Name: In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer eiwitomzet in vivo kwantificeren in verouderende C. elegans met behulp van photoconvertible Dendra2. Deze niet-invasieve methode maakt live imaging van eiwitdegradatie mogelijk voor onderzoek naar proteostase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP) voor financiering. We erkennen ook de Imaging Core Facility van het Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) voor het leveren van de imaging opgezet. Daarnaast willen we Diogo Feleciano bedanken die het Dendra2-systeem in het lab heeft opgezet en instructies heeft gegeven.

1. Generatie van C. elegans die neuronale Huntingtine-Dendra2 fusie-eiwit uitdrukken
<ol><li>Kloon het gen dat de POI codeert in een nematode expressievector (d.w.z. pPD95_75, Addgene #1494), door traditionele restrictie enzymvertaet10, Gibson assemblage11, of een methode van keuze. Plaats een promotor om expressie te stimuleren in een gewenst weefsel of in een gewenste ontwikkelingsfase. Plaats de Dendra2 fluorofophore n- of C-terminaal in frame met de POI.</li>
	<li>Het genereren van transgene C. elegans die de fusieconstructie uitdrukken (bijvoorbeeld via microinjectie)12. LET OP: De plasmide die het transgene draagt, blijft als een extrachromosomale array. Integratie van de constructie is niet nodig, maar kan indien gewenst worden uitgevoerd13. In dit protocol, C. elegans werden microinjected met een plasmide die de fusie constructie huntingtine exon 1-Dendra2 (HTT-D2) onder de controle van de pan-neuronale promotor Prgef-1. De C. elegans expressie ruggengraat werd verkregen uit Kreis et al.14, de huntingtine exon 1 met Q25 of Q97 werd verkregen uit Juenemann et al.15, en Dendra2 werd verkregen uit Hamer et al.16.</li>
</ol>2. Leeftijdsmatching en onderhoud van C. elegans
<ol><li>Leeftijd komen overeen met alle aaltjes door te synchroniseren met alkalische hypochloriet oplossing behandeling17 of via ei leggen voor 4 uur bij 20 °C. Voor het leggen van eieren, plaats 10 gravid volwassenen op een vers gezaaide nematode groei media (NGM) plaat en laat voor 4 uur voor het verwijderen. De eieren gelegd in deze tijdspanne zal aanleiding geven tot gesynchroniseerde aaltjes.</li>
	<li>Houd experimentele C. elegans op nematode groei media (NGM) platen gezaaid met de bacteriële voedselbron E. coli OP50, volgens standaard nematode veeteelt18.</li>
	<li>Kweek aaltjes bij 20 °C naar het gewenste stadium. Voor dit protocol zijn de vereiste leeftijden dagen 4 en 10. OPMERKING: Jongvolwassenen op dag 4 kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van eieren in hunlieren en hun hoge mobiliteit. Leeftijd dag 10 aaltjes zijn post-vruchtbaar, en ondergaan weefsel verslechtering en locomotief daling19.</li>
	<li>Voor dag 10 nematoden, passage dagelijks na de L4 fase op dag 3, zodra nematoden vruchtbaar zijn, om een gemengde bevolking te voorkomen.</li>
</ol>3. Voorbereiding van microscopieglijbanen voor beeldvorming
<ol><li>Bereid de microscopieglijbanen voor op de dag van de beeldvorming. In een magnetron, smelt algemene rang agarose bij een concentratie van 3% (w / v) in ddH2O. Laat iets afkoelen.</li>
	<li>Snijd de punt van een 1 mL pipetpunt en aspiraat ongeveer 400 μL gesmolten agarose. Plaats voorzichtig een paar druppels agarose op een schone glazen glijbaan en plaats onmiddellijk een andere dia op de top, ervoor te zorgen dat een dunne pad van agarose wordt gemaakt tussen de twee. Laat drogen voordat u de bovenkant voorzichtig schuift of optilt.</li>
	<li>Plaats de agarose pad glijbanen in een bevochtigde container om te voorkomen dat ze uitdrogen. Deze kunnen binnen 2-3 uur worden gebruikt. OPMERKING: Vermijd vorming van kleine belletjes in de agarose, omdat de aaltjes erin kunnen worden opgesloten.</li>
</ol>4. Definitie van confocale microscoopparameters
OPMERKING: Definieer alle instellingen op de confocale acquisitiesoftware voordat u de aaltjes en gegevensverwerving monteert. De instellingen kunnen worden aangepast aan de imaging hardware en software van keuze.
