Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie
20 mei 2020
Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.
Deze Salmonella LAMP-methode is opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual van de FDA, zowel als screeningsmethode in dierlijk voedsel als bevestigingsmethode voor alle veronderstelde Salmonella-isolaties. De methode is snel, betrouwbaar en robuust. In vergelijking met PCR omvatten de belangrijkste voordelen snel testen, eenvoudige instrumentatie, een lage vals-negatieve frequentie en een flexibele workflow.
Snelle screeningsmethoden voor pathogenen zoals salmonella spelen een belangrijke rol bij het snel detecteren van een mogelijk besmet product en kunnen ziekten of uitbraken bij mensen en dieren voorkomen. Begin met het voorbereiden van DNA-sjablonen voor de LAMP-test. Er zijn twee soorten monsters die worden gebruikt om DNA-sjablonen te maken.
Om sjablonen voor te bereiden uit monsters van dierlijk voedsel, weeg aseptisch 25 gram voedselmonster in een steriele filterzak. Voeg 225 milliliter steriele gebufferde pepton-water toe aan de zak en incubeer deze gedurende 24 uur bij 35 graden Celsius. Na de incubatie, breng een milliliter van de gefilterde zijde van de zak over naar een microcentrifugebuisje.
Centrifugeer het buisje gedurende een minuut bij 900 keer G. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuw microcentrifugebuisje. Centrifugeer het monster gedurende twee minuten bij 16.000 keer G.
En om het supernatant weg te gooien, resuspendeer het pellet in 100 microliter van het monstervoorbereidingsreagens en verwarm het gedurende 10 minuten op 100 graden Celsius in een droogwarmteblok. Koel vervolgens het monster af tot kamertemperatuur en bewaar het op min 20 graden Celsius. Het tweede type monster voor deze LAMP-test komt rechtstreeks van veronderstelde salmonella-culturen.
Om DNA-sjablonen voor te bereiden, breng 500 microliter van een overnacht salmonella-kweek over naar een microcentrifugebuisje en verwarm het gedurende 10 minuten in een 100 graden Celsius warmteblok. Koel vervolgens het monster af tot kamertemperatuur en bewaar het op min 20 graden Celsius. Om kruisbesmetting te voorkomen, scheidt u fysiek de gebieden die worden gebruikt voor het bereiden van de LAMP Master Mix en het toevoegen van de DNA-sjablonen.
Reinig de werkoppervlakken met isopropanol en een DNA- en DNA-afbraakvloeistof. Reinig vervolgens de pipetten en buisjeshouders. Ontdooi de isotherme Master Mix, 10X Primer Mix, moleculair kwaliteitswater, positieve controle-DNA en DNA-sjablonen op kamertemperatuur.
Schakel het LAMP-instrument in en voer de relevante monsterinformatie in. Bereid de LAMP Master Mix volgens de manuscriptrichtlijnen voor, vortex en centrifugeer deze kort en verdeel 23 microliter van de Master Mix in elk putje van een buisjesstrip. Vortex alle DNA-sjablonen en centrifugeer ze kort.
Voeg vervolgens twee microliter DNA-sjabloon toe aan het juiste putje en sluit het putje goed af. Verwijder de buisjesstrip uit de houder en klap hem om ervoor te zorgen dat alle reagentia zich aan de onderkant van het buisje hebben verzameld. Laad de buisjesstrip in het LAMP-instrument en start de LAMP-run.
Tijdens de LAMP-reactie kunt u op de tabbladen Temperatuur, Amplificatie en Anneal tikken om de dynamische veranderingen van verschillende parameters tijdens de LAMP-run te zien. De LAMP-resultaten kunnen in realtime op het LAMP-instrumentpaneel worden bekeken of met behulp van LAMP-software. Om de resultaten op het instrumentpaneel te interpreteren, opent u de LAMP-run van belang.
