Name: Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Leer een gestroomlijnde methode voor vruchtbaarheidstests van individuele Aedes aegypti met 24-well kweekplaten. Dit protocol vermindert tijd, ruimte en arbeid voor ei- en larvetelling in vectorbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program voor financiering. We danken ook de Adelman-lableden voor hulp bij het ontwikkelen van deze methode en suggesties bij het opstellen van het manuscript, evenals Kevin Myles-lableden. We danken ook de recensenten en redacteuren voor hun hulp om dit manuscript beter te maken.

1. Plaatvoorbereiding
<ol><li>Boor gaten in 24 putweefselkweekplaatdeksels (4−6 gaten per put) met behulp van een huishoudboor met een boor van ~ 1,6 mm (1/16 inch) (figuur 2). OPMERKING: Deze gaten voorkomen dat watercondensatie zich ophoopt op het deksel, waar muggen eieren kunnen leggen. De standaardgrootte van vrouwelijke Ae. aegypti ("Liverpool" stam) is ~3.11 mm spanwijdte. Het verminderen van de grootte van de gaten wordt aanbevolen bij het gebruik van kleinere muggen om te voorkomen dat ze uit de plaat ontsnappen.</li>
	<li>Was en spoel de platen op de dag voorafgaand aan het ovipositie-experiment grondig af en week ze gedurende 30−60 min bij kamertemperatuur in 1−5% bleekmiddel. Spoel grondig af onder stromend gedeioneerd water en droog ze. OPMERKING: Dit proces vermindert de kans dat schimmels en bacteriën op agarose groeien.</li>
	<li>Smelt agarose bij 2% in gedeioneerd water en voeg onmiddellijk 500 μL gesmolten agarose toe aan elke put van de 24 putplaten met behulp van een pipet van 1.000 μL (figuur 3A,B). Wanneer de agarose begint af te koelen en de pipettip verstopt, verwarmt u de agarose opnieuw en gebruikt u een nieuwe pipettip. OPMERKING: Raak de wanden van de put niet aan met de pipetpunt, omdat dit een stuk agarose op de muur kan achterlaten waar een vrouwtje eieren kan leggen, wat het beeldvormings- en telproces bemoeilijkt.</li>
	<li>Droog voor gebruik condensatie op de wanden van de put 's nachts uit op een laboratoriumbank (figuur 3C,D). OPMERKING: De tijdlijn van de EAgaL-plaattest van bloedtoevoer naar larvale beeldvorming is weergegeven in figuur 4, die is voor koloniemuggen (Ae. aegypti "Liverpool" gekweekt onder 14 uur licht: 10 uur donkere lichtcyclus, 27 °C, 80% relatieve vochtigheid, 500 larven in een 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm bak met 2 L. Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium de EAgaL-plaat test met de muggen die worden gebruikt, vooral bij het gebruik van verschillende stammen, verschillende muggensoorten en verschillende opfokprotocollen.</li>
</ol>2. Muggenvoer
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om muggen te gebruiken die onder uniforme omstandigheden worden gekweekt voor alle behandelingsgroepen en controlegroepen, omdat larvale voeding een impact heeft op de fitnessparameters van muggen10,11. Achterlarven onder rustige omstandigheden met voldoende voedsel. Laat vrouwelijke muggen in de aanwezigheid van mannetjes sluiten, zodat de paring is verzekerd en rijp gedurende ten minste 3 dagen.
<ol><li>Verwijder elke bron van water en/of suiker van de vrouwelijke muggen ten minste 16 uur voorafgaand aan de bloedtoevoer om de bloedtoevoer te verbeteren.</li>
	<li>Verwarm een watercirculatiepomp voor kunstmatige voeding bij 37 °C en voer vrouwelijke muggen met gewerveld bloed dat gedurende 15-30 minuten in kunstmatige feeders is geplaatst (figuur 5A).</li>
	<li>Verdoof muggen met CO2 of op ijs, breng ze over in een glazen schaal op ijs en selecteer degenen die met bloed zijn omhult (figuur 5B) in een container met 30% sacharosewater gedurende meer dan 72 uur, wanneer vrouwtjes klaar zijn met uitscheiding en eiontwikkeling. OPMERKING: Als de vrouwtjes een lagere concentratie sacharosewater hebben, verwijder dan het sacharosewater en eventuele natte oppervlakken na 48 uur om te voorkomen dat de vrouwtjes legboor worden.</li>
</ol>3. Ovipositie