<ol><li>Open de confocale software en definieer de laserbeeldvormingsinstellingen. Stel het lichtpad in voor excitatie/emissie voor groene Dendra2 op 486-553 nm en voor rode Dendra2 op 580-740 nm. Pas het vermogen en de winst van beide kanalen/lasers aan op basis van de intensiteit van de fluorofoof. Verander de digitale versterking of offset niet en stel het gaatje zo volledig open.</li>
	<li>Definieer de acquisitie-instelling: selecteer een sequentiële kanaalmodus en schakel van spoor over elk frame. Stel de scanmodus in als frame en de framegrootte op 1.024 x 1.024, met een regelstap van 1. Stel het middeling in op 2 en gemiddeld met gemiddelde methode en wijze van unidirectionele lijn. Stel de bitdiepte in op 8 bits.</li>
	<li>Definieer de instellingen voor multidimensionale acquisities voor de conversie van Dendra2. Voor conversie en bleken gebruik maken van de 405 nm diode laser ingesteld op 60% energievermogen. Activeer indien beschikbaar de veilige blekende GaAsP om de detectoren te beschermen.</li>
	<li>Selecteer een tijdreeks van twee cycli, met een interval van 0,0 ms ertussen en een normale start en stop. Begin met bleken na scan 1 van 2 en herhaal voor 30 iteraties. Stop met bleken wanneer de intensiteit daalt tot 50%.</li>
	<li>Definieer de snelheid van acquisitie/pixelbewoning zo snel (bijvoorbeeld maximaal = 12) voor conversie en gemiddelde snelheid (bijvoorbeeld medium = 5) voor het vastleggen van een snap-afbeelding. OPMERKING: De hier gedefinieerde bleekparameters zijn richtlijnen. Voor andere Dendra2-getagde POI's moeten de laserkrachtinstellingen en het bleken van iteraties en waarden empirisch worden vastgesteld.</li>
</ol>5. Montage van C. elegans op microscopieglijbanen
OPMERKING: Plaats indien mogelijk een stereomicroscoop die in de montage dicht bij de confocale microscoopopstelling staat en monteer de aaltjes vlak voor beeldvorming.
<ol><li>Op de glazen deksel schuif aan de andere kant van de agarose pad, teken een venster met vier vierkanten met een permanente marker en nummer ze.</li>
	<li>Pipet 15 μL levamisole in het midden van het agarosepad. De concentratie levamisole zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de nematode: Bij beeldvorming dag 4 aaltjes gebruiken 2 mM levamisole; bij beeldvorming dag 10 aaltjes gebruiken 0,5 mM levamisole.</li>
	<li>Breng vier aaltjes in de vloeistof met behulp van een draad te halen. Met behulp van een wimper pick, voorzichtig bewegen elke individuele aaltje naar een venster vierkant. Draai de wimper zodat elk spoor van E. coli OP50 wordt verdund en de fluorescerende achtergrond niet interfereert met signaalverwerving.</li>
	<li>Wacht tot de aaltjes bijna stoppen met bewegen en plaats voorzichtig een afdekkingslip bovenop de vloeistof om de aaltjes in de laag levamisole tussen het agarosepad en de afdekslip te immobiliseren.</li>
	<li>Plaats de omgekeerde dia op het confocale stadium om de aaltjes in beeld te brengen.</li>
</ol>6. Conversie van groene Dendra2: Data-acquisitie op tijd nul
OPMERKING: De puls-chase experimenten beginnen met het onomkeerbaar omzetten van de Dendra2 fusie-eiwit van een groene emitterende fluorofofoër naar een rode.
