Name: Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor het meten van ligand-receptorinteracties in trans met behulp van fluorescentiemicroscopie in HEK-293T-cellen. Deze methode kwantificeert eiwitadhesie-interacties relevant voor de neurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door grants van het National Institute of Mental Health (R00MH103531 en R01MH116901 aan J.A.), een predoctorale training Grant van het National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.), en een Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). We danken Dr. Kevin Woolfrey voor hulp met de microscoop, Dr. K Ulrich Bayer voor het gebruik van zijn epifluorescente microscoop, en Thomas Südhof (Stanford University) voor de LRRTM2 plasmide.

1. Celcultuur en transfectie
<ol><li>Maak HEK celmedia met DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) aangevuld met 4,5 g/L glucose, L-glutamine & natriumpyruvaat en 10% FBS. Steriel filter.</li>
	<li>Bepaal vooraf geschikte liganden en receptoren voor aggregatietest. OPMERKING: Neurexin3α SS4+/- en een van de bekende liganden, LRRTM2, werden gebruikt in deze studie. Liganden en receptoren van belang werden uitgedrukt uit cDNA's in pcDNA3.1. Een Gibson-assemblage werd gebruikt om Neurexin3α in pcDNA3.112te plaatsen. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Bereid HEK293T-cellen voor.<ol>
<li>Kweek HEK293T cellen tot samenvloeiing in één T-75 kolf.</li>
		<li>Eenmaal samenvloeiend, gebruik 2 ml trypsine en plaats in 37 °C incubator gedurende 2 minuten. Voeg 6 ml HEK-media toe aan de kolf om cellen te resuspenderen en breng alle 8 ml over in een conische buis van 15 ml.</li>
		<li>Pellet bij 500 x g gedurende 5 min en resuspend in HEK celmedia voor een totaal van 8 ml.</li>
		<li>Tel cellen en voeg 735.000 cellen toe aan elke put van een plaat met 6 putten. Pas het uiteindelijke volume aan op 2 ml voor elke put met behulp van HEK-celmedia.</li>
		<li>Plaats in 37 °C incubator en laat cellen 's nachts groeien of totdat ze 50-60% samenvloeiing bereiken.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfecteer HEK293T-cellen met behulp van de calciumfosfaatmethode13.<ol>
<li>Transfecteer goed-1 met 3 μg van het eiwit van belang en co-transfect met 1 μg fluorescerend eiwit (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- en 1 μg mCherry).</li>
		<li>Transfecteer goed-2 zoals in stap 1.4.1. maar met het gemuteerde eiwit van belang (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfecteer goed-3 met 3 μg van de ligand van belang en co-transfecteer met 1 μg van een ander fluorescerend eiwit (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 en 1 μg GFP).</li>
		<li>Transfecteer goed-4 en goed-5 om als negatieve controles te dienen: goed-4 met 1 μg GFP en goed-5 met 1 μg mCherry.</li>
		<li>Bereid een andere plaat voor (zoals in stap 1.4.1-1.4.4) indien aanvullende voorwaarden of controles nodig zijn (Neurexin3αWT/A687T SS4+). OPMERKING: Transfectie-efficiëntie wordt 24 uur na transfectie geanalyseerd onder een epifluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd als het aantal cellen dat het fluorescerende eiwit uitdrukt waarmee ze zijn getransfecteerd. Een meer gestroomlijnde aanpak zou de transfectie van HEK-cellen met een bicistronic vectorcodering voor een fluorescerend eiwit en de ligand van belang omvatten en wordt ten zeerste aanbevolen boven co-transfectie. In het geval van deze studie zijn alfa-Neurexinen ~4,3 kb en werd een lage fluorescentie-intensiteit waargenomen met behulp van een bicistronic systeem dat cotransfectie vereist.</li>
	</ol></li>
	<li>48 uur na de transfectie, oogst cellen voor aggregatie.<ol>
<li>Was ze twee keer goed met PBS.</li>
		<li>Voeg 1 ml 10 mM EDTA in PBS toe aan elke put om de cel-celinteracties voorzichtig te scheiden en de plaat gedurende 5 minuten te incuberen bij 37 °C. OPMERKING: Trypsine wordt niet aanbevolen voor stap 1.5.2 vanwege mogelijke proteolytische decolleté van adhesiemoleculen in studie. Bovendien kan het protocol na toevoeging van EDTA niet worden gestopt totdat het is voltooid, omdat cellen nu worden blootgesteld aan omgevingsomstandigheden.</li>
		<li>Tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken en oogst ze elk goed in afzonderlijke conische buizen van 15 ml.</li>
		<li>Centrifugeer conische buizen op 500 x g en kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Terwijl cellen pelleten, bereid 6 incubatiebuizen voor door de bovenkant van elke microcentrifugebuis met elke aandoening te labelen. OPMERKING: Elke permutatie van GFP- en mCherry-omstandigheden moet worden gebruikt om alle experimentele omstandigheden en de juiste controles te omvatten. Bijvoorbeeld: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Maak extra buizen om aan verdere voorwaarden en bedieningselementen te voldoen.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en resuspend cellen in 500 μL HEK media met 10 mM CaCl2 en 10 mM MgCl2 opgewarmd tot 37 °C. OPMERKING: De toevoeging van CaCl2 en MgCl2 maakt hechtingsmoleculen in staat om binding te herstellen en is alleen vereist als de transcellulaire interactiepartners in kwestie divalente kationen nodig hebben voor hechting.</li>