<ol><li>Voeg ongeveer 1 uur voordat u muggen naar de platen overbrengt 2−3 druppels (~ 80−120 μL) water toe aan elke plaatput met behulp van een transferpipet.</li>
	<li>Ten minste 72 uur na het bloed voeden, muggen met CO2 of op ijs neerhalen, overbrengen naar een glazen schaal op ijs en elke mug afzonderlijk op een omgekeerd deksel van de 24 putplaat op ijs plaatsen (figuur 6A). OPMERKING: Deze procedure is toegepast vanuit Ioshino et al.9.</li>
	<li>Zodra alle 24 muggen zijn geplaatst, bedekt u het deksel met een omgekeerde plaatbodem(afbeelding 6B),bevestigt u het deksel en de plaat met een frisse, nieuwe rubberen band en plaatst u deze in een milieukamer (of opfokkamer) (figuur 6C) totdat muggen zich herstellen (~ 10−15 min) en draait u de plaat naar rechts (Afbeelding 6D).</li>
	<li>Laat de vrouwelijke muggen 24−48 uur legponeren en verwijder vrouwtjes door ze in een grote kooi van de platen los te laten. OPMERKING: Als het belangrijk is om individuele vrouwtjes in de gaten te houden, verdoof ze dan door de platen te koelen en ze afzonderlijk op ijs te verwijderen. Vertraagde ovipositie en donkere uitscheidingen die het tellen van eieren verstoren, werden waargenomen wanneer vrouwtjes eerder dan 72 uur na de bloedmaaltijd (PBM) naar de platen werden overgebracht (figuur 7D).</li>
</ol>4. Eieren tellen
<ol><li>Controleer elke put van de 24 putplaat, omdat muggen soms eieren leggen op de muur van putten en aan de rand van het agarose / plastic oppervlak, waar ze moeilijk op te lossen zijn in foto's. Verplaats met een natte kwast de eieren die op de muur en rand van agarose zijn gelegd naar het vlakke oppervlak van de agarose, zodat alle eieren zich in een uniform vlak bevinden en niet met elkaar overlappen. OPMERKING: De rand van de agarose bevindt zich meestal buiten het brandpuntsvlak van de camera vanwege de oppervlaktespanning van de agarose-oplossing.</li>
	<li>Verwijder met een tang gebroken benen, vleugels en andere deeltjes in de putten die de beeldvorming van eieren kunnen verstoren (figuur 7C).</li>
	<li>Plaats wit papier onder de plaat om het contrast met donkere muggeneieren te verhogen voordat u een stereomicroscoopverlichting gebruikt (figuur 7A).</li>
	<li>Maak een foto van elke put met behulp van een compacte digitale camera in microscoopmodus, waarmee de gebruiker zich kan concentreren op objecten vanaf 1 cm. Met deze mogelijkheid kan de camera direct op de plaat worden geplaatst om eieren zonder statief of standaard in beeld te brengen (figuur 7A). Om individuele eieren te onderscheiden die in klonten zijn gelegd, gebruikt u de fijne of superfijne modus om afbeeldingen met hoge resolutie vast te leggen, zodat close-updetails kunnen worden gezien. OPMERKING: Wis de geheugenkaart van de camera voor gebruik om verwarring tussen nieuwe en oude beelden te voorkomen.</li>
	<li>Nadat u elke put van een plaat hebt gefotografeerd, maakt u een afbeelding van de hele plaat met een afbeeldingsvolgordelabel om elke plaat later te onderscheiden(figuur 7E).</li>
	<li>Voeg een dunne laag ~ 5 druppels water (~ 200 μL) met een transferpipet toe aan elke put om te voorkomen dat de agaroseplug en de eieren drogen en om embryoontwikkeling en uitkomen te induceren. Let de eerste uren op de waterstanden en controleer elke dag, omdat er waterverlies kan zijn als gevolg van absorptie door de agarose of verdamping. Voeg water toe wanneer het niveau te laag is voor larven om uit te komen. OPMERKING: Verdamping van water vindt niet-uniform plaats, zowel binnen een plaat als binnen een stapel platen. Er is waargenomen dat drogen in de volgende volgorde plaatsvindt: 1) hoekputten (A1, A6, D1, D6) drogen het snelst; gevolgd door 2) putten aan de buitenrand van de plaat (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); en laatste 3) putten binnen. Wanneer platen worden gestapeld, droogt de bovenste plaat het snelst.</li>
	<li>Breng de afbeeldingen over naar een computer met ImageJ (Fiji) en hernoem de bestanden voor een eenvoudigere organisatie, zoals "[plate ID]_[well ID].jpg" (Figuur 8A,B).</li>
