Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
2 juni 2020
Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.
Neuronale differentiatie uit muis-assays is een uitstekend model voor het illustreren van de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese. We demonstreren een geoptimaliseerde methode voor embryoïde neurogenese met behulp van een bedrijfstoro-screeningstrategie. Deze techniek heeft de voordelen van hoge efficiëntie, lage kosten en eenvoudige bediening, en is geschikt voor popularisering onder laboratorium.
Het is een krachtig hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek. Om differentiatie uit te voeren met behulp van protocol een, zaai 20.000 muis embryoïde stamcellen in twee milliliter basaal differentiatiemedium in elke put van een 0,1% gelatine-gecoate zes-putsplaat. Na celhechting, was de cellen met twee milliliter PBS en voeg twee milliliter basaal differentiatiemedium toe aan elke put, en plaats de cellen terug in de incubator.
Laat de cellen acht dagen differentiëren, waarbij het medium om de twee dagen wordt vervangen. Om protocol twee uit te voeren, voeg 1,5 miljoen muis embryoïde stamcellen toe aan een niet-adhesief bacterieel schaaltje in 10 milliliter basaal differentiatiemedium en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om embryoïde lichaamsvorming mogelijk te maken. Na twee dagen breng je de celaggregaten over naar 15 milliliter centrifugeerbuisjes en laat ze door zwaartekracht bezinken.
Verwijder het supernatant en voeg 10 milliliter vers basaal differentiatiemedium toe om de embryoïde lichamen opnieuw te suspenderen. Plant ze vervolgens opnieuw in een nieuw niet-adhesief schaaltje en incubeer ze nog twee dagen. Verzamel en zaai ongeveer 50 embryoïde lichamen in twee milliliter basaal differentiatiemedium per put op een gelatine-gecoate zes-putsplaat.
Voor retinoïnezuurinductie, voeg twee microliter RA-stock toe aan elke put tot een eindconcentratie van één micromolair. Plaats de plaat terug in de incubator en differentieer de cellen nog vier dagen. Om differentiatie uit te voeren met behulp van protocol drie, herhaal protocol twee maar laat slechts twee dagen toe voor embryoïde lichaamsvorming en zes dagen voor RA-inductie.
Controle van de kwaliteit van de embryoïde lichamenvorming moet worden uitgevoerd met behulp van microscopie. Alleen die met heldere kernen kunnen succesvol differentiëren in het daaropvolgende proces. Voor protocol vier, zaai 20.000 muis embryonale stamcellen per put in de gelatine-gecoate platen en volg protocol een.
Nadat de cellen vier dagen zijn gedifferentieerd, voeg je twee microliter all trans RA-stock toe aan elke put en incubeer de plaat nog eens vier dagen. Om protocol vijf uit te voeren, herhaal protocol vier maar begin met RA-inductie na slechts twee dagen differentiatie. Voor protocol zes, plant 1,5 miljoen stamcellen in een niet-adhesief bacterieel schaaltje in 10 milliliter N2B27 medium twee en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om embryoïde lichaamsvorming mogelijk te maken.
Na twee dagen, verzamel je celaggregaten zoals eerder beschreven en suspendeer de embryoïde lichamen opnieuw met 10 milliliter vers N2B27 medium twee. Plant ze opnieuw in een nieuw niet-adhesief bacterieel schaaltje en laat ze nog twee dagen differentiëren. Op de vierde dag, verzamel en zaai ongeveer 50 embryoïde lichamen per put op gelatine-gecoate zes-putsplaten met twee milliliter N2B27 medium twee.
Voeg twee microliter all trans RA-stock toe aan elke put en induceer differentiatie nog vier dagen. Om protocol zeven uit te voeren, zaai ongeveer 20.000 cellen in twee milliliter basaal differentiatiemedium per put op de gelatine-gecoate platen. Na celhechting en twee wasbeurten met PBS, voeg je twee milliliter N2B7 medium twee toe aan elke put en laat de cellen acht dagen differentiëren bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Na het uitvoeren van fase één differentiatie met behulp van protocol drie, zaai ongeveer 500.000 muis embryonale stamcelderivaten in twee milliliter basaal differentiatiemedium per put op de 0,1% gelatine-gecoate platen. Verdeel de derivaten willekeurig in drie groepen om drie fase twee differentiatieprotocollen te testen. Incubeer de plaat gedurende zes uur, was vervolgens de cellen twee keer met twee milliliter PBS en voeg twee milliliter basaal differentiatiemedium N2B27 medium een of N2B27 medium twee toe aan elke put, afhankelijk van het protocol.