	<li>Tel de cellen in elke conische buis van 15 ml met behulp van een hemocytometer en aliquot 200.000 cellen van elke aandoening in de juiste buis vanaf stap 1.6.1 voor een 1:1-mix in een totaal volume van 500 μL. OPMERKING: Het duurt slechts 5 minuten per voorwaarde om te tellen en aliquot bedragen.</li>
	<li>Incubeer buizen bij kamertemperatuur in een langzame buisrotator.</li>
</ol>2. Beeldverwerving
<ol><li>Optimaliseer microscoopverwervingsparameters voor specifieke monsters. In dit voorbeeld zijn beelden gemaakt op een breedveldmicroscoop. Gebruik een 5x luchtdoelstelling (NA: 0,15; WD: 20000 μm) om een groot genoeg veld voor analyse te krijgen.</li>
	<li>Beoordeel de aggregatie van de basislijn onmiddellijk na het mengen van de twee omstandigheden van HEK-cellen in stap 1.8. Dit zijn nu de 'time zero' beelden.<ol>
<li>Pipet 40 μL van elk monstermengsel op een geladen microscoopschuif en beeld onder fluorescentie in zowel de 488- als 561-kanalen.</li>
		<li>Verkrijg drie verschillende gezichtsvelden met één scherpstelvlak per voorbeelddaling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verkrijg de laatste beelden op 60 min als het 'time 60' beeld.<ol>
<li>Om het "tijd 60"-beeld van het mengsel na een incubatie van 60 minuten te verkrijgen, neemt u nog eens 40 μL monster van elke toestand uit roterende buizen en pipetteer elk monster op een geladen dia. Afbeelding zoals in stap 2.2.2. OPMERKING: Celaggregatie moet elke 15 minuten worden gecontroleerd totdat verzadiging optreedt. De timing van aggregatie hangt af van de eiwitten die worden getest.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ImageJ/Fiji Analyse
<ol><li>Sla analysebestanden op om de mate van aggregatie te kwantificeren met Fiji/ImageJ.<ol>
<li>Sla de meegeleverde aanvullende coderingsbestanden op in de map imageJ-macro's op de computer.</li>
		<li>Installeer de meegeleverde aggregatiemacro (Plug-ins, Macro's, Installeren en selecteer het bestand "AggregationAssay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drempelwaarden bepalen.<ol>
<li>Laad een 'time zero' .tif bestand in imageJ en splits de kanalen (Image | Kleur | Kanalen splitsen). OPMERKING: De afbeelding 'tijd nul' wordt gebruikt om de drempel en de kleinste punctagrootte voor het hele experiment te bepalen.</li>
		<li>Masker elk kanaal(Plug-ins | Macro's | AggregationAssay_MakeMask). Laat het venster Masker uit afbeelding verschijnen. Schakel de selectievakjes naast Drempelwaarde voor afbeelding bepalen en Clusterparams bepalen in histogram in en klik op OK.</li>
		<li>Bepaal de drempelwaarde van de afbeelding met behulp van de diabalk, noteer het nummer rechts van de diabalk en klik op OK.</li>
		<li>Er verschijnt een histogram van clustergrootte. Selecteer een clustergrootte in het histogram dat bij het experiment past, typ dit getal in het vak Min Clustergrootte: en klik op OK. Clusters onder deze grootte worden niet geanalyseerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer de analyse uit.<ol>
<li>Open de 'time 60'-afbeelding van toestand 1 in imageJ en splits de kanalen zoals in stap 3.2.1.</li>
		<li>Maskeer elk kanaal (plug-ins, macro's AggregationAssay_MakeMask). Gebruik dezelfde drempel en grootte die zijn bepaald in stap 3.2.3 en stap 3.2.4. Schakel de selectievakjes naast Drempel voor afbeelding bepalen en Clusterparams bepalen uit Histogram uit en typ handmatig de grootte en drempelwaarden in de juiste velden en klik op OK.</li>
		<li>Bereken de aggregatie-index (Plugins | Macro's | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selecteer de gemaskeerde kanalen die u wilt vergelijken en de map waarin de resulterende bestanden worden opgeslagen.</li>
		<li>Herhaal stap 3.3.1–3.3.3 voor elke 'time 60'-afbeelding in elke voorwaarde. OPMERKING: De aggregatie-index wordt gedefinieerd als het totale overlappingsgebied gedeeld door de som van de twee kanaalgebieden minus het overlappingsgebied vermenigvuldigd met 100 (Aggregatie-index = overlapgebied/[gebied van kanaal 1 + gebied van kanaal 2 – overlapgebied] x 100). Deze normalisatie is een 'OR'-bewerking tussen de twee gemaskeerde kanalen die de totale pixels in een van beide maskers vertegenwoordigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het ontleden van de eiwit-eiwitinteracties die optreden in trans tijdens celhechting kan leiden tot een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan basis cellulaire processen, waaronder de vorming, functie en onderhoud van synapsen tijdens rijping en remodellering. De implicaties van cel-celinteracties breiden zich verder uit dan neurobiologie en hebben een bredere rol in signaaltransductie, celmigratie en weefselontwikkeling14. Aberraties in celhechting kunnen cellula...