<ol><li>Met behulp van het oculair van de microscoop, zoek de eerste nematode met een 20x doelstelling onder groene fluorescentie. Focus op de kop of staart en schakel over naar confocale modus.</li>
	<li>Start live laserscanning met de 488 nm blauwe laser om de groene Dendra2 in het EGFP groene kanaal te visualiseren (ex/em = 486-553 nm). Selecteer een enkel neuron en breng het in beeld. Zoom 3x in en verhoog het doel van de laserstraal4. OPMERKING: Selecteer één neuron per nematode. Elk neuron vormt één monster of gegevenspunt.</li>
	<li>Zoek het maximale projectievlak en verhoog of verlaag, afhankelijk van de helderheid van de fluorofofoof, de versterking of laserkracht om een verzadigd maar niet overbelicht beeld te verkrijgen dat herkenbaar is aan de kleurbereikindicator. Zodra dit is gedefinieerd, stopt u het scannen. LET OP: Bestraal het monster niet te lang of met te veel vermogen, want excitatie met zichtbaar blauw 488 nm-licht kan Dendra2 ook omzetten, zij het langzaam en minder efficiënt4.</li>
	<li>Open in de software het tabblad om de regio's van belang (ROI's) te selecteren en een eerste ROI rond het geselecteerde neuron te maken. Definieer een grotere tweede interesseregio die het hoofd van de nematode omvat en inclusief de eerste ROI.</li>
	<li>Selecteer in de kleurinstellingen voor de eerste ROI die moet worden verworven, gebleekt en geanalyseerd. Selecteer voor de tweede ROI die moet worden verworven en geanalyseerd, maar niet gebleekt.</li>
	<li>Stel de scansnelheid in op maximaal (d.w.z. snelle pixeldwell) en start het experiment om de geselecteerde Dendra2-neuronen om te zetten. OPMERKING: Zodra het experiment is uitgevoerd, resulteert de verkregen afbeelding in twee afbeeldingen: één voor en één na conversie. Voor het groene kanaal moet het eerste beeld een hoger groen signaal hebben dat in het tweede beeld afneemt als gevolg van de omzetting van de groene Dendra2. Voor het rode kanaal moet de eerste afbeelding negatief zijn en geen signaal weergeven, met een rood signaal dat in de after conversion-afbeelding verschijnt. Als het groene signaal niet afneemt, is de conversie niet uitgevoerd en moeten de instellingen, zoals de 405-laserkracht of het aantal iteraties, worden gewijzigd. Als er een rood signaal in het eerste beeld, dan is de 488 nm laservermogen gebruikt was te hoog en een deel van de groene Dendra2 was al omgezet in rood. In dit geval moet een nieuw neuron/nematode worden geselecteerd.</li>
	<li>Direct na conversie start live scannen met de groene 561 nm laser om Dendra2 te visualiseren in het rode kanaal (ex/em = 580-740 nm). Zoek de focus en de respectieve maximale projectie van het geconverteerde neuron met behulp van het bereik kleurindicator om overbelichting te voorkomen.</li>
	<li>Stel de scansnelheid snel in op een lagere pixelwoningsnelheid (bijvoorbeeld 5x) en verkrijg een momentopname van beide kanalen met een hogere resolutie. Deze afbeelding wordt gedefinieerd als timepoint zero (T0) na conversie. OPMERKING: De snelheid van acquisitie voor de geconverteerde afbeelding kan worden gevarieerd. Echter, eenmaal gekozen, deze snelheid moet constant blijven tijdens het verzamelen van gegevens.</li>
	<li>Sla de scan op met een identificeerbare naam en/of getal, gevolgd door het time zero label (T0). OPMERKING: Het is raadzaam om ook het beeld van het conversie-experiment (stap 6.6) op te slaan om het ontbreken van rood signaal voor conversie en het uiterlijk daarna te illustreren.</li>
</ol>7. Beeldvorming van omgezette rode Dendra2 voor gegevensverwerving op een geselecteerd tweede keerpunt
<ol><li>Om Dendra2-degradatie na verloop van tijd bij te houden, definieert u een tweede timepoint om dezelfde aalematode/neuron opnieuw teimen. Selecteer het tweede timepoint experimenteel om een relevante biologische vraag aan te pakken. Voor het protocol hier beschreven, Dendra2 is afgebeeld zowel op 2 uur (T2) en 24 uur (T24) na conversie.<ol>
<li>Op het geselecteerde momentpunt, vind dezelfde nematode / neuron met het gebruik van het oculair en rode fluorescentie.</li>
		<li>Open de T0-afbeelding van de desbetreffende nematode/neuron en herlaad/hergebruik de afbeeldingsinstellingen. Zorg ervoor dat de acquisitie-instellingen van de momentopname precies hetzelfde zijn bij het verkrijgen van de T0-, T2- en T24-beelden.</li>
		<li>Het scannen van live in het rode kanaal, breng de omgezet rode neuron in focus. Omdat de rode Dendra2 na verloop van tijd degradeert, zal de bereikindicator een minder intense maximale projectie laten zien. Wijzig geen acquisitieparameters en verkrijg een momentopname met dezelfde snelheid (bijvoorbeeld 5x) als de eerste afbeelding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om de degradatie van Dendra2 na 4 uur of langer bij te houden, red je de aaltjes na de omzetting.<ol>
<li>Verwijder de dia onmiddellijk na het converteren en imaging van de vier aaltjes. Verwijder voorzichtig de coverslip en met behulp van een draad pick, til elke nematode uit de agarose pad.</li>
		<li>Plaats elke nematode afzonderlijk op een op de juiste wijze geëtiketteerde en identificeerbare NGM-plaat.</li>
		<li>Voor de tweede keer punt, monteer de nematode opnieuw op een verse agarose pad en ga verder met de beeldvorming van de omgebouwde rode Dendra2 volgens de instructies in sectie 6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Beeldanalyse van omgerekend Dendra2
OPMERKING: Analyse van de afbraak van Dendra2 wordt uitgevoerd met Fiji / ImageJ software20.
