In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

Dit protocol maakt het bijhouden en kwantificeren van de afbraak van een eiwit van belang in levende en vergrijzende C.elegans mogelijk. Deze in vivo en niet-invasieve techniek vereist slechts weinig microscopie opgezet om op betrouwbare wijze om te zetten Dendra2 in een heldere en stabiele fluorofofoër. De methode is aanpasbaar aan zoogdiersystemen, evenals zebravissen.

Om te studeren, zet in de omzet binnen het proteostatis netwerk, alsmede vervoer en handel. Zorg ervoor dat u geen ongewenste conversie van Dendra2 uitlokt tijdens het scannen met de blauwe lichtlaser, en om de acquisitie-instellingen en conversie-instellingen voor elk systeem en fusie-eiwit te testen en te optimaliseren. Begin met het kweken van leeftijdsgematchte aaltjes bij 20 graden Celsius tot de gewenste leeftijd voor het experiment.

Op de dag van het beeldvormingsexperiment, smelt algemene kwaliteit agarose bij een 3%-concentratie in dubbel gedestilleerd water. Terwijl de agarose is koeling, snijd de punt van een een milliliter pipet tip om aspiratie van ongeveer 400 microliter van de gesmolten agarose te vergemakkelijken. Voeg voorzichtig een paar druppels agarose op een schone glazen glijbaan en onmiddellijk plaats een andere dia op de top van de druppels om een dun pad van agarose tussen de twee glazen stukken te creëren.

Wanneer de agarose is gedroogd, verwijder dan voorzichtig de bovenste schuif. Wanneer er voldoende glijbanen zijn voorbereid, opent u de confocale microscoopsoftware en stelt u het lichtpad in voor opwinding en emissie. Voor groene Dendra2 voeg 486 tot 553 nanometer, en voor rode Dendra2 voeg 580 tot 740 nanometer.

Pas de kracht en de winst van beide kanalen aan de intensiteit van de fluorofoof aan en stel het gaatje volledig open. Selecteer een sequentiële kanaalmodus en stel de track in om elk frame te schakelen. Stel de scanmodus in als frame en de framegrootte op 1024 bij 1024 met een lijnstap van één.

Stel het middeling in op twee en gemiddeld met de gemiddelde methode en de wijze van unidirectionele lijn. Stel de bitdiepte in op acht bits. Definieer de instelling voor multidimensionale acquisitie voor de conversie van Dendra2.

Voor conversie en bleken, gebruik maken van de 405 nanometer diode laser ingesteld op 60% energievermogen. Selecteer een tijdreeks van twee cycli met een interval van 0,0 milliseconde tussen de cycli en een normale start- en stop. Stel het bleken in om te beginnen na het scannen van een van de twee, om te herhalen voor 30 iteraties en om te stoppen wanneer de intensiteit daalt tot 50%Vervolgens, definieer de snelheid van de acquisitie pixel wonen snel voor conversie en medium voor het vastleggen van een snap image.

Om de aaltjes op de dia's te monteren, gebruikt u een permanente markering om een venster met vier vierkanten op de tegenoverliggende agarosepad op elke dia te tekenen en nummer. Voeg 15 microliters levamisole toe aan het midden van het agarosepad en gebruik een stereomicroscoop en een draadpluk om voor ouderdialetjes in de druppel te brengen. Gebruik een wimper pick om voorzichtig te verplaatsen elke nematode in een venster van het plein.

Wanneer alle aaltjes zijn verplaatst, wacht tot de wormen zijn gestopt met bewegen voordat u een afdekkingslip over de vloeistof plaatst om de aaltjes tijdens de beeldvorming te immobiliseren. Plaats vervolgens de glijbaan op het confocale microscooppodium. Voor groene Dendra2 conversie, gebruik maken van het oculair van de 20 X doelstelling onder groene fluorescentie om de eerste aaltjes te lokaliseren en zich te concentreren op de kop of staart.

Schakel over naar confocale modus en verhoog of verlaag de versterkings- en laserkracht om een verzadigd, maar niet overbelicht beeld te verkrijgen. Teken een regio van belang rond het geselecteerde neuron en trek een tweede groter gebied van belang rond de staart die de eerste regio van belang omvat. Stel de eerste regio in die wordt verworven, gebleekt en geanalyseerd.

