Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Afbraak van vetweefsel in subtypes is een uitdaging geweest omdat de fragiele aard van adipocyte. Dit protocol werd ontwikkeld om dit te overwinnen door effectieve isolatie van enkele kernen. Deze workflow biedt zeer gezuiverde enkele kernen met geminimaliseerde nucleaire aggregaten en cellulair puin.

Dit is voordelig voor single-cell transcriptome profilering van duizenden cellen. Dit eenvoudige en robuuste protocol kan worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyte in hun vetcellen te bestuderen. En in het bijzonder, op de ontwikkeling van fenotypering, vet knock-out en transgene muizen.

Visuele demonstratie van dit protocol is van cruciaal belang, zodat mensen die niet veel ervaring hebben in het hanteren van adipocyte kunnen repliceren en inzicht in vetheterogeniteit. Na het verzamelen van vetweefsel van muizen, dep het droog met een papieren handdoek, en plaats het in een schone schotel. Voeg calciumchloride toe aan de spijsverteringsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM.

Voeg vervolgens een klein volume toe aan het weefsel en maak er grondig gehakt van. Voeg ongeveer de helft van de hoeveelheid voorbereide spijsvertering buffer aan het gehakte weefsel. En gebruik een serologische pipet om het monster over te brengen naar een 50 mL centrifuge buis.

Was de schotel met de resterende buffer en voeg deze toe aan de 50 mL buis. Pipette het monster op en neer meerdere malen. Dan, incubeer het voor 12 tot 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl schudden bij 200 tot 210 rpm.

Voeg na de incubatie 0,5% BSA toe aan het monster bij een volumeverhouding van 1 tot 1 en meng goed door pipetting. Centrifuge het monster op 300 xg gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te draaien vaststelling van de stromovasculaire fractie waardoor de adipocyte fractie op de top. Filter de bovenste fractie door een 400 m celfilter in een buis van 50 mL.

Draai vervolgens het filter ondersteboven over de buis en breng de adipocyten over naar een nieuwe buis met 0,5% BSA om het filter om te draaien. Breng het totale volume van de BSA op 10 tot 15 mL en pipet het monster op en neer met serologische pipet. Dan, centrifuge het opnieuw op 300 xg gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.

Gebruik na centrifugatie een brede pipettip om de bovenste laag van het monster voorzichtig over te brengen naar een 100 m celfilter bovenop een nieuwe voorgekoelde buis op ijs. Spoel het filter af met een voldoende hoeveelheid kernenvoorbereidingsbuffer en gooi het vervolgens weg. Vanaf deze stap naar voren, houd een monster op ijs en werk snel.

Laat het monster tot twee minuten met tussenpozen de buis omkeren om te mengen. Dan, centrifuge op 1000 xg en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL van kernen voorbereiding buffer.

Breng het monster naar een schone microcentrifuge buis verzorgen om te voorkomen dat het aanraken van de wanden van de oude buis. Voeg 0,6 eenheden per L RNase-remmer toe en meng deze. Vervolgens centrifugeren het monster voor nog eens 10 minuten.

Verwijder de supernatant en resuspend een pellet en 1 mL van kernen wassen buffer. Dubbel filter het monster in een schone buis met stapelbare filters van 30 m. Was vervolgens de filters met ongeveer 300 L kernen wassen buffer.

Om een succesvolle isolatie van gezonde kernen te bevestigen, vlek een kleine aliquot van het monster met trypan en gebruik een geautomatiseerde cel teller om de gemiddelde dode grootte en procent van de dode cellen te beoordelen. Vlek in een kleine aliquot van het monster met DAPI en onderzoeken onder een microscoop met een 20X doelstelling of hoger. De kernen moeten rond zijn en een intact kernmembraan hebben.

Witte pijlen geven kernen aan zonder een intact membraan. Na het opruimen van de kernen met FACS, concentreer dit monster door vijf minuten op 500 xg te centrifugeren bij 4 graden Celsius. Reconstrueren vervolgens in een geschikte volume van de kernen wassen buffer.

Om een 50 tot 1500 kernen per L-concentratie te bereiken en verder te gaan met eencellige kernen RNA seq. Om cellulair puin en doubletten te verwijderen, worden adipocytenkernen gesorteerd op grootte en granulariteit om nucleaire aggregaten en veelvouden uit te sluiten. En tot slot voor DAPI positieve gebeurtenissen.

Deze sorteerstrategie resulteert in zeer gezuiverde single-nuclei's met minimale aggregaten en puin. Wanneer de gesorteerde kernen door microscopie worden geïnspecteerd, moeten ze rond zijn en een intact membraan hebben. Succesvolle zuivering van de kernen kan ook worden uitgevoerd met real-time qRT-PCR met behulp van primers voor ontluikende Ucp1 mRNA, een marker gen voor bruine adipocyten.

Het chroomplatform bepaalde een transcriptoom van 7500 kernen uit murine intercapulair bruin vetweefsel. Zeven verschillende celtypes werden onthuld met t-SNE dimensionaliteitsreductie en k-middelen clustering. Alle clusters uitgedrukt Fabp4, een pan adipocyte gen en een subset uitgedrukt een hoog niveau van Ucp1 mRNA.

Kernen geïsoleerd en vervolgens bevestigd hoewel dit protocol kan worden onderworpen aan vrijwel elke eencellige niveau genexpressie platform met inbegrip van Chromium van 10x Genomics.