	<li>Maak een spreadsheetbestand om einummers (d.w.z. vruchtbaarheid) en larvale getallen vast te leggen en de broedsnelheid (d.w.z. vruchtbaarheid) te berekenen (figuur 9E).</li>
	<li>Open de afbeeldingen met Afbeelding J (Fiji)12 en gebruik het "meerpunts" gereedschap om elk ei te markeren (figuur 9A−C); zoom in of uit met de toets "+" of "–" om de eieren in klonten te tellen. Nadat u alle eieren hebt gemarkeerd, dubbelklikt u op het meerpuntspictogram om het aantal markeringen te weergeven (figuur 9D). Noteer de resultaten in een spreadsheet.</li>
</ol>5. Vruchtbaarheidsbeoordeling
OPMERKING: Binnen 2 dagen kunnen de eerste instar-larven in de putten beginnen te sluiten. Wacht nog 3-5 dagen voordat u gaat beeldvorming/telling om ervoor te zorgen dat alle levensvatbare eieren uitkomen.
<ol><li>Bereid larvaal voedsel door 1/16 eetlepel (~168 mg) gemalen visvoer (d.w.z. normaal muggenlarvendieet) te mengen in 20 ml water en te wachten tot grote vaste deeltjes zich vestigen (Figuur 10A−D). Begin met het toevoegen van voedsel (het supernatant) aan de putten die uitgebroede larven bevatten zodra ze verschijnen, omdat ze niet lang overleven zonder voedsel. OPMERKING: Overmatige toevoeging van voedseldeeltjes kan de beeldvorming en het tellen van uitgebroede larven verstoren.</li>
	<li>Ongeveer 5-8 dagen na toevoeging van water aan de putten, koel de plaat af door 15-20 minuten te bedekken met gemalen ijs om larven te verdoven.</li>
	<li>Maak foto's van elke put terwijl je de platen op ijs houdt zoals bij de eieren. Voor larvale afbeeldingen, zorg voor een donkere achtergrond door een zwart materiaal onder de plaat te plaatsen om het contrast te verbeteren. Nadat je elke put van een plaat hebt gefotografeerd, maak je een afbeelding van de hele plaat met een beeldvormingsorderlabel om elke plaat later te onderscheiden. OPMERKING: Er worden foto's gemaakt terwijl de platen op ijs liggen, omdat de beweging van de larven het tellen in gevaar kan brengen. De platen zijn herbruikbaar; vries en verwijder de muggen en agarose om schoon te maken voor het volgende gebruik. De EAgaL-plaat is niet geschikt voor het fokken van larven tot gevorderde stadia.</li>
	<li>Open afbeeldingen met ImageJ (Fiji) en gebruik het "multi-point" tool om te tellen door op elke larve te klikken. Gedurende de periode van 3-5 dagen kunnen sommige larven zijn vermolsten, vooral in putten met een laag aantal larven. Sluit daarom bij het tellen de afgeworpen nagelriemen (d.w.z. exuviae) uit, die eruit zien als larven met alleen kop met een beetje lichaam of gekrompen larven (figuur 10E). Noteer de resultaten in de spreadsheet.</li>
</ol>6. Voer een analyse uit
<ol><li>Nadat u alle benodigde gegevens voor de vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidsanalyse hebt verzameld, voert u een passende statistische analyse uit en maakt u grafieken met behulp van voorkeurssoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li>
<li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+%28Cinnamosma+sp.%29+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373(2019).</li>
<li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+transgenesis%3A+what+is+the+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li>
<li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217(2019).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement%2C+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP%2FZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviplate%3A+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103(2018).</li>
<li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mosquitoes%2C+large+implications%3A+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites & Vectors. 8, 252(2015).</li>
<li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+vector+arthropod+culture%3A+an+example+using+the+African+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten voor deze studie.