<ol><li>Open Fiji en sleep en zet het .lsm-bestand in de Fiji-balk. Open de T0-afbeelding die net na de conversie is genomen en de afbeelding van dezelfde nematode die is genomen op het geselecteerde tijdstip na conversie (T2 of T24 h). OPMERKING: Om de afbraak van het eiwit van belang gefuseerd naar Dendra2 te volgen, hoeft alleen het rode kanaal te worden geanalyseerd.</li>
	<li>De meetparameters in het menu bepalen: Analyseren | Metingen instellen. Selecteer de functies Area en Integrated Density.</li>
	<li>Selecteer de afbeelding verkregen met het rode kanaal. Selecteer het selectiegereedschap Veelhoeken in de fiji-balk.</li>
	<li>Identificeer het geconverteerde neuron op de T0-afbeelding en teken er een ROI omheen met behulp van het selectiegereedschap.<ol>
<li>Als u de contouren van het neuron goed wilt identificeren, markeert u de intensiteitsdrempels door te selecteren in de balkAfbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Sleep de balkcursor om de drempelwaarde af te bakenen en volg rond dit gebied met het gereedschap veelhoek. Om een nauwkeurige ROI te genereren, is het ook mogelijk om de contour van het geselecteerde neuron uit het groene kanaal te gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de selectie is gemaakt in het rode kanaal venster, druk op Analyseren | Meten. Er verschijnt een pop-upvenster met de naam Resultaten en bevat de ROI-waarden voor Area, IntDenen RawIntDen.</li>
	<li>Voer hetzelfde selectie- en metingsproces uit voor de afbeelding van het tweede tijdspunt (T2 of T24 h).</li>
	<li>Kopieer de verkregen waarden in een spreadsheetsoftware, waarbij u ervoor zorgt dat de waarden op T0 na conversie en op T2 of T24 na conversie op de juiste manier worden geregistreerd.</li>
</ol>9. Berekening van de verhouding van dendra2 degradatie
<ol><li>Om de verhouding van de afbraak te berekenen, wijst u eerst een waarde van 1 (of 100%) toe om de degradatie van tijdpunt nul (d.w.z. net na omzetting, wanneer alle rode omgezet Dendra2 nog aanwezig is) te timen. Dit vloeit voort uit het zelf verdelen van de waarde van IntRawDen van T0.</li>
	<li>Om de vermindering van het rode Dendra2 intensiteitssignaal in de loop van de tijd en de degradatie te berekenen, deelt u de waarde van RawIntDen van het tweede tijdspunt (bijvoorbeeld T2 of T24 h) door de waarde van de RawIntDen van T0. Het resulterende aantal moet kleiner zijn dan 1. Deze waarden kunnen ook worden uitgedrukt als percentages, die T0 definiëren als 100%.</li>
	<li>Herhaal sectie 7 voor elke omgezet aaltje. Voor een grafische weergave van de afbraak van Dendra2, grafiek een spreiding plot of staafgrafiek met het percentage of de verhouding waarden van fluorescentie daling verkregen in de y-as. Pas een gewenste statistische analyse toe en illustreer deze op de grafiek.</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li>
<li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li>
<li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005(2015).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RasGRP%2C+C.+elegans+RGEF-1b%2C+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+%28Ras%29+in+Sensory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li>
<li>Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773(2013).</li>
<li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li>
<li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li>
<li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li>
<li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li>
<li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li>
<li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105(2018).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om de functie van een eiwit te begrijpen is het belangrijk om de synthese, locatie en afbraak ervan te begrijpen. Met de ontwikkeling van nieuwe, stabiele en heldere FPs is het visualiseren en monitoren van POI's eenvoudiger en efficiënter geworden. Genetisch uitgedrukte fusieps zoals Dendra2 zijn uniek gepositioneerd om de stabiliteit van een POI te bestuderen. Bij blootstelling aan paars-blauw licht breekt Dendra2 op een precieze locatie binnen een triade van geconserveerde aminozuren. De fluorofophore ondergaat een kl...

