Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

De ACE is een optimale beeldvorming bezienswaardigheden. Het ondersteunt om het te herhalen in de lange termijn in vivo beeldvorming van eilandjecellen om hun functie en levensvatbaarheid in een enting situatie te bestuderen. Het kan ook worden uitgebreid om andere aspecten onder fysiologische en pathologische omstandigheden in real time te bestuderen.

Het voordeel van de ACE-techniek ligt in het feit dat dezelfde individuele menselijke alvleeskliereilandjes gedurende een langere periode niet-invasief kunnen worden gevolgd met subcellulaire resolutie. Slagingspercentages van bètacelvervangende therapie blijven verbeteren. De evaluatie van de efficiëntie van eilandjes en overleving in vivo blijft echter nog steeds een uitdaging.

Deze methode kan helpen bij het beoordelen en optimaliseren van de resultaten van eilandjestransplantaties. Deze aanpak is niet beperkt tot alvleesklier eilandjes alleen. Het is ook zeer geschikt om onderzocht weefsels getroffen.

Bijvoorbeeld, bij diabetische complicaties, zoals nierglomeruli of leverstukken, om er maar een paar te noemen. Om te beginnen plaats de muis op een warme verwarmingskussen positie in de hoofdhouder en zet op de neus masker. Gebruik de duim en wijsvinger om het hoofd iets op te tillen.

Maak het vast met de metalen stukken aan de zijkanten. Zorg ervoor dat de oorstukken het hoofd direct onder de oren bevestigen. Onderhuids buprenorfine-oplossing injecteren in de achterkant van de muis.

Trek voorzichtig de oogleden van het oog in om te worden getransplanteerd met behulp van stompe tangen. Pop het oog uit en losjes repareren met een pincet bedekt met een polyethyleen buis. Na het overbrengen van de oogleden naar een petrischaaltje met PBS, pak ongeveer 20 tot 30 eilandjes in de oogblikvorm.

Met behulp van een 25-meter naald niveau naar boven, zorgvuldig steek de tip in het hoornvlies en maak een enkele laterale incisie. Til het hoornvlies voorzichtig op met de canule die vooraf is geladen met eilandjes en laat de eilandjes langzaam los in het oog. Trek de canule langzaam in en breng ooggel aan op het oog.

Verwijder na 10 minuten de tangen, houd het ooglid vast en zet het oog terug naar zijn normale positie. Voor beeldvorming van geïmplanteerde menselijke eilandjes met twee fotonmicroscopie, plaats het hoofdhouderplatform onder de microscoop en toedien ooggel op het oog als een onderdompelingsvloeistof tussen het hoornvlies en de lens. Plaats het oog onder het doel en beeld de geïmplanteerde menselijke eilandjes zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Als u de automatischefluorescentie wilt verwijderen, gaat u naar het tabblad afbeeldingsverwerking, kiest u kanaalrekenkundige en typt u kanaal één minkanaal twee. Dit creëert een nieuw kanaal vier. Hernoem het vasculatuur.

Herhaal dit proces en typ kanaal drie min kanaal twee om een nieuw kanaal vijf te maken en de naam tomaat alles te hernoemen. Als u het eilandje handmatig een nieuw oppervlak wilt definiëren en handmatig bewerken in de wizard wilt kiezen. Houd de aanwijzer in de selecteertmodus en in de 3D-weergave.

En klik op volume om secties te visualiseren. Kies op het tabblad tekenen contour en klik op tekenen om contouren rond de eilandjesrand te tekenen, te beginnen in slicepositie één. Ga vervolgens naar een nieuwe segmentpositie en herhaal tekencontouren.

Werk af met het laatste segment boven aan de eilandje en klik door op het tabblad Oppervlakte maken te klikken. Volgende segment, islet vasculature en islet tomaat fluorescentie met behulp van eilandje masker. Kies het eerder gedefinieerde object eilandjesmasker, ga naar het tabblad bewerken en klik op het tabblad Masker, dat een nieuw venster opent.

Kies het vasculaturekanaal in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie en activeer opties duplicaatkanaal voordat u masker toepast. Constant binnen, buiten en stel voxels buitenoppervlak aan 0.000 die een nieuw kanaal zes leidt. Wijzig de naam van dit kanaaleiland vasculature.