Plaats de bladen in de incubator en laat de cellen nog tien dagen differentiëren, waarbij je het corresponderende medium om de twee dagen ververst. Zeven protocollen werden getest om het optimale protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in algemene voorlopercellen of NPC's te bepalen. De protocollen werden getest op zowel A2lox-locks als 129-cellen en de differentiatiestatus van elke groep werd gecontroleerd met behulp van een lichtmicroscoop.
De meeste A2lox- en 129-derivaten vertoonden onder protocol drie goed gestapelde en neuriete-achtige morfologieën, wat wijst op de vorming van NPC's. Cellen die gedifferentieerd werden met behulp van protocol twee vertoonden echter apoptose, wat mogelijk te wijten is aan het gebrek aan voedingsstoffen binnen de embryoïde lichamen. Om de vorming van NPC's verder te bevestigen, werden nestin-positieve cellen gedetecteerd met behulp van een immunofluorescence-assay.
Protocol drie resulteerde in het hoogste percentage nestin-positieve cellen, tot 78 en 69% in respectievelijk A2lox- en 129-derivaten. Drie protocollen werden getest voor de differentiatie van NPC's in neuronen. Het werd vastgesteld dat protocol drie het meest effectief de differentiatie induceert.
De meeste A2lox- en 129-derivaten in fase twee protocol drie hadden verlengde neuron-achtige structuren met duidelijke neurieten en uitsteeksels van het cellichaam. Immunofluorescence-assays bevestigden verder de generatie van neuronen met het percentage beta tubuline drie positieve cellen tot 68 en 59% in respectievelijk A2lox- en 129-derivaten met behulp van protocol drie. Bij het uitvo
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een geoptimaliseerde en kosteneffectieve methode voor de differentiatie van embryonale stamcellen tot neuronen. Door gebruik te maken van assays met embryonale stamcellen van muizen, vertoont de techniek een hoge efficiëntie en eenvoud, waardoor deze bij uitstek geschikt is voor wijdverbreid laboratoriumgebruik in neurologisch onderzoek.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celdifferentiatie
- Stamcelbiologie
Achtergrond
- Neuronale differentiatie is essentieel voor het begrijpen van neurogenese.
- Embryoïde stamcelmodellen zijn efficiënt voor het bestuderen van celontwikkeling.
- Optimale protocollen kunnen de opbrengst en levensvatbaarheid van gedifferentieerde cellen verbeteren.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een gestandaardiseerde, efficiënte methode voor het afleiden van neuronen uit embryonale stamcellen.
- Het faciliteren van de bruikbaarheid van deze methode in verschillende laboratoria.
- Het beoordelen van verschillende protocollen om de beste resultaten in celdifferentiatie te bereiken.
Gebruikte methoden
- Celkweek in met gelatine gecoate platen en niet-adhesieve bacteriële schalen.
- Muizen-embryonale stamcellen als biologisch model voor differentiatie.
- Zeven differentiatieprotocollen met variabele condities voor de vorming van embryonale lichamen en inductie met retinoïnezuur.
- Monitoring van de differentiatie via microscopie en immunofluorescentie-assays.
- Kwaliteitscontrolemaatregelen voor de levensvatbaarheid van embryonale lichamen en het succes van de differentiatie.
Belangrijkste resultaten
- Protocol drie leverde het hoogste percentage nestine-positieve neurale precursorcellen op (78% in A2lox en 69% in 129-derivaten).
- Beta-tubuline III-positieve neuronen werden waargenomen met percentages van respectievelijk 68% voor A2lox en 59% voor 129-derivaten.
- Kwaliteitscontrole wees uit dat gezonde embryoïde lichaampjes cruciaal zijn voor een succesvolle differentiatie.