Bekijk de vijf tabbladen die bij elke run horen. De profiel- en temperatuurtabbladen tonen geprogrammeerde en werkelijke temperaturen in de monsterputjes terwijl de LAMP-reactie verloopt. De Amplificatie- en Anneal-tabbladen tonen fluorescentiemetingen en veranderingen in fluorescentie tijdens respectievelijk de amplificatiefase en de anneal-fase.
Het resultatentabblad toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten die kunnen worden geïnterpreteerd volgens de manuscriptrichtlijnen. De tweede manier om LAMP-resultaten te bekijken is door de LAMP-software te gebruiken. Om de resultaten met de software te interpreteren, klikt u op het computerpictogram op het linkerpaneel en navigeert u naar de bestandslocatie om de LAMP-run van belang te laden.
Bekijk de zeven tabbladen die bij elke run horen. De profiel- en temperatuurtabbladen tonen geprogrammeerde en werkelijke temperaturen in de monsterputjes terwijl de LAMP-reactie verloopt. De amplificatie- en amplificatiesnelheidstabbladen tonen fluorescentiemetingen en veranderingen in fluorescentie tijdens de amplificatiefase.
De anneal- en anneal-afgeleide tabbladen tonen fluorescentiemetingen en veranderingen in fluorescentie tijdens de anneal-fase. Het resultatentabblad toont een tabelweergave van de LAMP-resultaten. Er zijn vier kolommen getiteld Grafieknaam, Putnummer, Putnaam en Piekwaarde.
De amplificatietijd en anneal-afgeleiden van alle acht monsters worden getoond. De resultaten kunnen worden geïnterpreteerd volgens de manuscriptrichtlijnen. Het LAMP-instrumentpaneel en LAMP-software kunnen worden gebruikt om de resultaten van de test weer te geven.
In deze LAMP-run zijn monsters S1 tot en met S6 vertienvoudige seriële verdunningsreeksen van Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741, variërend van 1,1 miljoen tot 11 kolonievormingseenheden per reactie. De positieve controle, of PC, is Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 bij 17.000 kolonievormingseenheden per reactie, en de controle zonder sjabloon, of NTC, is moleculair kwaliteitswater. De NTC-put heeft een lege Tmax en een anneal-temperatuur van ongeveer 81 graden Celsius op het LAMP-instrumentpaneel, en een lege Tmax en een lege anneal-temperatuur in de LAMP-software.
De positieve controleput heeft een Tmax van zeven minuten en 45 seconden en een anneal-temperatuur van ongeveer 90 graden Celsius op beide platforms. Monsters S1 tot en met S6 hebben een Tmax tussen zes minuten en dertig seconden en twaalf minuten en vijftien seconden, en een anneal-temperatuur van ongeveer 90 graden Celsius, wat allemaal een positieve detectie aangeeft. LAMP is zeer effectief en genereert een grote hoeveelheid DNA.
Daarom is het van crucia
Overzicht
Deze studie presenteert een gevalideerd loop-mediated isothermal amplification (LAMP) protocol voor de snelle detectie van Salmonella in dierlijk voedsel. De methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele PCR, waaronder snellere resultaten en verminderde vals-negatieve resultaten, waardoor het een betrouwbare tool is voor het identificeren van mogelijke besmetting.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Pathogend detectie
- Nucleïnezuur amplificatie
- Voedselveiligheid
Achtergrond
- Belang van snelle detectie van pathogenen in voedingsproducten
- Beschaving voor betrouwbare screeningsmethoden voor Salmonella
- Beperkingen van traditionele PCR-methoden
Gebruikte methoden
- Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
- Salmonella spp.
- Gebruik van specifieke DNA-voorbereidingsprotocollen
Belangrijkste resultaten
- Aangetoond de effectiviteit van LAMP voor Salmonella detectie
- Benadrukt de lage vals-negatieve rate van de methode
- Validatie door vergelijking tussen meerdere laboratoria
Conclusies
- De studie stelt LAMP vast als een haalbare methode voor het screenen en bevestigen van Salmonella in voedingsproducten.
- Het benadrukt het belang van snelle testen om de voedselveiligheid te verbeteren en gezondheidsrisico's te voorkomen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
