Name: Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer vasculaire casting van longvaten bij volwassen en postnatale muizen voor micro-CT-beeldvorming. Deze methode behoudt zacht weefsel en visualiseert het volledige vaatnetwerk voor morfologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede ondersteund door het NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). We willen de NIH Mouse Imaging Facility bedanken voor de begeleiding bij het verwerven en analyseren van afbeeldingen.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) van het National Heart Lung and Blood Institute.
1. Voorbereiding
<ol><li>Injecteer de muis intraperitoneally met heparine (1 eenheid /g muis lichaamsgewicht) en laat het ambulate voor 2 min.</li>
	<li>Euthanaseren het dier in een CO2-kamer.</li>
	<li>Schik de muis in een supine positie op een chirurgische raad en zet alle vier de ledematen op het bord met tape. Gebruik vergroting voor fijne dissectie.</li>
</ol>2. Bloot longen en luchtpijp
<ol><li>Spray de ventrale kant van de muis met 70% ethanol om haarinterferentie te minimaliseren.</li>
	<li>Pak de buikhuid met tangen en maak een kleine incisie met een schaar in de navelstreng. Schuif de uiteinden van de schaar in de fasciale laag tussen de buikspier en de huid en beginnen met het scheiden van de twee lagen. Werk rostrally, het verwijderen van de huid uit de buik, ribbenkast, en nek.</li>
	<li>Open het buikspierstelsel met een schaar en snijd zijwaarts aan beide zijden totdat het middenrif wordt blootgesteld.</li>
	<li>Pak het xiphoïde proces voorzichtig vast en til de ribbenkast iets op waardoor het zicht op de staartlongen door het dunne, semitransparante middenrif wordt gemaximaliseerd. Maak voorzichtig een kleine incisie in het middenrif net onder het xiphoidproces. De longen zullen instorten en zich terugtrekken uit het middenrif. Ontleden het middenrif uit de buurt van de ribbenkast, waarbij u ervoor zorgt dat de longen niet worden gejat.</li>
	<li>Zoek en verdring de inferieure vena cava (IVC) en slokdarm waar ze door het middenrif. Gebruik gaas om het samen te ruimen bloed in de borstholte, het vermijden van contact met de longen.</li>
	<li>Pak de xiphoid nog eens vast en til voorzichtig op. Snijd de ribbenkast bilateraal (ongeveer op de midaxillaire lijn) het vermijden van contact met de longen. Verwijder de voorste ribbenkast volledig, waardoor de uiteindelijke snede langs de achtersteven hoek net voor het manubrium.</li>
	<li>Met behulp van een voorgevulde spuit, royaal nat de longen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) om uitdroging te voorkomen. Zet deze routine gedurende de hele procedure voort.</li>
	<li>Met behulp van tangen, pak het manubrium en zachtjes verheffen uit de buurt van het lichaam. Snijd met een schaar 1-2 mm laterale naar het manubrium, doorsnijden van sleutelbeenderen en verwijder. Dit zal de thymus eronder blootleggen.</li>
	<li>Pak elke kwab van de thymus, trek uit elkaar en verwijder. Herhaal deze procedure met de submandibulaire klier. Verwijder ten slotte het spierweefsel dat de luchtpijp bedekt. OPMERKING: Na de dissectie moeten het hart, de oplopende aorta (AA), de longslagaderlijke romp (PAT) en de luchtpijp zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat de primaire arteriële takken uit de stam niet worden verdeeld of gewond.</li>
</ol>3. PA katheterisatie en bloedperfusie
<ol><li>Voor het monteren van unit 1, rijg 15 cm PE-10 buizen op de naaf van een 30 G naald en bevestig aan een 1 mL spuit voorgevuld met 10-4 M natrium nitroprusside (SNP) in PBS. Prime de slang door het bevorderen van de zuiger totdat alle lucht is gezuiverd uit deze eenheid ( figuur 1). LET OP: SNP is giftig bij inslikken. Vermijd contact met de huid en ogen. Was de huid grondig na behandeling. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.<ol>
