Name: Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer de isolatie van vetweefselkernen voor eencellige transcriptoomanalyse. Dit protocol minimaliseert aggregaten en celresten voor hoogwaardige genexpressieprofielen in adipocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen David Reynolds van de Albert Einstein Genomics kern en Jinghang Zhang van de Flow Cytometry Core bedanken voor technische ondersteuning. We erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (DK110426) en Pilot and Feasibility Grants van het Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) en New York Obesity Research Center (DK026687) (allemaal naar K.S.). We willen ook Albert Einstein Cancer Center (CA013330) bedanken voor de kernondersteuning.

Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Albert Einstein College of Medicine.
1. Voorbereiding van weefselvertering en lysebuffers
<ol><li>Bereid weefselvertering buffer.<ol>
<li>Bereid ~ 1 mL digestiebuffer voor elke gram vetweefsel voor.</li>
		<li>Weeg 1,5 U/mL collagenase D en 2,4 U/mL dispase II af en voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de preparaatbuffer voor (NPB).<ol>
<li>Bereid 10 mM HEPES, 1,5 m magnesiumchloride, 10 mM kaliumchloride, 250 mM sacharose en 0,1% NP-40 in nuclease-vrij water. Meng goed. Sucrose kan meer tijd in beslag nemen om op te lossen dan de andere componenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid 0,5% runderserum albumine (BSA) oplossing voor.<ol>
<li>Bereid 0,5% BSA voor in PBS met EDTA. Het wordt aanbevolen om steriel gefilterde celkweekkwaliteit PBS te gebruiken (zie tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Enzymatische vertering van vetweefsel
<ol><li>Dissecten muizen om vetweefsel te extraheren volgens Aune et al.13. Verzamel geïsoleerd weefsel in een schaal met PBS. Breng het weefsel naar een papieren handdoek om droog te deppen. Plaats het weefsel vervolgens in een schone schaal.</li>
	<li>Voeg calciumchloride toe aan de spijsverteringsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM. Voeg een klein volume van de spijsvertering buffer aan de schotel en grondig gehakt het vetweefsel. Het vereiste volume van de spijsverteringsbuffer zal gebaseerd zijn op de hoeveelheid geïsoleerd weefsel. Meestal ~ 1 mL of minder wordt gebruikt.</li>
	<li>Voeg ongeveer de helft van de hoeveelheid voorbereide spijsverteringsbuffer (bijvoorbeeld ~ 10 mL voor vijf muizen) toe aan het gehakte weefsel. Breng het monster met behulp van een serologische pipet over op een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL. Voeg de resterende hoeveelheid buffer toe om de schotel te wassen en breng over op de buis van 50 mL met het monster. Pipet meerdere keren op en neer. Dan incubeer met schudden bij 200-210 rpm bij 37 °C gedurende 12-15 min.</li>
</ol>3. Adipocyte isolatie
<ol><li>Voeg na incubatie 0,5% BSA toe met een verhouding van 1:1 aan het monster. Meng goed door pipetting op en neer meerdere malen. Centrifugeren het monster op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de stromale vasculaire fractie (SVF) te laten draaien. De adipocytenfractie blijft in de bovenste laag van het monster.</li>
	<li>Plaats een 40 μm celfilter bovenop een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL en filter het monster, verzamel de bovenste laag en laat de SVF achter aan de onderkant van de buis. Breng de bovenste laag (adipocytefractie) naar een nieuwe buis door het filter ondersteboven over de buis te draaien en 0,5% BSA te gebruiken om het filter om te keren en het monster in de buis te verzamelen.</li>
	<li>Breng het totale volume van 0,5% BSA op 10-15 mL op basis van de steekproefgrootte en pipet op en neer met een serologische pipet of schud kort op en neer om het monster te mengen. Centrifuge het monster opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten op RT.</li>
