Beoordeling van de globale oculaire structuur na de ruimtevaart met behulp van een micro-computertomografie (Micro-CT) Imaging Methode
27 oktober 2020
We presenteren een protocol met behulp van hoge-resolutie micro-computertomografie imaging om te bepalen of ruimtevlucht veroorzaakte schade aan oculaire structuren. Het protocol toont de micro-CT-afgeleide meting van ex vivo knaagdier oculaire structuren. We tonen de mogelijkheid om oculaire morfologische veranderingen na de ruimtevaart te beoordelen met behulp van een niet-destructieve driedimensionale techniek om oculaire schade te evalueren.
Hier stellen we een methode voor voor de beoordeling van de wereldwijde oculaire structuur na de ruimtevaart met behulp van micro-computer tomografie imaging methode. De ruimtevlucht omgeving, die parazwaartekracht en blootstelling aan straling omvat, veroorzaakt unieke veranderingen in de menselijke fysiologie, met inbegrip van vloeistofverschuivingen. Deze vloeistof verschuivingen leiden tot verhoogde intracraniale druk en is toegeschreven als een belangrijke oorzaak van de ruimtevaart geassocieerde neuro-oculair syndroom.
De fysiologische impact van SANS effecten meerdere componenten van het oog en omvat optische schijf oedeem, globe flattening, choroïdale en retinale plooien, hyperopische en breking fout verschuivingen, en zenuwvezel laag infracts. Hoewel de fysiologische kenmerken van SANS goed gedocumenteerd zijn, worden de mechanismen die SANS aansturen nog steeds slecht begrepen. Om een beter begrip van SANS te hebben, worden knaagdiermodellen gebruikt voor niet-invasieve beeldvormingstechnieken.
Een van deze technieken is micro-CT, die met succes is gebruikt voor de evaluatie van anatomische structuren en pathologische processen bij dieren zo klein als muizen. Micro-CT kan een micro-sized resolutie te bereiken, en door de combinatie met een contrastmiddel, kan het een goed contrast voor de zachte weefsels. Micro-CT biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van traditionele methoden, waaronder bruto anatomie, lichtmicroscopie en histologieonderzoek om geen schade te toebrengen aan het geometrische profiel van de specimens en de ruimtelijke relaties tussen de structuren.
In onze huidige studie werden muizen 35 dagen blootgesteld aan de ruimteomgeving aan boord van het International Space Station om te bepalen of de ruimteomgeving oculaire schade veroorzaakt door de microstructuur van het netvlies, RPE en choroïdelagen te kwantificeren met Micro-CT. Hier hebben we aangetoond hoe we monsters hebben voorbereid voor micro-CT-analyse. Muizen werden gebruikt en ogen binnen 38 plus of min vier uur na splash down.
Ogen werden inugebruik, en de linker ogen werden vastgesteld in vier procent paraformaldehyde en fosfaat buffers zout gedurende 24 uur. Na fixatie werden de ogen uitgedroogd in ethanol. Om een verdere en abrupte krimp van het vaste monster te voorkomen, werd een gesorteerde reeks ethanotische oplossingen gebruikt.
Eerst werden de monsters overgebracht naar 50% ethanol gedurende een uur en vervolgens verhoging van de concentraties voor een uur per stuk, 70, 80, 90, 96, en 100%Daarna, de ogen werden gekleurd met 10% gewicht per volume fosfolipidzuur gedurende zes dagen. Ten slotte werden monsters gewassen in absolute ethanol en vervolgens geplaatst in individuele twee molen plastic containers gevuld met absolute ethanol voor het scannen. Een wattenschijfje werd ook toegevoegd om het monster te stabiliseren tijdens het scannen.
Vervolgens werd het monster geplaatst in een desktop x-ray Micro-CT-systeem SkyScan 1272 scanner om de retinale schade te evalueren. Voor het scannen gebruikten we de SkyScan 1272-software. Na het openen van de software, hebben we gecentreerd ons monster in het frame.
In ons protocol gebruiken we geen filter en stellen we de matrix in om de pixelgrootte te vergroten tot vier micron. Micropositionering wordt gebruikt om het monster gecentreerd in het frame te houden. Vervolgens controleren we de parameters om het contrastmiddel in ons monster te maximaliseren en de machine te kalibreren.
Om de kalibratie uit te voeren, verwijderen we het monster uit de scanner en stellen we de scanparameters in. Tijdens de kalibratie wordt ook een vlakke correctie gecontroleerd. Het moet groter zijn dan 80%Na kalibraties wordt het monster opnieuw in de scankamer geplaatst.
Voordat u scant, worden de voorbeeldbestanden benoemd. Scanparameters zijn als volgt, rotatiestap 0.4, frames vier, willekeurige beweging 30, dubbel controleren of de pixelgrootte is ingesteld op 4 micron. Dan wordt de scan gestart.
Na het scannen wordt NRecon gebruikt om het monster te reconstrueren. Eerst openen we de bestanden van de scan en bekijken we de raw-scanafbeeldingen. We passen de bounce van het histogram aan om binnen de curve te passen.
Vervolgens corrigeren we voor de straal verharding artefact. Dan passen we het gladmakende artefact aan. Tot slot corrigeren we voor de ring artefact reductie.
Na alle correcties hebben we bevestigd dat onze monsters binnen onze regio van belang passen. Dan kunnen we beginnen met de wederopbouw. We gebruiken de DataViewer-software om de gereconstrueerde beelden in alle drie de velden te visualiseren.