<li>U ook unit 2 monteren. Voor muizen postnatale dag 7 (P7) en jonger, gebruik een hemostat om een extra 30 G naald los te maken van de naaf en schroef de naald op het open uiteinde van de slang van eenheid 1 (Figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>In plaats van een naald, gebruik gebogen scherpe tangen om een uiteinde van een 10 cm lengte van 7-0 zijde te grijpen. Penetreer de top van het hart binnen die van de ene kant en het passeren van de uiteinden van de tang door de spier en uit de andere kant. Pak de zijde met een andere set tangen en trek ongeveer een lengte van ongeveer 2 cm door en bind af. Neem het resterende 8 cm einde van de hechting, trekken het hart caudally, en tape het einde van de chirurgische raad. OPMERKING: Dit zal spanning creëren, waardoor de grote bloedvaten verder worden blootleggen en het hart op zijn plaats worden vastgebonden, waardoor de katheter gemakkelijker in de longslagader kan worden geplaatst.</li>
	<li>Haak de uiteinden van gebogen tang onder zowel de AA en PAT. Trek een 3 cm lengte van 7-0 zijde terug door de opening en maak een single-throw losse hechting.</li>
	<li>Met behulp van een schaar maak een 1-2 mm incisie in de richting van de top van het hart, penetreren de dunwandige rechter ventrikel (RV), om het inbrengen van de katheter (Unit 1). Controleer voorafgaand aan het inbrengen of er geen lucht in het systeem zit. Introduceer de geprimede slang in de rechter hartkamer en ga voorzichtig verder in de semitransparante dunwandige PAT.<ol>
<li>Controleer visueel of de katheter niet in de linker- of rechter longtak is gevorderd en niet op het vertakking van de longslagader komt. Met behulp van tape, zet het distale gedeelte van de slang aan de chirurgische raad. OPMERKING: Om de RV te identificeren, gebruik tangen om de rechterkant van het hart te knijpen. In tegenstelling tot de linker ventrikel, moet de relatief dunne vrije muur van de RV gemakkelijk worden begrepen.</li>
		<li>Voor muizen jonger dan P7 bevestigt u Unit 2 aan een micromanipulator en introduceert u het naaldeinde van het apparaat in de PAT zoals hierboven beschreven met behulp van de manipulator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Draai voorzichtig de losse hechting rond beide grote vaten aan en snijd de 8 cm lengte van de hechting die in stap 3.2 is gemaakt om het hart terug te brengen naar een natuurlijke rustpositie. De katheter is nu stevig vastgezet in de PAT.</li>
	<li>Klem de linker oorschelp van het hart om het systeem te laten doordringen.</li>
	<li>Beveilig de SNP-bevattende spuit (eenheid 1 of eenheid 2, grootteafhankelijk) in de spuitpomp en doorslis de oplossing met een snelheid van 0,05 mL/min om het bloed te spoelen en de vaatculatuur maximaal te verwijden. Bloed/perfusate zal verlaten via de afgeknipte oorschelp. Doorgaan perfusie totdat perfusate loopt duidelijk (~ 200 μL in een volwassen muis, minder voor jongere dieren). OPMERKING: Bij het doorsbrengen van de lage viscositeit PBS/SNP werd een relatief hogere infusiesnelheid gebruikt in het belang van tijdsbesparing. De meer viskeuze polymeer verbinding is toegediend in een langzamer tempo om te voorkomen dat overvulling, breuk, en maximaliseren van de controle over distale eindpunten.</li>
</ol>4. Tracheostomie en longinflatie
<ol><li>Bouw de longinflatie -eenheid (figuur 2).<ol>
<li>Sluit een flexibele plastic 24 G intraveneuze (IV) katheter (naald verwijderd) / vlinder infusie ingesteld op een stopcock, bevestigd aan een open 50 mL spuit (geen zuiger). Hang de spuit aan een ringstandaard.</li>