De EAgaL-plaat vermindert de arbeid, tijd en ruimte drastisch om individuele vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten in Aedes aegypti uit te voeren in vergelijking met de FT-methode. Voorlopige vergelijking tussen de FT-methode en de EAgaL-plaat resulteerde in kortere tijden voor alle stappen (beeldvormingstechniek werd toegepast op de FT-methode) (Tabel 1). Ter referentie: tabel 2 bevat een raming van de opstart- en testkosten (één EAgaL-plaat van 24 well versus 24 FT's).</st...

De bestrijding van muggen om mensen te beschermen tegen door vectoren overgedragen ziekteverwekkers is een belangrijk doel voor de volksgezondheid, voornamelijk vanwege het gebrek aan effectieve vaccins voor de meeste pathogenen die door muggen worden gedragen. Veel studies zijn gericht op het verminderen van de conditie van muggen in combinatie met een in het veld toepasbare strategie voor populatievermindering1,2,3. Dit omvat uitgebreide studies om transgene muggen en / of CRISPR / Cas9 knock-out lijnen te maken. Dergelijke benaderingen voor bevolkingsaanpassing vereisen een gedetailleerde beoordeling van individuele geschiktheidsparameters4. Conventionele laboratoriumtechnieken om de geschiktheid van vrouwelijke muggen te beoordelen, omvatten de individuele insluiting van gepaarde, met bloed gevoede vrouwelijke muggen in containers van 100 ml5, gemodificeerde conische buizen van 50 ml of buizen voor drosophila-opfok, gewijzigd door vochtige oppervlakken te bieden met vochtig katoen en filterpapierschijven voor ovipositie (d.w.z. eierpapier)1,2,6,7. Dergelijke methoden vereisen een relatief grote ruimte (bijv. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H voor maximaal 100 Drosophila-buizen) (figuur 1), en de manipulatie van individuele eierpapieren voor het tellen van eieren en broedlarven, die arbeidsintensief kunnen zijn. Dit manuscript presenteert een methode om muggeneieren te tellen en broedsnelheden te bepalen met behulp van 24 putplaten en agarose als een ovipositieoppervlak om deze problemen te omzeilen8.
Tegelijkertijd beschreven Ioshino et al.9 een gedetailleerde methode waarbij 12 en 24 putplaten werden gebruikt om eiertellingen uit te voeren die van individuele vrouwtjes werden verkregen. Hun protocol vertegenwoordigde een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele methoden om tijd en ruimte te besparen9. Het protocol dat ze beschreven blijft echter nat filterpapier gebruiken als een oppervlak voor ovipositie, waarvoor elk afzonderlijk papier moet worden uitgevouwen om tellingen te krijgen, omdat eieren vaak onder of in plooien worden gevonden. Hun protocol omvatte ook niet het gebruik van beeldvormingstechnologieën of een methode voor het tellen van larven.
Gepresenteerd is een verbeterde methode om fitnesstesten uit te voeren voor einummer (d.w.z. vruchtbaarheid) en broedsnelheid (d.w.z. vruchtbaarheid) met behulp van agarose als ovipositieoppervlak in een 24-put weefselkweekplaatformaat voor Ae. aegypti dat legboor op vochtige oppervlakken. Deze platen werden "EAgaL" platen genoemd, van Egg, Agarose en Larva. Deze 24 putplaten bieden individuele muggen een minimaal oppervlak om eieren te leggen, waardoor de tijd en moeite die nodig is om eieren en uitgebroede larven een paar dagen te tellen en te onderhouden, wordt vereenvoudigd en drastisch wordt verminderd. De EAgaL-plaat maakt gebruik van doorschijnende agarose voor het ovipositieoppervlak, waardoor het niet meer nodig is om met eierpapier om te gaan en de eieren en larven te vinden wanneer ze uitkomen; het fotograferen van elke put zorgt voor een langetermijn gearchiveerde registratie van de resultaten en scheidt het telproces in zowel tijd als ruimte van het opfok- / hanteringsproces, waar de tijd vaak beperkt is.