Conclusies
- Deze studie biedt een robuust instrument voor de differentiatie van embryonale stamcellen tot neuronen, wat het onderzoek in de neurobiologie versterkt.
- De beschreven methodologieën kunnen worden aangepast voor bredere toepassingen binnen de ontwikkelingsbiologie.
- Het creëert mogelijkheden voor een beter begrip van de neuronale ontwikkeling en aanverwante aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het opzetten van betrouwbare in vitro-modellen voor neurogenese is essentieel voor de validatie van targets in programma's voor neurodegeneratieve ziekten. Deze methode biedt een schaalbaar en kosteneffectief systeem voor het genereren van neurale precursorcellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in een vroeg stadium. De aanpak maakt reproduceerbare fenotypische screening en assay-ontwikkeling mogelijk voor studies naar pathway-modulatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen in neuro-ontwikkelingspaden te onderzoeken met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van nestine-positieve neurale precursorcellen voor target-engagementstudies.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de afstemming van biomarkers via kwantificeerbare resultaten, zoals de generatie van bèta-tubuline III-positieve neuronen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde neuronale populaties die geschikt zijn voor compound-screening en assays voor pathway-modulatie.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van goedkope, eenvoudig uit te voeren protocollen die compatibel zijn met multi-well plate-formaten voor een hoge doorvoer.
- Reproduceerbaarheidswaarde: Gedefinieerde stappen voor de vorming van embryoïde lichamen en retinoïnezuur-inductie waarborgen de consistentie tussen batches.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Produceert ziekterelevante neurale cellen die belangrijke mechanismen van neurogenese modelleren voor targetvalidatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale rijping in N2B27 medium II voor verlengde neuronale instandhouding en functionele assays.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen stamceldifferentiatie in de ontdekkingsfase en preklinische neurobiologische onderzoeksworkflows.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekkingsfase en maakt neurale modellen afgeleid van stamcellen mogelijk voor het testen van hypotheses over targets en de gereedheid van assays voorafgaand aan inspanningen voor lead-identificatie.
- Discovery Biology: Faciliteert mechanistische risicoreductie door een gecontroleerd systeem te bieden voor het bestuderen van neurogene routes en differentiatiedynamiek.
- Screening: Levert kwantificeerbare readouts op basis van microscopie en immunofluorescentie voor de evaluatie van compound-effecten in neurale precursor- en neuronpopulaties.
- Analytics: Genereert metrics voor differentiatie-efficiëntie op basis van percentages (nestin+, beta-tubulin III+) die een vergelijkende analyse van condities en hitselectie ondersteunen.
- Translationeel Onderzoek: Maakt continuïteit mogelijk van stamceldifferentiatie naar neuronale rijping voor downstream fenotypische en functionele validatie.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, gestandaardiseerd differentiatieplatform dat toepasbaar is op meerdere projecten binnen de neurobiologie en ontwikkelingsbiologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie door reproduceerbare generatie van neurale precursorcellen en neuronen uit mESCs.
- Operationele waarde: Vermindert technische variabiliteit via gedefinieerde kwaliteitscontrole van embryoïde lichamen en getimede inductiestappen met retinoïnezuur.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door vroege biologische read-outs te bieden in een fysiologisch relevant systeem.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets door mechanische risicoreductie in neurogenese-paden mogelijk te maken.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, het hanteren van embryonale lichamen en immunofluorescentie-assaytechnieken.
- Is afhankelijk van met gelatine gecoate platen, niet-adhesieve bacterieschalen en gecontroleerde incubatorcondities (37°C, 5% CO2).
- Maakt standaardisatie van de bereiding van de retinoïnezuur-voorraadoplossing en kwaliteitsbeoordeling van de embryonale lichamen via microscopie noodzakelijk.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het overbrengen van protocollen tussen mESC-lijnen (bijv. A2lox vs. 129-derivaten).
- Wordt beperkt door de noodzaak van strikte kwaliteitscontrole van de gezondheid van de embryonale lichamen vóór retinoïnezuur-inductie om het succes van de differentiatie te garanderen.