		<li>Voeg 10% gebufferd formaline toe aan de spuit. Open de stopcock, waardoor formaline in de slang en zuiveren alle lucht uit het systeem. Sluit de stopcock en hef de spuit tot de meniscus 20 cm boven de luchtpijp8ligt. LET OP: Formaline is ontvlambaar, kankerverwekkend, acuut giftig bij inname, en veroorzaakt huidirritatie, ernstig oogletsel, huidsensibilisatie en kiemcelmutagee. Vermijd inname en contact met huid en ogen. Vermijd inademing van de damp of mist. Blijf uit de buurt van ontstekingsbronnen. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats twee losse hechtingen inferieur aan het cricoïde kraakbeen 2-4 mm uit elkaar.</li>
	<li>Met behulp van een schaar, maak een kleine incisie in de cricothyroid ligament superieur aan de hechtingen.</li>
	<li>Steek de INTheter in de opening en ga verder dan de twee losse hechtingen.</li>
	<li>Draai de hechtingen rond de luchtpijp aan en open de stopcock. Laat de formaline in de longen door de zwaartekracht en wacht 5 minuten voor de longen volledig opblazen. Als de longen zich hechten aan de ribbenkast tijdens de inflatie, pak de buitenkant van de ribbenkast met botte fuitjes en bewegen in alle richtingen om te helpen bij het bevrijden van de lobben. Maak geen direct contact met de longen.</li>
	<li>Na 5 min, terug de IV katheter na de eerste hechting en ligate. Herhaal dit voor de tweede hechting. De longen zijn nu opgeblazen in een gesloten, onder druk staat.</li>
</ol>5. Gieten van de vasculatuur
<ol><li>Bereid in een buis van 1,5 mL 1 mL van een 8:1:1-oplossing8 van polymeer:verdunningsmiddel:uithardingsmiddel en draai het meerdere keren voorzichtig om om een goede menging te garanderen.</li>
	<li>Haal de zuiger uit een spuit van 1 cc, bedek het tegenovergestelde uiteinde met een gehandschoende vinger en giet de polymeerverbinding in de spuit. Plaats de zuiger voorzichtig opnieuw, omkeert en ga de zuiger vooruit om alle lucht te verwijderen en een meniscus te vormen op het puntje van de spuit.</li>
	<li>Verwijder de SNP/PBS spuit uit de naaf van de naald en druppel extra PBS in de naaf om een meniscus te maken. Controleer de hub zorgvuldig op gevangen lucht, verjagen indien nodig, en hervorm de meniscus. Sluit de hub aan bij de spuit gevuld met de polymeerverbinding. OPMERKING: Het maken van een meniscus aan beide uiteinden vermindert de kans dat lucht in het systeem komt aanzienlijk.</li>
	<li>Bevestig de met polymeersamenstelling gevulde spuit aan de spuitpomp en beslever op 0,02 mL/min. OPMERKING: Voor kleinere longen kan een langzamer tarief nuttig zijn om overvulling te voorkomen, maar het is niet essentieel.</li>
	<li>Controleer de verbinding als het vrij beweegt de PE-slang en let op de spuit volume als het gaat om de PAT. Blijven vullen totdat alle lobben volledig zijn gevuld tot aan het capillaire niveau en stop de spuitpomp. Controleer het spuitvolume nog eens. OPMERKING: Na verschillende runs kan een geschat volume worden gebruikt om een bij benadering eindpunt te meten (~35 μL voor een volwassen muis en ~ 5 μL voor een P1-pup). Nadat de pomp is gestopt, blijft de restdruk in het systeem de polymeerverbinding in de longslagaders duwen. Alle longlobben moeten in een vergelijkbaar tempo worden gevuld.</li>
	<li>Bedek de longen met een glasvezel reinigingsdoek, royaal toe te passen PBS, en laat het karkas te zitten ongestoord voor 30-40 min op kamertemperatuur. Tijdens deze periode zal de polymeerverbinding genezen en uitharden.</li>
	<li>Verwijder de katheter, verbreed de armen/onderste helft van de muis en plaats het hoofd/thorax in een conische conische 50 mL gevuld met 10% gebufferde formaline 's nachts.</li>
	<li>Na fixatie, pak de luchtpijp en voorzichtig scheiden van het hart / long eenheid van de resterende ribbenkast en thorax. Plaats het hart/longblok in een formaline gevulde scintillatie flacon. Gooi de rest weg.</li>
</ol>6. Alternatieve vaatbedden voor het gieten (tabel 1)
OPMERKING: Elk doel vasculaire bed kan vereisen verschillende katheter plaatsingen, infusie tarieven, en optimale vultijden. Zo zullen meerdere dieren nodig zijn om meerdere organen te werpen.