Voor analyse wordt de CTAn-software gebruikt. De gereconstrueerde beelden worden in de software geladen. De optische zenuw werd gebruikt om het gebied van belang voor analyse te delimineren.
Door berekening, gebruikten we het middelste segment van het gebied van belang om alle metingen uit te voeren voor analyse. Er werden drie herhaalde metingen uitgevoerd om de lineaire meting van het gebied te berekenen. De volgende metingen werden genomen voor oculaire weefsels, retina, RPE, choroïde, en Onze Micro-CT analyse toonde aan dat de dwarsdoorsnede gebieden van netvlies, RPE, en choroïde laag waren aanzienlijk lager in spaceflight monsters in vergelijking met de grond controles.
Micro-CT biedt een efficiënte en niet-destructieve technieken om de grootte van veranderingen te berekenen zonder enige manipulatie. Door contrastmiddel te gebruiken, verbetert het de kwaliteit van Micro-CT-beelden, wat ons helpt om een succesvol duidelijk beeld van de reconstructie te krijgen zonder de onderlinge structuur van het monster. Bovendien, het toont in de oorspronkelijke gegevens is digitaal, waardoor de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid van de bevindingen.
Bovendien is het een basisdoel om driedimensionale metingen te gebruiken, maar segmentatie van de bruto driedimensionale structuur kan nuttig zijn om specifieke contouren van het gehele specimen te geven. Onze resultaten geven aan dat de omstandigheden aan de ruimtevaart, met name gravitatieveranderingen, acute en korte-termijnrespons in het oog kunnen veroorzaken. Bovendien moeten toekomstige werkzaamheden volumetrische gegevens gebruiken om andere analyses uit te voeren die profiteren van de micro-CT-beeldvormingsmogelijkheden, omdat het met succes is gebruikt voor het bestuderen van veel normale en pathologische weefsels.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de impact van ruimtevaart op oculaire structuren met behulp van hoogwaardige micro-computertomografie (micro-CT) beeldvorming. Door een niet-destructieve techniek te gebruiken op ex vivo knaagdierderpjes, heeft het onderzoek tot doel morfologische veranderingen te beoordelen die het gevolg zijn van de unieke ruimtevaartomgeving.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Oculair gezondheid tijdens ruimtevaart
- Neuro-oculaire syndroom geassocieerd met ruimteomstandigheden
- Toepassing van micro-CT beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Ruimtevaart veroorzaakt fysiologische veranderingen, waaronder vloeistofverschuivingen en verhoogde intracraniale druk.
- Deze veranderingen kunnen leiden tot opticusdisc oedeem, verplatting van het oogbol en refractiefouten.
- De mechanismen die ten grondslag liggen aan neuro-oculaire syndroom geassocieerd met ruimtevaart (SANS) blijven onduidelijk.
Gebruikte methoden
- Micro-CT beeldvorming voor driedimensionale evaluatie van oculaire structuren.
- Knaagdierderpjes blootgesteld aan de ruimteomgeving voor analyse.
- Gebruik van contrastmiddelen om de kwaliteit van micro-CT beeldvorming te verbeteren.
Belangrijkste resultaten
- Aanzienlijke verminderingen in de doorsnedegebieden van retinale, RPE en choroïde lagen in ruimtevaartmonsters vergeleken met controles.
- Niet-destructieve beeldvorming maakt nauwkeurige beoordeling van oculaire morfologie mogelijk.
- De studie biedt inzicht in de acute reacties van ogen op ruimteomstandigheden.
Conclusies
- Het onderzoek toont aan dat ruimtevaartomstandigheden detecteerbare oculaire schade veroorzaken.
- De bevindingen zijn belangrijk voor het begrijpen van SANS en het verbeteren van de gezondheid van astronauten tijdens missies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This study demonstrates the utility of micro-CT imaging for detecting structural changes in ocular tissues following exposure to spaceflight conditions, offering a non-destructive method to assess tissue-level responses to environmental stressors. The approach supports mechanistic de-risking in preclinical models by enabling quantitative evaluation of retinal, RPE, and choroid layer thickness, which are relevant to neuro-ocular syndrome research. These findings enhance predictive confidence in using rodent models to study environmental stress effects on global ocular structure, with implications for translational biomarker development and preclinical risk assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to structural ocular changes induced by environmental stress.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, reproducible measurement of tissue layer thickness in preclinical models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing measurable endpoints for assessing ocular safety in early discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, high-resolution imaging outputs suitable for assay standardization in ocular toxicity screening.
- Operational Value: Ensures reproducibility through non-destructive imaging and contrast-enhanced visualization of soft tissue structures.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ocular tissue types and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant structural endpoints aligned with spaceflight-associated neuro-ocular syndrome (SANS) pathology.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent imaging protocols.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying microstructural changes in ocular tissues under stress conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly for studies assessing environmental or physiological stressors on ocular structure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise measurement of retinal, RPE, and choroid layer alterations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, quantitative imaging of ocular tissue cross-sections.
- Analytics: Generates linear and areal measurements that allow comparison between experimental and control conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing structural biomarkers relevant to SANS-like phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple ocular disease models and stressor paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ocular structural responses.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through non-destructive, contrast-enhanced micro-CT workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ocular liability, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, translatable ocular structural endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micro-CT operation, image reconstruction, and tissue preparation for contrast agent staining.
- Dependent on access to high-resolution micro-CT instrumentation capable of micron-scale imaging.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, dehydration, and staining protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method across different ocular models or species.
- Limited by the ex vivo nature of the technique, which precludes longitudinal in vivo tracking in the same subject.