Het proteoom van een levend organisme vernieuwt zichzelf voortdurend. Eiwitten worden voortdurend afgebroken en gesynthetiseerd volgens de fysiologische vraag van een cel. Sommige eiwitten worden snel geëlimineerd, terwijl andere langer worden geleefd. Het monitoren van eiwitdynamica is een eenvoudigere, nauwkeurigere en minder invasieve taak bij het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (FPs). FPs vormen auto-katatisch en kunnen worden gefuseerd tot elk eiwit van belang (POI), maar vereisen geen enzymen te vouwen of cofactoren nodig, behalve voor zuurstof1. Een nieuwere generatie FPs is onlangs ontworpen om kleur te schakelen op bestraling met een lichtpuls van bepaalde golflengte. Deze fotoactivatable FPs (PAF's) maken het mogelijk om POI's, organellen of cellen waarin ze zich bevinden, te labelen en bij te houden, en om hun kwantitatieve en/of kwalitatieve parameters te onderzoeken2. FPs maken het mogelijk om elke POI's beweging, directionaliteit, snelheid van beweging, coëfficiënt van diffusie, mobiele versus onbeweeglijke breuken, de tijd dat het zich in een cellulair compartiment, evenals de omloopsnelheid. Voor specifieke organellen kunnen bewegings- en transport- of splijtings- en fusiegebeurtenissen worden bepaald. Voor een bepaald celtype kunnen de positie, de verdelingssnelheid, het volume en de vorm van een cel worden vastgesteld. Cruciaal is dat het gebruik van PAFP's tracking mogelijk maakt zonder continue visualisatie en zonder interferentie van een nieuw gesynthetiseerde sonde. Studies zowel in cellen als in hele organismen hebben met succes PAFP's gebruikt om biologische vraagstukken in vivo aan te pakken, zoals de ontwikkeling van kanker en metastase, assemblage of demontage van het cytoskelet en RNA-DNA/eiwit interacties3. In dit manuscript worden lichtmicroscopie en PAFP's gebruikt om de omloopsnelheid van het aggregatiegevoelige eiwit huntingtine (HTT) in vivo bloot te leggen in een C. elegans-model van neurodegeneratieve ziekte.
Het hier beschreven protocol kwantificeert de stabiliteit en afbraak van het fusie-eiwit huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 is een monomerieke PAFP4 van de tweede generatie die zijn emissie/excitatiespectra onomkeerbaar schakelt van groen naar rood in reactie op UV of zichtbaar blauw licht, met een toename van de intensiteit tot 4.000-voudig5,6. Huntingtine is het eiwit dat verantwoordelijk is voor het veroorzaken van de ZvH, een fatale erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Huntingtine exon-1 bevat een stuk glutamines (CAG, Q). Wanneer het eiwit wordt uitgedrukt met meer dan 39Q, het misfolds in een mutant, giftig en pathogene eiwit. Mutant HTT is gevoelig voor aggregatie en leidt tot neuronale celdood en degeneratie, hetzij als korte oligomerische soorten of als grotere zeer gestructureerde amyloïden7.