<ol><li>Voor systemische vaatbedden superieur of inferieur aan het middenrif volg stappen 1.1-2.5 zoals hierboven. Zie aanvullende notities over het portaalsysteem en het middenrif(tabel 1).</li>
	<li>Pak het xiphoïde proces met een hemostat en snijd de ribbenkast bilateraal (ongeveer in de midaxillaire lijn) net voor de interne thoracale slagaders.</li>
	<li>Vouw de nog verbonden ribbenkast over zodanig dat het rust op de nek van het dier / hoofd, volledig bloot de borstholte.</li>
	<li>Volg stap 3.1 hierboven en verwijder vervolgens de longen. Zodra de thoracale aorta (TA) zichtbaar is, haak de uiteinden van gebogen tangen eronder, ~ 10 mm superieur aan het middenrif. Pak een lengte van 3 cm van 7-0 zijde, trek terug door de opening onder de TA, en maak een single-throw losse hechting. Herhaal deze procedure ~ 8 mm boven het middenrif.</li>
	<li>Voor structuren die superieur zijn aan het middenrif, gebruik de veerschaar om een klein gaatje (~ 30% van de totale omtrek) te maken op het ventrale gedeelte van de TA, ~ 2 mm inferieur aan de losse hechtingen geplaatst in stap 6.4.<ol>
<li>Voor structuren inferieur aan het middenrif, in plaats daarvan, maak een klein gat ~ 2 mm superieur aan de losse hechtingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng afhankelijk van de grootte van het dier eenheid 1 of 2 in het vat, ga verder dan losse hechtingen en ligate het vat voorzichtig.</li>
	<li>Volg stap 3.7, stel de spuitpomp in op een snelheid van 1,0 mL/min en perfusing een minimum van 5 mL. Perfusate zal verlaten via het IVC.</li>
	<li>Volg de stappen 5.1 - 5.4 waarbij de infusiesnelheid wordt aangepast aan 0,05 mL/min, waarbij het doelweefsel visueel wordt gecontroleerd in real-time. LET OP: Het infusievolume is orgaan- en dierleeftijdsspecifiek. Het volume kan verder worden beperkt door het ligateren van arteriële takken die leiden tot niet-doel vasculaire bedden (dat wil zeggen, hersenen, lever, nier, darm).</li>
	<li>Volg 5.6 verwijder vervolgens doelweefsel en plaats in formaline.</li>
</ol>7. Monster mount, scan, en reconstructie voor micro-CT
<ol><li>Met behulp van paraffine film, maak een vlakke ondergrond op het scanbed en het centrum van de natte monster op dit oppervlak (Figuur 3A). OPMERKING: Als bewegingsartefact wordt gedetecteerd, moet het monster mogelijk verder stabiliseren.</li>
	<li>Licht tent/dekselmonster met extra paraffinefilm om uitdroging te voorkomen. Zorg er met speciale zorg voor dat u de paraffinefilm niet op het monster laat rusten en het weefsel vervormt(figuur 3B).</li>
	<li>Scan het voorbeeld met behulp van de in tabel 2 beschreven instellingen en standaardiseer deze parameters binnen een bepaald experiment. OPMERKING: Dit is afhankelijk van het experiment/eindpunt. Standaardiseer de gekozen parameters voor het gemak van vergelijking tussen monsters.</li>
	<li>Breng de gereconstrueerde scans over voor nabewerking en analyse.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Deze methode wordt goed uitgevoerd en levert opvallende beelden op van longslagadernetwerken, waardoor vergelijking en experimenten in knaagdiermodellen mogelijk zijn. Verschillende kritische stappen onderweg zorgen voor succes. Eerst moeten onderzoekers het dier in de voorbereidende fase inbrengen om te voorkomen dat bloedstolsels zich vormen in de longvaatculatuur en kamers van het hart. Dit zorgt voor de volledige arteriële doorvoer van polymeer verbinding. Ten tweede, bij het doorboren van het middenrif en het verwij...

De focus van deze techniek is de visualisatie van longslagaderarchitectuur met behulp van een polymeer-gebaseerde verbinding in muizen. Terwijl uitgebreid werk is uitgevoerd op systemische vasculaire bedden zoals hersenen, hart, en nier1,,2,,3,,4,5, minder informatie beschikbaar is over de voorbereiding en vulling van het longslagadernetwerk. Het doel van deze studie is dan ook om uit te breiden naar eerder werk6,7,8 en een gedetailleerde schriftelijke en visuele referentie te geven die onderzoekers gemakkelijk kunnen volgen om beelden met hoge resolutie van de longslagaderboom te produceren.
Hoewel er tal van methoden bestaan voor etikettering en beeldvorming van de longvaatculatuur, zoals magnetische resonantiebeeldvorming, echocardiografie of CT-angiografie9,10, slagen veel van deze modaliteiten er niet in om de kleine vaten adequaat te vullen en/of vast te leggen, waardoor de reikwijdte van wat kan worden bestudeerd wordt beperkt. Methoden zoals seriële secties en reconstructie bieden een hoge resolutie, maar zijn tijd/arbeidsintensief11,12,13. De omliggende integriteit van weke delen wordt aangetast bij traditionele corrosieafgieten10,13,14,15,16. Zelfs dierlijke leeftijd en grootte worden factoren bij een poging om een katheter in te voeren of, de resolutie ontbreekt. De polymeerinjectietechniek daarentegen vult slagaders tot het capillaire niveau en zorgt in combinatie met μCT voor een ongeëvenaarde resolutie5. Monsters uit muizenlongen zo jong als postnatale dag 14 zijn met succes gegoten8 en verwerkt in een kwestie van uren. Deze kunnen voor onbepaalde tijd opnieuw worden gescand, of zelfs verzonden voor histologische voorbereiding / elektronenmicroscopie (EM) zonder afbreuk te doen aan het bestaande zachte weefsel17. De belangrijkste beperkingen van deze methode zijn de upfront kosten van CT-apparatuur / software, uitdagingen met nauwkeurige monitoring intravasculaire druk, en het onvermogen om gegevens te verwerven in de lengterichting in hetzelfde dier.