Synaptische interacties gefaciliteerd door synaptische adhesiemoleculen zijn fundamenteel voor de ontwikkeling, organisatie, specificatie, onderhoud en functie van synapsen en de generatie van neurale netwerken. De identificatie van deze transsynaptische celhechtingsmoleculen neemt snel toe; het is dus van fundamenteel belang om bindende partners te identificeren en te begrijpen hoe deze nieuwe hechtingsmoleculen met elkaar interageren. Bovendien heeft genoomsequentie mutaties geïdentificeerd in veel van deze hechtingsmoleculen die vaak verband houden met een veelheid aan neuroontwikkelings-, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen1. Mutaties in genen die coderen voor synaptische celhechtingsmoleculen kunnen transinteracties nadelig veranderen en kunnen bijdragen aan patofysiologische veranderingen in synapsvorming en of onderhoud.
Er bestaan meerdere tests om eiwit-eiwitinteracties kwantitatief te beoordelen, zoals isothermische calorimetrie, circulair dichroïsme, oppervlakteplasmonresonantie2 en hoewel kwantitatief van aard, hebben ze verschillende beperkingen. Ten eerste hebben ze recombinant eiwit nodig, wat soms lange en vervelende zuiveringsstappen vereist. Ten tweede hebben ze geavanceerde gespecialiseerde apparatuur en technische expertise nodig. Ten derde kunnen ze de mate van binding overschatten, omdat ze zowel cis- als transinteracties mogelijk maken tussen eiwitten die van nature aan een membraan in vivo zijn vastgebonden. Hier stellen we een eenvoudige en relatief snelle test voor die uitsluitend transinteracties test.
Om veel van de complicaties in verband met gezuiverde eiwittests te omzeilen, hebben we een op cellen gebaseerde eiwitinteractietest geoptimaliseerd die transinteracties in een verminderd heterologe celsysteem herkapitaliseert. Deze test is eerder in verschillende vormen gebruikt om transcellulaire interacties te bestuderen. In deze benadering worden kandidaatcelhechtingsmoleculen omgezet in HEK293T-cellen. Bij fysiologische omstandigheden vertonen HEK293T-cellen geen zelfaggregatie, waardoor ze voorbeeldige modellen zijn voor deze test. Echter, wanneer individuele populaties van HEK-cellen die receptor en ligand uitdrukken worden gecombineerd, de binding van de receptor en de ligand krachten aggregatie van HEK cellen optreden. Deze aggregatie wordt uitsluitend bemiddeld door transinteracties en is meestal in tientallen minuten waarneembaar. Er zijn geen eiwitzuiveringsstappen vereist in deze methode, en de efficiëntie van de methode is gebaseerd op het paradigma dat populaties hek-cellen die cognate adhesiemoleculen uitdrukken, worden gecombineerd en vervolgens slechts tientallen minuten later in beeld worden gebracht. Bovendien is deze methode relatief goedkoop, omdat er geen antilichamen of dure apparatuur nodig zijn. De enige apparatuur die nodig is voor het verkrijgen van gegevens is een standaard fluorescerende microscoop. Een bijkomend voordeel van deze celgebaseerde test is het vermogen om het effect van ziekterelevante puntmutaties op transinteracties snel te screenen. Dit kan worden uitgevoerd door HEK-cellen te transfecteren met cDCA's van de mutante varianten van het eiwit van belang.