De nematode is een modelsysteem voor het bestuderen van veroudering en neurodegeneratie dankzij het gemak van manipulatie, isogene aard, korte levensduur, en de optische transparantie8. Om de stabiliteit van HTT in vivo te bestuderen, werd een fusieconstructie uitgedrukt in het zenuwstelsel van C. elegans. Een HTT-D2 transgene met ofwel een fysiologische stretch van 25Qs (HTTQ25-D2) of een pathologisch traject van 97Qs (HTTQ97-D2) is overexpressed pan-neuronally gedurende de levensduur van de nematode9. Door live C. elegans te onderwerpen aan een kort en gefocust lichtpunt, wordt een enkel neuron gefotoswitcheerd en wordt de omgebouwde HTT-D2 in de loop van de tijd bijgehouden. Om de hoeveelheid HTT-D2 te laten afnemen, wordt het verschil tussen het rode signaal van de vers omgebouwde HTT-D2 vergeleken met het resterende rode signaal van HTT-D2 na een bepaalde periode. Daarom wordt het mogelijk om te onderzoeken hoe huntingtine wordt afgebroken wanneer het in zijn uitgebreide en toxische vorm wordt gevonden in vergelijking met zijn fysiologische vorm; hoe anterie of achterste neuronen anders reageren op de aanwezigheid van Q97 versus Q25, vooral over langere perioden; en hoe de ineenstorting van het proteostasenetwerk (PN) tijdens de vergrijzing bijdraagt aan de verschillen in degradatiepercentages. Deze resultaten beschrijven slechts een kleine reeks opmerkingen over de omzet van HTT-D2. Echter, veel meer biologische vragen die relevant zijn voor zowel het gebied van eiwit aggregatie en proteostase kan worden aangepakt met deze in vivo toepassing.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>Agarose, Universal Grade</td><td>Bio &amp; Sell GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td>Mounting slide component</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>Deckgl&auml;ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>Cover slips</td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20x/0.50 Ph2 M27</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Objective</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 1.52p</td><td>NIH</td><td></td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Levamisole Hydrochloride</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>Anesthetic</td></tr><tr><td>LSM710-ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Laser Scanning Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Mounting stereomicroscope</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Mounting microscope</td></tr><tr><td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td><td>this paper</td><td></td><td>C. elegans strain</td></tr><tr><td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td><td>this paper</td><td></td><td>C. elegans strain</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OP50</td><td>Nematode food source</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>Standard-Objekttrã¤ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>ZEN2010 B SP1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Confocal acquisition software</td></tr></tbody></table>

in vivo kwantificering van eiwitomzet in aging c. elegans met behulp van photoconvertible dendra2

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Eiwitten worden voortdurend gesynthetiseerd en afgebroken in een cel om homeostase te behouden. In staat zijn om de afbraak van een eiwit van belang te controleren is de sleutel tot het begrijpen van niet alleen de levenscyclus, maar ook om onevenwichtigheden in het proteostasenetwerk aan het licht te brengen. Deze methode laat zien hoe de afbraak van het ziekteverwekkende eiwit huntingtine kan worden gevolgd. Twee versies van huntingtine gefuseerd tot Dendra2 worden uitgedrukt in het C. elegans zenuwstelsel: een fysiologische versie of een met een uitgebreide en pathogene strook glutamines. Dendra2 is een fotoconverteerbaar fluorescerend eiwit; op een korte ultraviolette (UV) bestraling puls, Dendra2 schakelt zijn excitatie / emissie spectra van groen naar rood. Net als bij een pulse-chase experiment, kan de omzet van de omgebouwde red-Dendra2 worden gecontroleerd en gekwantificeerd, ongeacht de interferentie van nieuw gesynthetiseerd groen-Dendra2. Met behulp van confocale microscopie en door de optische transparantie van C. elegansis het mogelijk om de afbraak van huntingtine-Dendra2 in een levend, ouder wordend organisme te monitoren en te kwantificeren. Neuronale huntingtine-Dendra2 wordt kort na de conversie gedeeltelijk afgebroken en in de loop van de tijd verder gewist. De systemen die de afbraak beheersen zijn ontoereikend in aanwezigheid van mutant huntingtine en worden verder aangetast door veroudering. Neuronale subtypes binnen hetzelfde zenuwstelsel vertonen verschillende omzetcapaciteiten voor huntingtine-Dendra2. Over het algemeen kan het monitoren van een eiwit dat met Dendra2 is gesmolten, belangrijke informatie opleveren, niet alleen over de degradatie en de spelers van het betrokken proteostasenetwerk, maar ook over de locatie, de handel en het vervoer ervan.

Twee nematodestammen die het huntingtine exon-1 eiwitfragment in frame met het fotoconvertible eiwit Dendra2 uitdrukken, werden verkregen via micro-injectie en de plasmiden werden bewaard als een extrachromosomale array. De fusieconstructie werd uitgedrukt in het hele C. elegans zenuwstelsel van ontwikkeling tijdens de veroudering. Hier bevatte HTT-D2 ofwel de fysiologische 25 polyglutamine stretch (HTTQ25-D2, Figuur 1A) of een volle...

Hier gepresenteerd is een protocol om de afbraak van het eiwit huntingtine gefuseerd aan de fotoconvertible fluorophore Dendra2 te controleren.