Dit papier bouwt voort op bestaand werk om de longslagader injectietechniek verder te optimaliseren en leeftijd/grootte gerelateerde grenzen te verleggen naar postnatale dag 1 (P1) om opvallende resultaten op te leveren. Het is vooral handig voor teams die arteriële vasculaire netwerken willen bestuderen. Daarom bieden we nieuwe richtlijnen voor katheterplaatsing/stabilisatie, meer controle over de vulsnelheid/-volume en wijzen we op opmerkelijke valkuilen voor meer castingsucces. Resulterende afgietsjts kan vervolgens worden gebruikt voor toekomstige karakterisering en morfologische analyse. Misschien nog belangrijker, dit is de eerste visuele demonstratie, voor zover wij weten, dat de gebruiker door deze ingewikkelde procedure leidt.

<table><tbody><tr><td>1cc-spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>20ml glazen scintillatie-buisjes</td><td>Fisher</td><td>03-340-25P</td><td></td></tr><tr><td>30G-naald</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>50mL kegelvormige buizen</td><td>Cornin</td><td>352098</td><td>Voor monsters opslag en scannen</td></tr><tr><td>60cc-spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>7-0 zijden hechtdraad</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 12.0 Software</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>Primaire software</td></tr><tr><td>Amira 6.7 Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>Alternatieve software</td></tr><tr><td>CeramaCut-schaar 9cm</td><td>Fine Science tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Keramisch gecoate gebogen pincet</td><td>Fine Science tools</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>CO2-tank</td><td>Robert's Oxygen Co.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dubbele spuitpomp</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-74900-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Mini-pincet</td><td>Fine Science tools</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Formaline</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Covidien</td><td>441215</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparine (1000USP-eenheden/ml)</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Horos Software</td><td>Horos Project</td><td>N/A</td><td>Alternatieve software</td></tr><tr><td>inductiekamer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>vezel optisch reinigingsdoekje</td></tr><tr><td>Labeling Tape</td><td>Fisher</td><td>15966</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische basis</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT systeem</td><td>PerkinElmer</td><td>Quantum GX</td><td></td></tr><tr><td>Microfil (Polymeerverbinding)</td><td>Flowech Inc.</td><td>Kit B - MV-122</td><td>8 oz. MV-verbinding; 8 oz. verdunningsmiddel; MV-uithardingsmiddel</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Stoelting</td><td>56131</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 1/2 ml insuline-spuit</td><td>Covidien</td><td>1188528012</td><td></td></tr><tr><td>Octagon pincet met rechte tanden</td><td>Fine Science tools</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis company, Inc.</td><td>#PM999</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 buis</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>BioRad</td><td>#161-0780</td><td></td></tr><tr><td>Ringstandaard</td><td>Fisher</td><td>S13747</td><td>Hoogte 24 inch.</td></tr><tr><td>Natriumnitroprusside</td><td>sigma</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Stalen plaat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>16 x 16 inch oppervlakte, 1/16 inch dik</td></tr><tr><td>Rechte veerschaar</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>SURFLO 24G Teflon I.V. katheter</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>360103</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch bord</td><td>Fisher</td><td>12-587-20</td><td>Dit is een omgebouwde dia-houder</td></tr><tr><td>Universele 3-poots klem</td><td>Fisher</td><td>S24280</td><td></td></tr><tr><td>Vleugelige inf. Set 25X3/4, 12' Slang</td><td>Nipro</td><td>PR25G19</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi-508 Dissectie Scope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-ct-beeldvorming

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Bloedvaten vormen ingewikkelde netwerken in de 3-dimensionale ruimte. Daarom is het moeilijk om visueel te begrijpen hoe vasculaire netwerken interageren en zich gedragen door het observeren van het oppervlak van een weefsel. Deze methode biedt een middel om de complexe 3-dimensionale vasculaire architectuur van de long te visualiseren.