Stel de tweede interessegebied in dat moet worden verworven en geanalyseerd, maar niet gebleekt. Stel de scansnelheid in op maximaal en start de scan om de geselecteerde Dendra2-neuronen om te zetten. Onmiddellijk na de conversie, beginnen live scannen met de groene 561 nanometer laser om Dendra2 visualiseren in het rode kanaal en vind de focus en de respectieve maximale projectie van de geconverteerde neuron.

Stel de scansnelheid snel in op een lagere pixelverbedsnelheid en verkrijg een momentopname van beide kanalen met een hogere resolutie. Deze afbeelding wordt beschouwd als op het moment nul na conversie. Sla vervolgens de scan op met een identificeerbare naam en of nummer, gevolgd door het label tijd nul.

Om Dendra2 degradatie na verloop van tijd te volgen, opent u het keren nulbeeld van het respectievelijke nematodeneuron. Met behulp van dezelfde afbeelding instelling, beginnen met het scannen live in het rode kanaal en breng de omgezet rode neuron in focus. Vervolgens, zonder het wijzigen van de acquisitie parameters, het verkrijgen van een momentopname op dezelfde snelheid als de eerste afbeelding.

Zorg ervoor dat u uw conversie-instelling zorgvuldig definieert om Dendra2 efficiënt en voldoende om te zetten en om dezelfde acquisitieparameters te behouden in verschillende tijdstippen. Als u de geconverteerde Dendra2-afbeeldingen wilt analyseren, opent u de tijd nul- en tweede tijdpuntafbeeldingen in Fiji en opent u Analyseren en Metingen instellen. Selecteer de functies Gebied en Geïntegreerde dichtheid en selecteer de afbeelding die is verkregen met het rode kanaal.

Met behulp van de Polygon Selection Tool, teken een gebied van belang rond de tijd nul omgezet neuron. Als u de contouren van het neuron goed wilt identificeren, selecteert u Afbeelding, Aanpassen en Drempel om de intensiteitsdrempels te markeren. Zodra de selectie is gedefinieerd, klikt u op Analyseren en meten.

Er verschijnt een pop-upresultaatvenster, inclusief het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de geïntegreerde dichtheidswaarden voor het geselecteerde interessegebied. Voer hetzelfde selectie- en metingsproces voor de afbeelding uit vanaf het tweede tijdspunt. Kopieer vervolgens de waarden naar de spreadsheet.

In deze representatieve analyse vóór de conversie was er geen rood signaal zichtbaar toen het monster werd opgewekt in het rode kanaal. Bij bestraling nam het groene signaal af naarmate HTT-D2 werd omgezet en later een rood signaal verscheen. HTT-D2 expressie afgebroken na verloop van tijd, wat resulteert in een vermindering van de niveaus van rood HTT-D2 signaal en een mogelijke toename van de groene HTT-D2 signaal als meer fusie-eiwit werd onlangs gesynthetiseerd.

Met name de neuronen van het staartgebied bleken aanzienlijk actiever te zijn in vergelijking met die van het hoofd. Verder was er aanzienlijk meer afbraak van controle HTTQ25-D2 24 uur na conversie, dan na twee uur in zowel de kop en staart neuronen. Dit verschil werd echter niet waargenomen bij pathogene HTTQ97-D2, wat suggereerde dat het proteostasenetwerk niet in staat was HTT-D2 te verwijderen met langere glutamine zich door het hele zenuwstelsel uitstrekt.

HTTQ97-D2 werd niet zo efficiënt afgebroken als HTTQ25-D2 in zeer oude aaltjes, waarbij het onvermogen van het proteostasenetwerk werd benadrukt om geaggregeerde en mogelijk giftige soorten Huntingtine bij oudere dieren te verwijderen. Belangrijk is dat staartneuronen in staat waren om te gaan met giftige HTTQ97-D2 bij jonge aaltjes, wat suggereert dat verschillende gelijktijdige proteostase netwerkmechanismen aan het werk zouden kunnen zijn om HTT-D2 te verwijderen. Voor elk monster verwerven en niet-overbelichte en niet-verzadigde afbeelding onmiddellijk na de conversie en hergebruik dezelfde instelling voor dat monster gedurende de tijd.

Met dit protocol is het mogelijk om veranderingen in een proteostatisnetwerk te testen en ook, met behulp van microscopie met superresolutie, de verspreiding van ziektegerelateerde eiwitten te volgen.