In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Dit protocol maakt het bijhouden en kwantificeren van de afbraak van een eiwit van belang in levende en vergrijzende C.elegans mogelijk. Deze in vivo en niet-invasieve techniek vereist slechts weinig microscopie opgezet om op betrouwbare wijze om te zetten Dendra2 in een heldere en stabiele fluorofofoër. De methode is aanpasbaar aan zoogdiersystemen, evenals zebravissen.Om te studeren, zet in de omzet binnen het proteostatis netwerk, alsmede vervoer en handel. Zorg ervoor dat u geen ongewenste conversie van Dendra2 uitlokt tijdens het scannen met de blauwe lichtlaser, en om de acquisitie-instellingen en conversie-instellingen voor elk systeem en fusie-eiwit te testen en te optimaliseren. Begin met het kweken van leeftijdsgematchte aaltjes bij 20 graden Celsius tot de gewenste leeftijd voor het experiment.Op de dag van het beeldvormingsexperiment, smelt algemene kwaliteit agarose bij een 3%-concentratie in dubbel gedestilleerd water. Terwijl de agarose is koeling, snijd de punt van een een milliliter pipet tip om aspiratie van ongeveer 400 microliter van de gesmolten agarose te vergemakkelijken. Voeg voorzichtig een paar druppels agarose op een schone glazen glijbaan en onmiddellijk plaats een andere dia op de top van de druppels om een dun pad van agarose tussen de twee glazen stukken te creëren.Wanneer de agarose is gedroogd, verwijder dan voorzichtig de bovenste schuif. Wanneer er voldoende glijbanen zijn voorbereid, opent u de confocale microscoopsoftware en stelt u het lichtpad in voor opwinding en emissie. Voor groene Dendra2 voeg 486 tot 553 nanometer, en voor rode Dendra2 voeg 580 tot 740 nanometer.Pas de kracht en de winst van beide kanalen aan de intensiteit van de fluorofoof aan en stel het gaatje volledig open. Selecteer een sequentiële kanaalmodus en stel de track in om elk frame te schakelen. Stel de scanmodus in als frame en de framegrootte op 1024 bij 1024 met een lijnstap van één.Stel het middeling in op twee en gemiddeld met de gemiddelde methode en de wijze van unidirectionele lijn. Stel de bitdiepte in op acht bits. Definieer de instelling voor multidimensionale acquisitie voor de conversie van Dendra2.Voor conversie en bleken, gebruik maken van de 405 nanometer diode laser ingesteld op 60% energievermogen. Selecteer een tijdreeks van twee cycli met een interval van 0,0 milliseconde tussen de cycli en een normale start- en stop. Stel het bleken in om te beginnen na het scannen van een van de twee, om te herhalen voor 30 iteraties en om te stoppen wanneer de intensiteit daalt tot 50%Vervolgens, definieer de snelheid van de acquisitie pixel wonen snel voor conversie en medium voor het vastleggen van een snap image.Om de aaltjes op de dia's te monteren, gebruikt u een permanente markering om een venster met vier vierkanten op de tegenoverliggende agarosepad op elke dia te tekenen en nummer. Voeg 15 microliters levamisole toe aan het midden van het agarosepad en gebruik een stereomicroscoop en een draadpluk om voor ouderdialetjes in de druppel te brengen. Gebruik een wimper pick om voorzichtig te verplaatsen elke nematode in een venster van het plein.Wanneer alle aaltjes zijn verplaatst, wacht tot de wormen zijn gestopt met bewegen voordat u een afdekkingslip over de vloeistof plaatst om de aaltjes tijdens de beeldvorming te immobiliseren. Plaats vervolgens de glijbaan op het confocale microscooppodium. Voor groene Dendra2 conversie, gebruik maken van het oculair van de 20 X doelstelling onder groene fluorescentie om de eerste aaltjes te lokaliseren en zich te concentreren op de kop of staart.Schakel over naar confocale modus en verhoog of verlaag de versterkings- en laserkracht om een verzadigd, maar niet overbelicht beeld te verkrijgen. Teken een regio van belang rond het geselecteerde neuron en trek een tweede groter gebied van belang rond de staart die de eerste regio van belang omvat. Stel de eerste regio in die wordt verworven, gebleekt en geanalyseerd.Stel de tweede interessegebied in dat moet worden verworven en geanalyseerd, maar niet gebleekt. Stel de scansnelheid in op maximaal en start de scan om de geselecteerde Dendra2-neuronen om te zetten. Onmiddellijk na de conversie, beginnen live scannen met de groene 561 nanometer laser om Dendra2 visualiseren in het rode kanaal en vind de focus en de respectieve maximale projectie van de geconverteerde neuron.Stel de scansnelheid snel in op een lagere pixelverbedsnelheid en verkrijg een momentopname van beide kanalen met een hogere