In dit protocol presenteren we een voorbeeld waarin we onderzoeken of een missense mutatie in Neurexin3α (Neurexin3αA687T),geïdentificeerd bij een patiënt gediagnosticeerd met een ernstige verstandelijke beperking en epilepsie, interacties in trans verandert met leucine-rijke herhaalde transmembrane eiwit 2 (LRRTM2). Neurexin3α is een lid van de evolutionair geconserveerde familie van presynaptische celhechtingsmoleculen en hoewel recent werk meerdere rollen heeft geïdentificeerd bij de synaps3,4,5,6,7, blijft ons synaptische begrip van dit molecuul en alle leden van de neurexinefamilie onvolledig. LRRTM2 is een excitatory postsynaptische celhechtingseiwit dat deelneemt aan synapsvorming en -onderhoud8,9,10. Belangrijk is dat LRRTM2 uitsluitend interageert met neurexine isovormen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4-) missen, maar niet met neurexine isoformen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4+) bevatten. De menselijke missense mutatie (A687T) geïdentificeerd in Neurexin3α bevindt zich in een niet-bestudeerd extracellulair gebied dat evolutionair geconserveerd is en wordt bewaard tussen alle alfaneurexinen7. Aangezien de interactie tussen deze tweemoleculenis vastgesteld 8,9,11, stelden we de vraag: is het bindingsvermogen van Neurexin3α SS4- naar LRRTM2 gewijzigd door een A687T-puntmutatie? Deze test onthulde dat de A687T-puntmutatie onverwacht de aggregatie van Neurexin3α naar LRRTM2 verbeterde, wat suggereert dat het extracellulaire gebied waarin de puntmutatie zich bevindt, een rol speelt bij het bemiddelen van transsynaptische interacties.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubatie van gemengde populatie van HEK-cellen</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&mdash;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membraan</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterilisatie van HEK-media</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube centrifugebuizen</td><td>Ward&rsquo;s Science</td><td>470224-998</td><td>Oogsten van HEK-cellen</td></tr><tr><td>6 wel steriele weefselkweekplaten</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>Kweek van HEK-cellen</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Calciumfosfaattransfectie, HEK-celresuspendering</td></tr><tr><td>Centrifuge- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>75004377</td><td>Oogsten van HEK-cellen</td></tr><tr><td>CO2 celincubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubatie van HEK-cellen tijdens groei</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) met 4,5 g/L glucose, L-glutamine & natriumpyruvaat</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK-celonderhoud</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passeren/oogsten van HEK-cel</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Oogsten van HEK-cellen</td></tr><tr><td>Falcon Vented kweekkolven, 75cm2 groeioppervlak</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Kweek van HEK-cellen</td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK-celonderhoud</td></tr><tr><td>HEK293T cellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>Modelsysteem</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc- 69/1.52p</td><td>Beeldanalyse</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK-celresuspendering</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch watervrij</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Calciumfosfaattransfectie</td></tr><tr><td>Trypsine 0,25% (1X) Oplossing</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passeren van HEK-cellen</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td></td><td></td><td>Incubatie van gemengde populatie van HEK-cellen</td></tr><tr><td>UltraClear Microscoopglazen. Wit gefrost, positief geladen</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Beeldverwerving</td></tr><tr><td>Wide-field microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Beeldverwerving</td></tr></tbody></table>

transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Eiwitinteracties op cellulaire interfaces dicteren een veelheid aan biologische uitkomsten, variërend van weefselontwikkeling en kankerprogressie tot synapsvorming en -onderhoud. Veel van deze fundamentele interacties komen voor in trans en worden meestal veroorzaakt door heterofiele of homofiele interacties tussen cellen die membraanverankerde bindingsparen uitdrukken. Het ophelderen hoe ziekterelevante mutaties deze fundamentele eiwitinteracties verstoren, kan inzicht geven in een groot aantal celbiologievelden. Veel eiwit-eiwit interactietests zijn meestal niet disambiguate tussen cis en trans interacties, wat mogelijk leidt tot een overschatting van de mate van binding die optreedt in vivo en omvat arbeidsintensieve zuivering van eiwitten en / of gespecialiseerde bewakingsapparatuur. Hier presenteren we een geoptimaliseerd eenvoudig protocol dat het mogelijk maakt om alleen transinteracties te observeren en te kwantificeren zonder dat langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn. De HEK-celaggregatietest omvat het mengen van twee onafhankelijke populaties HEK-cellen, die elk membraangebonden cognate liganden uitdrukken. Na een korte incubatieperiode worden monsters in beeld genomen en worden de resulterende aggregaten gekwantificeerd.

