Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem
May 22nd, 2020
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.
De celgebaseerde test maakt de observatie en kwantificering van trans-adhesie-interacties mogelijk zonder de noodzaak van langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur. Hoewel de eiwitinteracties die hier worden getest relevant zijn voor neurobiologie, kan deze methode worden toegepast op elk onderzoeksgebied waar eiwitadhesie intercellulair plaatsvindt. 48 uur na het transfecteren van de HEK-293T-cellen, oogst de cellen uit de zes-well plaat voor aggregatie.
Was eerst elke well twee keer met PBS. Voeg vervolgens één milliliter 10 millimolair EDTA toe aan elke well om de cellen voorzichtig los te maken en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius. Na vijf minuten incubatie, tik zachtjes op de plaat om de cellen los te maken en oogst elk well in een aparte 15 milliliter conische buis.
Centrifugeer de buizen bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Terwijl de cellen pellen, bereid zes incubatiebuizen voor door de toppen van microcentrifugebuizen te labelen met de experimentele omstandigheden. Elke permutatie van GFP en mCherry moet worden gebruikt.
Verwijder het supernatant van de 15 milliliter conische buizen en resuspendeer de cellen in 500 microliter medium. Tel de cellen in elke conische buis met behulp van een hemocytometer. Deel vervolgens 200.000 cellen van elke conditie toe aan de juiste incubatiebuis voor een één-op-één mix in een totaal volume van 500 microliter.
Na het beoordelen van de baseline-aggregatie beschreven in de volgende sectie, plaats de incubatiebuizen in een langzame buisrotator bij kamertemperatuur. Om aggregatie te beoordelen, pipetteert u bij baseline en opnieuw na 60 minuten 40 microliter van de incubatiebuis op een geladen microscoopglaasje. Baseline-acquisitie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd na de toevoeging van cellen aan de microcentrifugebuis.
Beeld het glaasje af onder fluorescentie in zowel het groene als het rode kanaal. Voor elk glaasje, leg beelden vast van drie verschillende gezichtsvelden in één brandpunt. HEK-293T-cellen werden getransfecteerd met een eiwit van belang, een gemutateerd eiwit van belang of een ligand van belang en co-getransfecteerd met een fluorescerend eiwit.
Celpopulaties die het eiwit van belang tot expressie brengen, werden gemengd met celpopulaties die het ligand van belang tot expressie brengen en na 60 minuten op aggregatie beoordeeld. In overlays van beelden die in het groene en rode kanaal zijn vastgelegd, verschijnt aggregatie als gele punten. Voorwaarden waarin cellen geen synaptische liganden tot expressie brachten, vertoonden minimale aggregatie.
Ook minimale aggregatie werd getoond wanneer slechts één van de twee populaties synaptische liganden tot expressie bracht. Er werd geen aggregatie getoond wanneer de twee celpopulaties onverenigbare adhesiemoleculen tot expressie brachten. Voorwaarden met compatibele adhesiemoleculen vertoonden significante aggregatie na een incubatie van 60 minuten.
Verrassend genoeg vertoonde het gemuteerde eiwit van belang significant meer aggregatie dan zijn wild-type tegenhanger, wat suggereert dat de puntmutatie de bindingscapaciteiten van het eiwit verbetert. Mutaties in veel adhesiemoleculen worden vaak in verband gebracht met neurodevelopmentele, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen. Met deze techniek kan men de effecten van ziekterelevante puntmutaties op trans-interacties screenen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een geoptimaliseerd protocol voor het snel en semikwantitatief meten van ligand-receptorinteracties in trans, met behulp van een fluorescentiemicroscopiebenadering in HEK-293T-cellen. De methode maakt de kwantificering mogelijk van eiwit-adhesie-interacties die relevant zijn voor neurobiologie en mogelijk andere onderzoeksgebieden.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurobiologie
- Cel-adhesie
- Eiwitinteracties
Achtergrond
- Ligand-receptorinteracties zijn cruciaal voor cellulaire communicatie.
- Het begrijpen van deze interacties helpt bij het verduidelijken van mechanismen van neurodevelopmentele en neuropsychiatrische stoornissen.
- Traditionele methoden kunnen uitgebreide eiwitzuivering of gespecialiseerde apparatuur vereisen.
- Deze studie stelt een efficiëntere aanpak voor met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Doel van het onderzoek
- Om een snel en effectief protocol te ontwikkelen voor het bestuderen van eiwit-adhesie in een cel-gebaseerde assay.
- Om te beoordelen hoe puntmutaties in eiwitten trans-interacties beïnvloeden.
- Om deze methode breed toe te passen in eiwit-adhesiestudies buiten de neurobiologie.
Gebruikte methoden
- Fluorescentiemicroscopie werd gebruikt voor het beeldvormen van celinteracties.
- HEK-293T-cellen werden gebruikt als biologisch model, met focus op getransfecteerde eiwitten en liganden.
- De experimentele tijdlijn omvatte de beoordeling van celaggregatie na 60 minuten post-transfectie.
- Celtelling werd uitgevoerd met behulp van een hemocytometer, gevolgd door celresuspensie en menging voor beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Aggregatie van cellen die compatibele adhesiemoleculen tot expressie brengen, werd significant verbeterd na 60 minuten.
- Gemuteerde eiwitten vertoonden meer aggregatie in vergelijking met wild-type tegenhangers, wat wijst op verbeterde bindingscapaciteiten.
- Minimale aggregatie werd waargenomen wanneer geen of slechts één populatie synaptische liganden tot expressie bracht.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een gestroomlijnde methode voor het evalueren van intercellulaire adhesie-interacties.
- De bevindingen benadrukken het potentieel van deze techniek voor het onderzoeken van de effecten van mutaties op eiwitinteracties.
- Inzichten uit deze methode zijn waardevol voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan verschillende neurodevelopmentele en psychologische stoornissen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