</ol>4. Kernisolatie
<ol><li>Gebruik een brede pipettip en breng de toplaag van het monster voorzichtig over naar een 100 μm celfilter dat bovenop een nieuwe voorgebogen buis op ijs is geplaatst, waardoor eventuele resterende SVF achterblijft.</li>
	<li>Spoel/was het filter met voldoende NPB en gooi het filter weg. Vanaf deze stap naar voren hebben het monster op ijs zo vaak mogelijk en werk snel om lekkende en / of ongezonde kernen te voorkomen. Het is nuttig om prechill microcentrifuge buizen worden gebruikt in toekomstige stappen op ijs.</li>
	<li>Plaats het monster niet meer dan 2 min op ijs met intermitterende zachte omkering van de buis om te mengen. De incubatietijd op ijs moet worden geoptimaliseerd voor de grootte van de monsters en het type adipocyten. Centrifuge bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL npb. Breng het monster over naar een schone microcentrifugebuis. Tijdens het overbrengen, vermijd het aanraken van de muren van de buis, die puin en lipide bevatten. Voeg 0,6 U/μL RNase-remmer toe aan het monster en meng. Centrifuge opnieuw bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten. OPMERKING: De snelheid en tijd van centrifugatie moeten bij deze stap worden verlaagd voor kleinere monsters.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en resuspend in 1 mL nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibitor).</li>
	<li>Dubbel filter in een schone buis met stapelbare 30 μm filters. Wasfilter met een klein volume (~300 μL) van Nuclei Wash Buffer. U ook voor kleinere monsters een filter van 30 μm gebruiken dat in een microcentrifugebuis past en er rechtstreeks in filteren.</li>
	<li>Bevestig een succesvolle isolatie van gezonde kernen.<ol>
<li>Vlek een kleine aliquot van het monster met trypan en gebruik een geautomatiseerde cel teller om de gemiddelde dode grootte en procent dode cellen te beoordelen. De gemiddelde dode grootte voor een monster dat meestal kernen bevat, moet variëren tussen 7-10 μm. De grootte van de kernen is meestal ongeveer 8 μm.</li>
		<li>Vlek een kleine aliquot van het monster met DAPI en onderzoeken onder een microscoop met een 20x doelstelling of hoger. Het nucleaire membraan moet intact zijn en de kernen moeten rond zijn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACS cleanup en kernen concentratie stap
<ol><li>Ga onmiddellijk naar de FACS-stap om kernen op te ruimen en overtollig vuil te verwijderen. De opvangbuffer moet Nuclei Wash Buffer bevatten. Tijdens FACS wordt de buffer verdund. Het voorbereiden van een hogere concentratie BSA en RNase remmer om rekening te houden met verdunning tijdens het sorteren is nuttig. Het FACS-opvangblok moet in de koelmodus staan.</li>
	<li>Na het sorteren van de kernen, centrifuge op 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C om het monster te concentreren. Reconstitueereren in een passend volume van Nuclei Wash Buffer om een concentratie van 500-1.500 kernen/μL te bereiken. Probeer niet om alle supernatant te verwijderen. Hierdoor zullen kernen verloren gaan.</li>
	<li>Gebruik een hemocytometer en een DAPI bevlekte aliquot voor een laatste telling en visualiseer de kernen. Ga dan onmiddellijk verder met snRNA-seq volgens het protocol van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een eenvoudige en robuuste methode om enkele kernen te isoleren en vetweefsel heterogeniteit te bestuderen wordt gepresenteerd. Vergeleken met whole tissue RNA sequencing biedt deze workflow een onbevooroordeeld beeld van cellulaire heterogeniteit en populatiespecifieke markers. Dit is significant en innovatief voor de vooruitgang van adipocyte biologie, moleculair metabolisme, en zwaarlijvigheidsonderzoek.
Dit protocol is speciaal geoptimaliseerd voor downstream toepassing van snRNA-seq. De "...