De A687T-mutatie verhoogt de Neurexin3α SS4-binding aan LRRTM27 Om te onderzoeken hoe intercellulaire interacties van twee bekende synaptische eiwitten worden beïnvloed door de introductie van een puntmutatie gevonden bij een patiënt met een verstandelijke beperking en epilepsie, gebruikten we de bovenstaande HEK-celaggregatietest (figuur 1). Cellen werden getransfecteerd volgens sectie 1 en voorbereid op beeldvorming volgens secties 1 en 2 van het protocol. Ce...

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

De celgebaseerde test maakt de observatie en kwantificering van trans-adhesie-interacties mogelijk zonder de noodzaak van langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur. Hoewel de eiwitinteracties die hier worden getest relevant zijn voor neurobiologie, kan deze methode worden toegepast op elk onderzoeksgebied waar eiwitadhesie intercellulair plaatsvindt. 48 uur na het transfecteren van de HEK-293T-cellen, oogst de cellen uit de zes-well plaat voor aggregatie.Was eerst elke well twee keer met PBS. Voeg vervolgens één milliliter 10 millimolair EDTA toe aan elke well om de cellen voorzichtig los te maken en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius. Na vijf minuten incubatie, tik zachtjes op de plaat om de cellen los te maken en oogst elk well in een aparte 15 milliliter conische buis.Centrifugeer de buizen bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Terwijl de cellen pellen, bereid zes incubatiebuizen voor door de toppen van microcentrifugebuizen te labelen met de experimentele omstandigheden. Elke permutatie van GFP en mCherry moet worden gebruikt.Verwijder het supernatant van de 15 milliliter conische buizen en resuspendeer de cellen in 500 microliter medium. Tel de cellen in elke conische buis met behulp van een hemocytometer. Deel vervolgens 200.000 cellen van elke conditie toe aan de juiste incubatiebuis voor een één-op-één mix in een totaal volume van 500 microliter.Na het beoordelen van de baseline-aggregatie beschreven in de volgende sectie, plaats de incubatiebuizen in een langzame buisrotator bij kamertemperatuur. Om aggregatie te beoordelen, pipetteert u bij baseline en opnieuw na 60 minuten 40 microliter van de incubatiebuis op een geladen microscoopglaasje. Baseline-acquisitie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd na de toevoeging van cellen aan de microcentrifugebuis.Beeld het glaasje af onder fluorescentie in zowel het groene als het rode kanaal. Voor elk glaasje, leg beelden vast van drie verschillende gezichtsvelden in één brandpunt. HEK-293T-cellen werden getransfecteerd met een eiwit van belang, een gemutateerd eiwit van belang of een ligand van belang en co-getransfecteerd met een fluorescerend eiwit.Celpopulaties die het eiwit van belang tot expressie brengen, werden gemengd met celpopulaties die het ligand van belang tot expressie brengen en na 60 minuten op aggregatie beoordeeld. In overlays van beelden die in het groene en rode kanaal zijn vastgelegd, verschijnt aggregatie als gele punten. Voorwaarden waarin cellen geen synaptische liganden tot expressie brachten, vertoonden minimale aggregatie.Ook minimale aggregatie werd getoond wanneer slechts één van de twee populaties synaptische liganden tot expressie bracht. Er werd geen aggregatie getoond wanneer de twee celpopulaties onverenigbare adhesiemoleculen tot expressie brachten. Voorwaarden met compatibele adhesiemoleculen vertoonden significante aggregatie na een incubatie van 60 minuten.Verrassend genoeg vertoonde het gemuteerde eiwit van belang significant meer aggregatie dan zijn wild-type tegenhanger, wat suggereert dat de puntmutatie de bindingscapaciteiten van het eiwit verbetert. Mutaties in veel adhesiemoleculen worden vaak in verband gebracht met neurodevelopmentele, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen. Met deze techniek kan men de effecten van ziekterelevante puntmutaties op trans-interacties screenen.

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

In this video, we demonstrate the technique to measure transcellular interactions between synaptic cell adhesion molecules through the HEK cell aggregation assay. In this assay, an equal number of HEK cells expressing a desired presynaptic cell adhesion molecule and a fluorescent protein are mixed with HEK cells expressing a post-synaptic cell adhesion molecule and another fluorescent protein. The interaction between the cell adhesion molecules forces the cells to aggregate, which can be...

Cell Aggregation Assay to Detect Trans Interactions between Cell Adhesion Molecules

In this video, we demonstrate the in-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy technique to study protein-ligand interactions between unlabeled overexpressed proteins and small molecules. The successful ligand-protein interaction is confirmed visually by the appearance of an additional set of peaks in the spectral region of interest that gradually replaces the original peaks.

Quantitative In-Cell Hydrogen NMR Spectroscopy to Monitor Protein-Ligand Interactions

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de intrinsieke adhesieve eigenschappen van vermeende celadhesiemoleculen.  Het uitgescheiden, epatoom-getagde ectodomein van een celadhesiemolecuul wordt gevangen uit het kweekmedium op kleine, uniforme functionele kralen.  Deze kralen kunnen vervolgens onmiddellijk worden gebruikt in eenvoudige kralagomaggregatie-assays.

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Leer een geoptimaliseerd protocol voor het meten van ligand-receptorinteracties in trans met behulp van fluorescentiemicroscopie in HEK-293T-cellen. Deze methode kwantificeert eiwitadhesie-interacties relevant voor de neurobiologie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Meer video's verkennen