resolutie. Deze afbeelding wordt beschouwd als op het moment nul na conversie. Sla vervolgens de scan op met een identificeerbare naam en of nummer, gevolgd door het label tijd nul.Om Dendra2 degradatie na verloop van tijd te volgen, opent u het keren nulbeeld van het respectievelijke nematodeneuron. Met behulp van dezelfde afbeelding instelling, beginnen met het scannen live in het rode kanaal en breng de omgezet rode neuron in focus. Vervolgens, zonder het wijzigen van de acquisitie parameters, het verkrijgen van een momentopname op dezelfde snelheid als de eerste afbeelding.Zorg ervoor dat u uw conversie-instelling zorgvuldig definieert om Dendra2 efficiënt en voldoende om te zetten en om dezelfde acquisitieparameters te behouden in verschillende tijdstippen. Als u de geconverteerde Dendra2-afbeeldingen wilt analyseren, opent u de tijd nul- en tweede tijdpuntafbeeldingen in Fiji en opent u Analyseren en Metingen instellen. Selecteer de functies Gebied en Geïntegreerde dichtheid en selecteer de afbeelding die is verkregen met het rode kanaal.Met behulp van de Polygon Selection Tool, teken een gebied van belang rond de tijd nul omgezet neuron. Als u de contouren van het neuron goed wilt identificeren, selecteert u Afbeelding, Aanpassen en Drempel om de intensiteitsdrempels te markeren. Zodra de selectie is gedefinieerd, klikt u op Analyseren en meten.Er verschijnt een pop-upresultaatvenster, inclusief het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de geïntegreerde dichtheidswaarden voor het geselecteerde interessegebied. Voer hetzelfde selectie- en metingsproces voor de afbeelding uit vanaf het tweede tijdspunt. Kopieer vervolgens de waarden naar de spreadsheet.In deze representatieve analyse vóór de conversie was er geen rood signaal zichtbaar toen het monster werd opgewekt in het rode kanaal. Bij bestraling nam het groene signaal af naarmate HTT-D2 werd omgezet en later een rood signaal verscheen. HTT-D2 expressie afgebroken na verloop van tijd, wat resulteert in een vermindering van de niveaus van rood HTT-D2 signaal en een mogelijke toename van de groene HTT-D2 signaal als meer fusie-eiwit werd onlangs gesynthetiseerd.Met name de neuronen van het staartgebied bleken aanzienlijk actiever te zijn in vergelijking met die van het hoofd. Verder was er aanzienlijk meer afbraak van controle HTTQ25-D2 24 uur na conversie, dan na twee uur in zowel de kop en staart neuronen. Dit verschil werd echter niet waargenomen bij pathogene HTTQ97-D2, wat suggereerde dat het proteostasenetwerk niet in staat was HTT-D2 te verwijderen met langere glutamine zich door het hele zenuwstelsel uitstrekt.HTTQ97-D2 werd niet zo efficiënt afgebroken als HTTQ25-D2 in zeer oude aaltjes, waarbij het onvermogen van het proteostasenetwerk werd benadrukt om geaggregeerde en mogelijk giftige soorten Huntingtine bij oudere dieren te verwijderen. Belangrijk is dat staartneuronen in staat waren om te gaan met giftige HTTQ97-D2 bij jonge aaltjes, wat suggereert dat verschillende gelijktijdige proteostase netwerkmechanismen aan het werk zouden kunnen zijn om HTT-D2 te verwijderen. Voor elk monster verwerven en niet-overbelichte en niet-verzadigde afbeelding onmiddellijk na de conversie en hergebruik dezelfde instelling voor dat monster gedurende de tijd.Met dit protocol is het mogelijk om veranderingen in een proteostatisnetwerk te testen en ook, met behulp van microscopie met superresolutie, de verspreiding van ziektegerelateerde eiwitten te volgen.

in-vivo-quantification-protein-turnover-aging-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.

Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.

Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Het onderwijs in biologische wetenschappen kan voor studenten stimulerender worden gemaakt door het gebruik van experimenten. Dit manuscript presenteert twee verschillende maar complementaire protocollen die in de klas kunnen worden gebruikt om studenten aan te moedigen hypothesen te formuleren en te testen met betrekking tot calorierijke diëten, uithongering en veroudering.

Goedkope kleurstoffen gebruiken om glycogeenaccumulatie en darmintegriteit bij Caenorhabditis elegans te visualiseren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

Leer eiwitomzet in vivo kwantificeren in verouderende C. elegans met behulp van photoconvertible Dendra2. Deze niet-invasieve methode maakt live imaging van eiwitdegradatie mogelijk voor onderzoek naar proteostase.

In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

Meer video's verkennen