Studies hebben aangetoond dat bruin vetweefsel (BBT) een opmerkelijke capaciteit heeft om energie te verdrijven. Er bestaan twee soorten thermogene adipocyten met verschillende ontwikkelingskenmerken bij zowel knaagdieren als mensen: beige adipocyten en klassieke bruine adipocyten. Terwijl klassieke bruine adipocyten zich meestal in intercapulaire BAT-depots bevinden, komen beige adipocyten sporadisch naar voren in wit vetweefsel (WAT) in reactie op bepaalde fysiologische signalen, zoals chronische koude blootstelling, een proces dat wordt aangeduid als "bruinen" of "beiging". Door het gebruik van geavanceerde beeldvorming is het nu duidelijk dat volwassen mensen aanzienlijke depots van UCP1+ BAT hebben, vooral in supraclaviculaire regio1,2,3,4. De hoeveelheid volwassen menselijke BAT omgekeerd correleert met adipositeit en kan worden verhoogd door externe signalen, zoals chronische blootstelling aan koude5,,6 of β3-adrenerge receptor agonist7. Door baten gemedieerde energie-uitgaven kunnen een levensvatbare aanpak bieden om obesitas te bestrijden.
Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Studies hebben echter het bestaan van meerdere subtypen of subpopulaties aan het licht gebracht die verschillen in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptome8,9,10. Bijvoorbeeld, een soort beige adipocyte die bij voorkeur glucose gebruikt voor thermogenese, de g-beige adipocyte, werd onlangs beschreven10. Het onvolledige begrip van celtypen in bruin en beige vetweefsel en het ontbreken van specifieke markers vormen een kritieke barrière voor het bestuderen van hun biologische functies.
Traditionele methoden voor het isoleren van subpopulaties van cellen zijn gebaseerd op expressie van slechts een paar bekende markergenen. Recente vooruitgang in eencellige genomics maakt het gebruik van wereldwijde genexpressiegegevens van enkele cellen mogelijk om een onbevooroordeelde schatting te geven van het aantal subpopulaties in een weefsel. Het uiteindelijke doel van dit protocol is om alle vetweefsel subtypes te bepalen onder verschillende thermogene stimuli op een eencellige resolutie. In tegenstelling tot andere weefsels en celtypen is het bepalen van cellulaire subtypes van vetweefsel een uitdaging vanwege de kwetsbaarheid van met lipide gevulde adipocyten. Dit papier introduceert een robuust protocol om enkele kernen te isoleren van vetweefsel voor downstream-toepassing op snRNA-sequencing. Belangrijk is dat recente literatuur die goed overeenkomende single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) datasets te vergelijken bleek dat snRNA-seq is vergelijkbaar met scRNA-seq in celtype detectie, en superieur in cellulaire dekking voor een complex weefsel als de hersenen11. Dit protocol combineert een dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode geoptimaliseerd voor vetweefsel door Rosen et al.12 met een kern "cleanup" stap met een MoFlo XDP High Speed Sorter. Zoals te zien in de representatieve resultaten, een analyse van 7.500 enkele kernen van de muis interscapulaire bruin vetweefsel geïdentificeerd meerdere celtypes binnen schijnbaar homogene bruine adipocyten. Over het algemeen kan dit eenvoudige en robuuste protocol worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyten en vet-ingezeten cellen, identificatie van subtype-specifieke marker genen, en ontwikkeling fenotypering van vet-selectieve knock-out / transgene muizen te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS met EDTA; sterieel gefilterd</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Cellfilter 100 &mu;m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Cellfilter 40&mu;m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu;m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Geautomatiseerde Celteller</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 &micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Stapelbare filters</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Celsorteerder</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase Inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Bruin en beige vet zijn gespecialiseerde vetweefsels die energie voor thermogenese afvoeren door UCP1 (Uncoupling Protein-1)-afhankelijke en onafhankelijke trajecten. Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Recente studies hebben echter aangetoond dat er meerdere subtypen of subpopulaties zijn die verschillend zijn in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptoom. Ondanks de vooruitgang in eencellige genomics, onbevooroordeelde afbraak van vetweefsel in cellulaire subtypes is uitdagend vanwege de fragiele aard van lipide gevulde adipocyten. Het gepresenteerde protocol werd ontwikkeld om deze obstakels te omzeilen door effectieve isolatie van enkele kernen van vetweefsel voor downstreamtoepassingen, waaronder RNA-sequencing. Cellulaire heterogeniteit kan vervolgens worden geanalyseerd door RNA-sequencing en bio-informatica-analyses.

