent lymfevaten en de saphenous slagader. Trek de naald voorzichtig uit rond de afferente lymfevaten. Trek voorzichtig aan de hechtsnaar, waardoor ongeveer twee centimeter van de hechtsnaar achterblijft.

Gebruik de naaldhouder om de knoop van een chirurg te binden. Masseer het voetkussen voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen Evans blauwe kleurstof de hechtplaats passeert en snijd vervolgens de overtollige snaar met een schaar. Hecht de andere afferente lymfevaten en sluit vervolgens de huidincisie met dezelfde hechting die werd gebruikt voor de lymfevaten.

Voor de sham controle, intradermally injecteren vijf microliters van 1%Evans blauwe kleurstof in de linker voet pad, en masseer het voetpad. Open de huid met een incisie en sluit de wond zonder het vat te hechten. Bij het toezicht op de muis na de operatie, moet het rechterbeen tonen oedeem, met Evans blauwe kleurstof verspreiden naar de dij, terwijl de controle been zal Evans blauwe kleurstof beperkt tot het voetkussen te tonen.

Onmiddellijk na de operatie, intradermally injecteren 10 microliters van 2%FITC in zowel de rechter voet pad en de linkerkant. Twee, zes en 12 uur na de injectie met FITC verzamelen de popliteale lymfeklieren van de fossa van geëuthanaseerde muizen. Verwijder voorzichtig het perinodal vetweefsel rond de pNN's.

Sluit de pLNs in optimale snijtemperatuurverbinding met het medullaire sinusgebied dat naar de zijkant van de cryomal wordt gericht. Gebruik een cryotoom om bevroren secties van 20 micron voor te bereiden. Om de FITC-verdeling in de pLN's te bepalen, beeldt u de cryo-secties onder een confocale microscoop.

Confocale beelden vastgelegd twee, zes en 12 uur na FITC injectie tonen aanzienlijk verminderde FITC accumulatie in de popliteale lymfeklieren na het hechten van de afferent lymfevaten. De resterende FITC in de pNN's werd bij voorkeur opgehoopt in de lymfeklier sinussen. Confocale beelden van het perinodal vetweefsel laten zien wanneer lymfevaten worden geblokkeerd door hechting, FITC het weefsel binnenkomt wanneer de lymfeklier sinussen, maar het is niet effectief verspreid over de lymfeklieren.

Bij een poging tot deze methode, is het belangrijk om te onthouden dat het inbrengen van de hechtaaldaald tussen het bloedvat en het lymfevat is van cruciaal belang. Het uitvallen van deze stap kan de vaten breken. Na het uitvoeren van deze methode is het mogelijk om muizen te immunize met infectie of andere immuunstimulatie om te bestuderen hoe lymfestroom immuunbescherming reguleert.

De functie van lymfestroom is niet goed begrepen. Deze methode kan worden gebruikt om celmigraties in de lymfeklier te bestuderen bij afwezigheid van lymfeklier.