Herhaal de vorige stappen en kies de tomaat in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie, om het nieuwe kanaal te maken, de naam ervan te wijzigen, islettomaat te is. Maak vervolgens een nieuw oppervlak in het scènemenu en kies automatische creatie in de wizard. Stel het bronkanaal in op de eerder gemaakte islet vasculature en kies achtergrondaftrekken.

Gebruik optioneel filters. Kies bijvoorbeeld volume en pas het filter in het venster aan, waarmee geselecteerde serviceobjecten kunnen worden verwijderd. Maak de wizard af en geef het nieuwe oppervlakobject, eilandje vasculatuur, een naam.

Ga in het serviceobject islaatatuur naar het tabblad bewerken en klik op het tabblad Masker, dat een nieuw venster opent. Kies het islettomaatkanaal in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie en stel voxels buitenoppervlak in op 10.000, waardoor een nieuw kanaal wordt gemaakt. Hernoem dit kanaal eilandje tomaat vasculatuur.

Voor het segmenteren tomaat capsule fluorescerend signaal kies kanaal rekenkunde in de beeldverwerking tabblad en type kanaal zeven minus kanaal acht het creëren van het nieuwe kanaal. Hernoem het tomatencapsule. Maak een nieuw oppervlak zoals eerder beschreven en kies bronkanalen, islet tomaat vasculatuur of tomaat capsule in de wizard.

Voer vervolgens achtergrondaftrekken uit. Open het backscatterbestand van de eilandjes en maak een nieuw oppervlak. Kies in de wizard automatische creatie en definieer interessegebied.

Pas indien nodig de drempel in absolute intensiteit aan. Het oppervlakobject kan aan of uit worden geklikt om te kruisen met de bijbehorende kanaalintensiteit. Als u klaar bent, sluit u de wizard.

Voer ten slotte kwantificering uit, selecteer een gemaakt oppervlakteobject in het scènemenu en ga naar het tabblad Statistieken. Als u gedetailleerde volumegegevens wilt ophalen, kiest u het gedetailleerde tabblad en selecteert u specifieke waarden en volume in het vervolgkeuzemenu. Als u de totale volumewaarde wilt ophalen, gaat u naar het gedetailleerde tabblad en kiest u gemiddelde waarden.

Dit protocol werd gebruikt om niet-gelabelde menselijke eilandjes te transplanteren in de binnenkamer van het oog van acht weken oude vrouwelijke rode fluorescerende ontvanger muizen. Interactieve imaging software werd vervolgens gebruikt om kwantitatieve gegevens uit de beelden te halen. In vivo fluorescens beeldvorming, de menselijke eilandjes grafts werd aangetast door aanzienlijke interferentie van weefsel autofluorescentie die niet werd waargenomen in muizen eilandje grafts.

Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, werd het autofluorescentiekanaal afgetrokken. Vervolgens werden de eilandjesgrens met de naam eilandjesmasker en de bijbehorende kanalen handmatig gedefinieerd. Ten slotte werd de segmentatie van het tomatensignaal in de vasculatuur van het ooglid en de ooglidcapsule en de uiteindelijke oppervlakteweergave gebruikt om kwantitatieve gegevens te extraheren.

Hier als een representatieve longitudinale beeldvorming sessie van dezelfde menselijke eilandje graft op twee weken, twee maanden, vijf maanden en acht maanden na transplantatie. MIP-beelden van oorspronkelijk opgenomen ruwe gegevens, verwerkte afbeeldingen na het verwijderen van autofluorescentie van islet en een gesegmenteerde eilandjeobjecten worden weergegeven. Bij het uitvoeren van de ooglidinjectie moet u de eilandjes in een klein volume voorladen en flexibele dubbele lichtarmen op uw stereomicroscoop gebruiken om de ruimte van de oogkamer te markeren om de eilandjes met succes in de ACE te injecteren.

Na de in vivo beeldvorming kunnen de ogen worden vastgesteld en verder worden onderzocht op antilichaamvlekken en conventionele histologie. Deze techniek is zeer nuttig voor functionele studies van individuele menselijke eilandjes in real time en onder fysiologische omstandigheden, vooral in de context van vascularisatie, levensvatbaarheid en metabole studies.