Ongesorteerde adipocytekernen bevatten puin en doubletten die ruis en een hoge achtergrond creëren in downstream eencellige RNA-sequencing. De representatieve FACS-poortstrategie is te zien in figuur 1. De kernen werden eerst geselecteerd op basis van forward scatter (FSC) en side scatter (SSC)(A),waarna alleen singlets werden geselecteerd op basis van de combinatie van breedte en hoogten van SSC(B). Ten slotte werden alleen ...

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Afbraak van vetweefsel in subtypes is een uitdaging geweest omdat de fragiele aard van adipocyte. Dit protocol werd ontwikkeld om dit te overwinnen door effectieve isolatie van enkele kernen. Deze workflow biedt zeer gezuiverde enkele kernen met geminimaliseerde nucleaire aggregaten en cellulair puin.Dit is voordelig voor single-cell transcriptome profilering van duizenden cellen. Dit eenvoudige en robuuste protocol kan worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyte in hun vetcellen te bestuderen. En in het bijzonder, op de ontwikkeling van fenotypering, vet knock-out en transgene muizen.Visuele demonstratie van dit protocol is van cruciaal belang, zodat mensen die niet veel ervaring hebben in het hanteren van adipocyte kunnen repliceren en inzicht in vetheterogeniteit. Na het verzamelen van vetweefsel van muizen, dep het droog met een papieren handdoek, en plaats het in een schone schotel. Voeg calciumchloride toe aan de spijsverteringsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM.Voeg vervolgens een klein volume toe aan het weefsel en maak er grondig gehakt van. Voeg ongeveer de helft van de hoeveelheid voorbereide spijsvertering buffer aan het gehakte weefsel. En gebruik een serologische pipet om het monster over te brengen naar een 50 mL centrifuge buis.Was de schotel met de resterende buffer en voeg deze toe aan de 50 mL buis. Pipette het monster op en neer meerdere malen. Dan, incubeer het voor 12 tot 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl schudden bij 200 tot 210 rpm.Voeg na de incubatie 0,5% BSA toe aan het monster bij een volumeverhouding van 1 tot 1 en meng goed door pipetting. Centrifuge het monster op 300 xg gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te draaien vaststelling van de stromovasculaire fractie waardoor de adipocyte fractie op de top. Filter de bovenste fractie door een 400 m celfilter in een buis van 50 mL.Draai vervolgens het filter ondersteboven over de buis en breng de adipocyten over naar een nieuwe buis met 0,5% BSA om het filter om te draaien. Breng het totale volume van de BSA op 10 tot 15 mL en pipet het monster op en neer met serologische pipet. Dan, centrifuge het opnieuw op 300 xg gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Gebruik na centrifugatie een brede pipettip om de bovenste laag van het monster voorzichtig over te brengen naar een 100 m celfilter bovenop een nieuwe voorgekoelde buis op ijs. Spoel het filter af met een voldoende hoeveelheid kernenvoorbereidingsbuffer en gooi het vervolgens weg. Vanaf deze stap naar voren, houd een monster op ijs en werk snel.Laat het monster tot twee minuten met tussenpozen de buis omkeren om te mengen. Dan, centrifuge op 1000 xg en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL van kernen voorbereiding buffer.Breng het monster naar een schone microcentrifuge buis verzorgen om te voorkomen dat het aanraken van de wanden van de oude buis. Voeg 0,6 eenheden per L RNase-remmer toe en meng deze. Vervolgens centrifugeren het monster voor nog eens 10 minuten.Verwijder de supernatant en resuspend een pellet en 1 mL van kernen