Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Dit protocol kan worden toegepast op elk proces dat resulteert in dubbelstrengs DNA-pauzes, levert gedetailleerde kwantitatieve gegevens over kinetiek. Hoewel deze methode één molecuulresolutie heeft, meet het tot 1000 DNAs in één experiment, waardoor goede statistieken worden verstrekt. De primaire toepassing van deze methode is het bestuderen van de mechanismen die betrokken zijn bij DNA-binding en modificatie.

We zijn bijvoorbeeld geïnteresseerd in het bestuderen van DNA-doelonderzoek, wat relevant is voor alle DNA-bindende eiwitten. Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, bedenk dan dat enkele molecuul tethers zijn delicaat, en eenmaal vorm, moet worden behandeld met zorg. Een juist aandeel van gefunctionaliseerde oppervlakken is essentieel.

Er zijn een paar trucs voor het maken van de stroom zo. Naast het verwisselen van voorbeeldbuizen tijdens het verzamelen van gegevens, kan visuele demonstratie iemand helpen die nieuw is in deze procedure. Om de cover slips te wassen, leg ze in kleurpotten en sonicate ze met ethanol gedurende 30 minuten.

Spoel ze grondig af met gedeïmiseerd en gedestilleerd water, dompel ze vervolgens onder in een molaire kaliumhydroxide en sonisch ze voor 30 minuten. Herhaal de wasvolgorde, zorg ervoor dat de cover slips spoelen met water na elke wasbeurt. Bewaar de schoongemaakte dekselglijden in kleurpotten met water.

Gebruik een schoon scheermes om acht centimeter lange laad- en uitgangsbuizen te snijden en ze in gaten te steken in een schone glazen schuif. Epoxy de slang en laat genezen voor vijf minuten om het te beveiligen. Breng dubbelzijdige tape voorgesneden met het kanaal patroon op de glazen platen, en glad het uit met plastic tangen om een goede afdichting te bereiken.

Pel de rug van de tape, en breng een schone cover slip, glad het uit met de tangen. Dan, epoxy de rand van de cover slip om de stroomcel te verzegelen en laat het genezen. Bereid het gelabelde DNA voor tethering door het uitvoeren van PCR volgens manuscript aanwijzingen.

Zuiver vervolgens het PCR-product met een PCR-opruimkit. Bereid 10 milliliter buffer A, en ontgassen in een vacuüm desiccator voor ten minste een uur. Om de stroomcel te functionaliseren, injecteer u 25 microliters anti-digoxigenine en fab fragmenten in PBS, in het stroomkanaal, met behulp van een gel laadtip om in de PE60-slang te passen.

De stroomcel 30 minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Trek na de incubatie 0,5 milliliter buffer A door het kanaal met een spuit, waarbij u ervoor zorgt dat er geen lucht in het kanaal wordt introduceert. Berg vervolgens de stroomcel op een omgekeerde microscoop.

Sluit de uitlaatbuis aan op een spuitpomp en zet de inlaatbuis in een microcentrifugebuis met buffer A.Handjes trek minstens 0,5 milliliter buffer A om het systeem door te spoelen en de pomp te primen. Laat de pomp vervolgens minstens vijf minuten op 10 microliter per minuut draaien om het systeem in evenwicht te brengen. Vortex de voorraad fles kralen, en pipet 1,6 microliter van de kralen in 50 microliter van buffer A, dan vortex ze weer.

Plaats de kralen op een magnetische scheidingsafscheid en pipet uit de buffer. Schors ze opnieuw in 50 microliters van buffer A en draaikolk ze. Na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten de kralen in 100 microliter buffer A voor een laatste concentratie van 160 microgram per milliliter.

Bereid 480 microliter van 0,5 picomolar gelabeld DNA substraat in buffer A, en pipette 20 microliters van kraal suspensie in het verdunde DNA. Plaats het mengsel drie minuten op een rotator. Laad na de drie minuten het monster onmiddellijk in het kanaal met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut gedurende 15 minuten, of totdat voldoende kralentethering is waargenomen.

Was het kanaal van alle vrije kralen door de inlaatbuis om te schakelen naar een verse buis van buffer A en vloei het minstens 10 minuten in op 50 microliter per minuut of totdat er geen losse kralen zijn waargenomen. En het is handig om een inline klep te gebruiken om de stroom af te snijden en de slang te schakelen. Schakelen buizen in een vloeiende beweging en zorg ervoor dat vloeistof niveaus in nieuwe en oude monster buizen overeenkomen om terugstroom te voorkomen.

Bereid voordat u gegevens verzamelt de juiste concentratie dna-decolletéenzym voor en steek de inlaatbuis in het monster. Laat de magneet over de stroomcel zakken. Stel de pomp in om 80 microliter monster te injecteren op 150 microliter per minuut en begin met het verzamelen van gegevens.

Een minuut in het verzamelen van gegevens, activeer de pomp. Hier is een representatief beeld van de vastgebonden kralen voor en na de reactie. Gegevensanalyse werd uitgevoerd om het aantal kralen te kwantificeren dat nog vastgelijt is tijdens de decolletéreactie.

Deze techniek werd gebruikt om de site specifieke DNA decolleté tarieven van Nde1 voor eiwitconcentraties variërend van 0,25 tot vier eenheden per milliliter, en twee verschillende concentraties van magnesium te meten. Elke voorwaarde werd minstens tweemaal gerepliceerd, met een paar 100 tot 1000 vastgebonden DNA is per experiment. Bij voldoende lage eiwitconcentraties is de snelheid evenredig met eiwitten en onafhankelijk van magnesium.

Voor hoge eiwitconcentraties is de snelheid afhankelijk van magnesium, maar onafhankelijk van de eiwitconcentratie. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat luchtbellen in de slang en het stroomkanaal het experiment kunnen uitvoeren. Zorg ervoor dat u geen lucht in de lijnen toe te staan tijdens het schakelen van buizen, en ontgassen alle buffers voor gebruik.

De tethering methode maakt het mogelijk om het effect van spanning in het DNA op de reactie te onderzoeken. Dit kan worden bereikt door de magneetsterkte te variëren of de stroom toe te passen tijdens het verzamelen van gegevens.