<table><tbody><tr><td>1.6 mm &Phi; boortje</td><td></td><td></td><td>alternatief kunnen verwarmde spijkers worden gebruikt</td></tr><tr><td>1000 &mu;L pipettentips (lang)</td><td>Olympus plastics</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>24-wells weefselkweekplaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>930186</td><td>heldere, platte bodem met ringdeksel platen</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Compact digitale camera</td><td>Olympus</td><td>TG-5/TG-6</td><td></td></tr><tr><td>Computer (Windows, Mac of Linux)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>De-ioniseringswater</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (imageJ) software</td><td></td><td></td><td>downloaden van: https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td></td><td>scherpe pincet kan het lichaam van de mug breken</td></tr><tr><td>Petrischalen van glas</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huishoudelijke bleekmiddel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huishoudelijke elektrische boor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminator voor stereomicroscoop (zwanenhals)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schilderkwasten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gummibandjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-kaart</td><td></td><td></td><td>om digitale camerabeelden op te nemen (DSHC, SDXC zou beter moeten zijn)</td></tr><tr><td>Spreadsheetsoftware (Microsoft Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Elke spreadsheetsoftware werkt</td></tr><tr><td>TetraMin visvoer</td><td>Tetra</td><td></td><td>gemalen met koffiemolen, blender of mortel & stamper</td></tr><tr><td>Transfer pipetten</td><td>VWR</td><td>16011-188</td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (eagal-platen)

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Muggen vertegenwoordigen een aanzienlijk probleem voor de volksgezondheid als vectoren van verschillende ziekteverwekkers. Voor die studies die een beoordeling van de geschiktheidsparameters van muggen vereisen, met name de productie van eieren en de broedsnelheden op individueel niveau, hebben conventionele methoden onderzoekers aanzienlijk belast vanwege de hoge arbeidsintensiteit en laboratoriumruimtevereisten. Beschreven is een eenvoudige methode met behulp van 24 put weefsel cultuur plaat met agarose in elke put en digitale beeldvorming van elke put om ei nummers en hatch rates te bepalen op een individueel niveau met aanzienlijk verminderde tijd en ruimte eisen.

Muggen werden geïnjecteerd met dsRNA gericht op een kandidaat-ijzertransporter (FeT) of controlegen (EGFP), bloed gevoed en gemeten voor vruchtbaarheid en vruchtbaarheidsoutput met behulp van de EAgaL-plaatmethode, volgens de hierboven beschreven procedure.
Muggen waarbij fet-expressie werd gedempt na dsRNA-injectie vertoonden een significante vermindering van zowel het einummer als de broedsnelheid (figuur 11A−C). Alle bestrijdings- en behandelin...

Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Deze procedure stelt muggenonderzoekers in staat om de reproductieve fitheid van hun muggen gemakkelijk op individueel niveau aan te pakken. In vergelijking met conventionele methoden vermindert dit protocol aanzienlijk de tijd, ruimte en arbeid die nodig zijn om de vruchtbaarheid en vruchtbaarheid van muggen op individueel niveau te testen. Begin met het voorbereiden van platen voor het ovipositie-experiment.Boor vier tot zes gaten per put in het deksel van een 24-put kweekplaat met behulp van een huishoudelijke boor met een bit van 1,6 millimeter. Was en spoel de borden een dag voor het experiment en week ze 30 tot 60 minuten in 1%tot 5%-bleekmiddel bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens de platen grondig af onder stromend gedeioneerd water en droog ze.Smelt 2% agarose in gedeioneerd water en voeg onmiddellijk 500 microliters van de gesmolten agarose toe aan elke put van een 24-put plaat. Laat de platen 's nachts op de labbank liggen om condensatie uit te drogen. Verwijder ten minste 16 uur voor de bloedtoevoer elke bron van water of suiker van de vrouwelijke muggen.Verwarm op de dag van de voeding een watercirculatiepomp tot 37 graden Celsius en voed de muggen gedurende 15 tot 3

improved-fecundity-fertility-assay-for-aedes-aegypti-using-24-well

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel refractaire voor het dengue virus moet worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van virale infecties in de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van dengue infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor het groeien van het virus in de cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Dengue Infecties in Muggen (A. aegypti) en Infectie Fenotype Bepaling