wassen buffer. Dubbel filter het monster in een schone buis met stapelbare filters van 30 m. Was vervolgens de filters met ongeveer 300 L kernen wassen buffer.Om een succesvolle isolatie van gezonde kernen te bevestigen, vlek een kleine aliquot van het monster met trypan en gebruik een geautomatiseerde cel teller om de gemiddelde dode grootte en procent van de dode cellen te beoordelen. Vlek in een kleine aliquot van het monster met DAPI en onderzoeken onder een microscoop met een 20X doelstelling of hoger. De kernen moeten rond zijn en een intact kernmembraan hebben.Witte pijlen geven kernen aan zonder een intact membraan. Na het opruimen van de kernen met FACS, concentreer dit monster door vijf minuten op 500 xg te centrifugeren bij 4 graden Celsius. Reconstrueren vervolgens in een geschikte volume van de kernen wassen buffer.Om een 50 tot 1500 kernen per L-concentratie te bereiken en verder te gaan met eencellige kernen RNA seq. Om cellulair puin en doubletten te verwijderen, worden adipocytenkernen gesorteerd op grootte en granulariteit om nucleaire aggregaten en veelvouden uit te sluiten. En tot slot voor DAPI positieve gebeurtenissen.Deze sorteerstrategie resulteert in zeer gezuiverde single-nuclei's met minimale aggregaten en puin. Wanneer de gesorteerde kernen door microscopie worden geïnspecteerd, moeten ze rond zijn en een intact membraan hebben. Succesvolle zuivering van de kernen kan ook worden uitgevoerd met real-time qRT-PCR met behulp van primers voor ontluikende Ucp1 mRNA, een marker gen voor bruine adipocyten.Het chroomplatform bepaalde een transcriptoom van 7500 kernen uit murine intercapulair bruin vetweefsel. Zeven verschillende celtypes werden onthuld met t-SNE dimensionaliteitsreductie en k-middelen clustering. Alle clusters uitgedrukt Fabp4, een pan adipocyte gen en een subset uitgedrukt een hoog niveau van Ucp1 mRNA.Kernen geïsoleerd en vervolgens bevestigd hoewel dit protocol kan worden onderworpen aan vrijwel elke eencellige niveau genexpressie platform met inbegrip van Chromium van 10x Genomics.

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Als gevolg van de drastische en negatieve verband tussen obesitas en andere comorbiditeiten, onderzoek naar de rol vetweefsel speelt bij de ziekte en de algehele gezondheid gerechtvaardigd is. We presenteren een protocol voor isolatie en excisie van vet depots waardoor de studie van adipose gebruik in situ en in vitro methoden.

Lokalisatie, identificatie, en Excisie van Muriene Adipose Depots

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van kernen uit flash-bevroren, gearchiveerde leverweefsels voor single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq en gezamenlijke multiomics (RNA-seq en ATAC-seq).

Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.

Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

De biologie van intermusculair vetweefsel (IMAT) is grotendeels onontgonnen vanwege de beperkte toegankelijkheid van menselijk weefsel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor kernisolatie en bibliotheekvoorbereiding van bevroren menselijke IMAT voor sequencing van enkelvoudige kernen RNA om de cellulaire samenstelling van dit unieke vetdepot te identificeren.

Isolatie van kernen uit menselijk intermusculair vetweefsel en stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern

Leer de isolatie van vetweefselkernen voor eencellige transcriptoomanalyse. Dit protocol minimaliseert aggregaten en celresten voor hoogwaardige genexpressieprofielen in adipocyten.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Meer video's verkennen