Dit protocol bevat instructies voor het klonale-cellijn selectie en een calcium-bioluminescentie test om de structuur-activiteit relaties van gesynthetiseerd geleedpotigen neuropeptiden op hun verwante GPCR's te analyseren. Deze test kan gebruikt worden voor receptor deorphanization en structuur-activiteit relatie studies voor synthetische analoog ontwerp en peptide / drug-lead discovery.

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Om populatieonderdrukking van Aedes aegypti te bereiken met behulp van het RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) systeem, moeten grote aantallen mannelijke muggen worden vrijgelaten. Dit vereist het gebruik van massaopfoktechnieken en -technologie om betrouwbare systemen te bieden om het maximale aantal mannelijke muggen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Massaproductie van genetisch gemodificeerde Aedes aegypti voor veldreleases in Brazilië

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia worden vrijgegeven in natuurlijke populaties te onderdrukken van de overdracht van arboviruses. We worden methoden beschreven aan achterzijde Ae. aegypti met Wolbachia infecties in het laboratorium voor experimenten en veld release, voorzorgsmaatregelen nemen om laboratorium aanpassing en selectie te minimaliseren.

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Een protocol om de microsporidische parasiet Edhazardia aediste cultuuren. De parasiet wordt doorgevoerd van de ene generatie Aedes aegypti muggen naar de volgende via horizontale overdracht in het larvestadium, gevolgd door verticale transmissie in het volwassen stadium. Levende sporoplasma's overleven op lange termijn in geïnfecteerde eieren.

Voortplanting van de Microsporidische Parasiet Edhazardia aedis in Aedes aegypti Muggen

De steriele insectentechniek (SIT) wordt gebruikt om specifieke, medisch belangrijke muggenpopulaties te beheersen die bestand kunnen zijn tegen chemische controles. Hier beschrijven we een methode voor massale opfok en voorbereiding van steriele mannelijke muggen voor vrijlating in een operationeel SIT-programma gericht op de Aedes aegypti-mug .

Bestraalde en gemarkeerde mannelijke Aedes aegypti-muggen voorbereiden voor vrijlating in een operationeel steriel insectentechniekprogramma

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Het huidige protocol beschrijft hoe gemeenschappelijke levensparametergegevens bij Aedes aegypti-muggen kunnen worden gemeten, waaronder vruchtbaarheid, vleugelgrootte, vruchtbaarheid, geslachtsverhouding, levensvatbaarheid, ontwikkelingstijden, mannelijke bijdrage en levensduur van volwassenen. Deze metingen kunnen worden gebruikt om de fitheid van transgene muggen te beoordelen.

Kwantificering van fitnesskosten bij transgene Aedes aegypti-muggen

Deze studie presenteert een flexibel en gestandaardiseerd ei-uitkomstassayplatform in Caenorhabditis elegans dat meerdere experimentele formaten integreert. De aanpak verbetert reproduceerbaarheid, schaalbaarheid en toegankelijkheid, waardoor robuuste evaluatie van geneesmiddeleffecten en ontwikkelingsprocessen mogelijk is, terwijl het kosteneffectief en gemakkelijk aanpasbaar blijft voor zowel onderzoekstoepassingen als onderwijsomgevingen.

Eenvoudige en toegankelijke ei-uitkomstassays in Caenorhabditis elegans: Aanpasbare formaten voor drugsscreening

Leer een gestroomlijnde methode voor vruchtbaarheidstests van individuele Aedes aegypti met 24-well kweekplaten. Dit protocol vermindert tijd, ruimte en arbeid voor ei- en larvetelling in vectorbiologisch onderzoek.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

Meer video's verkennen