Om dit te bereiken, wordt een katheter in gebracht in de longslagader en de vasculatuur wordt tegelijkertijd gespoeld van bloed en chemisch verwijd om weerstand te beperken. Longen worden vervolgens opgeblazen door de luchtpijp bij een standaard druk en het polymeer verbinding wordt toegediend in het vasculaire bed met een standaard stroomsnelheid. Zodra het volledige arteriële netwerk is gevuld en mag genezen, kan de longvaatculatuur direct worden gevisualiseerd of op een micro-CT -scanner (μCT) worden afgebeeld.
Wanneer met succes uitgevoerd, kan men waarderen de longslagader netwerk in muizen, variërend van vroege postnatale leeftijden tot volwassenen. Bovendien, terwijl aangetoond in het longslagaderlijk bed, kan deze methode worden toegepast op elk vaatbed met geoptimaliseerde katheter plaatsing en eindpunten.

Een succesvolle cast zal vertonen uniforme vulling van het gehele longslagadernetwerk. We tonen dit aan in C57Bl/6J muizen variërend in leeftijd: Postnatale dag P90 (Figuur 4A),P30 (Figuur 4B), P7 (Figuur 4C), en P1 (Figuur 4D). Door de snelheid van de stroom te regelen en de vulling in real-time visueel te monitoren, werden betrouwbare eindpunten van de meest desalische...

Het doel van deze techniek is ex vivo visualisatie van longslagaderlijke netwerken van vroege postnatale en volwassen muizen door middel van longinflatie en injectie van een radio-ondoorzichtige polymeer-gebaseerde verbinding via de longslagader. Mogelijke toepassingen voor gegoten weefsels worden ook besproken.

Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dit protocol geeft nauwkeurige, stapsgewijze richtlijnen voor het gieten van de longslagader vasculatuur in zowel volwassen als vroege postnatale muizen. Deze techniek stelt gebruikers in staat om het hele vasculaire netwerk volledig te casten voor visualisatie door een verscheidenheid aan methoden, waaronder micro-CT, met behoud van de integriteit van weke delen. Deze techniek is vooral handig voor het kijken naar long-vasculaire morfologie en architectuur, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor de targeting van andere vasculaire bedden.Net als veel operaties en dissecties, er is geen substituut voor het daadwerkelijk visualiseren van een procedure, en kijkers kunnen profiteren van het zien van een aantal van de meer uitdagende manoeuvres worden uitgevoerd. Zodra het xiphoid proces is blootgesteld, voorzichtig grijpen en verheffen van de ribbenkast. Maak voorzichtig een incisie in het nu blootgestelde, semi-transparante middenrif.De longen zullen zichtbaar instorten, en terugtrekken uit de buurt van het middenrif. Na het blootstellen van de long en luchtpijp, draad 15 centimeter PE10 buizen op de naaf van een 30-gauge naald. En bevestig dit apparaat aan een spuit van 1 milliliter, met 10 aan de 4 molaire natrium nitroprusside, in PBS.Ga de zuiger naar de slang prime totdat alle van de lucht is gezuiverd. Als een effectief alternatief voor de tekst, penetreren de top van het hart aan de ene kant, en passeer de uiteinden van gebogen tangen door de spier, en de andere kant van het weefsel. Pak het ene uiteinde van een lengte van 10 centimeter van 7-0 zijde en trek ongeveer twee centimeter door het weefsel.Na het afbinden van de hechting, gebruik de resterende acht centimeter hechting om het hart caudally te trekken. En plak het einde van de hechting aan de chirurgische raad. Haak de uiteinden van gebogen tang onder zowel de opgaande aorta en longslagader stam.En trek een lengte van drie centimeter van 7-0 zijde terug door de opening om een single-throw losse hechting te creëren. Gebruik een schaar om een een-tot-twee-millimeter incisie te maken naar de top van het hart, het penetreren van de dunwandige rechter ventrikel. En introduceer de geprimede slang in de rechter ventrikel, voorzichtig het bevorderen van de katheter in de semi-transparante, dunwandige longslagader stam.Controleer visueel of de katheter niet in de linker- of rechter longtak is gevorderd en niet op het punt van de longslagadertak. Tape het distale gedeelte van de slang aan de chirurgische raad, en draai voorzichtig de losse hechting rond beide grote schepen. Snijd de acht centimeter stuk hechting om het hart terug te keren naar een natuurlijke rustpositie.En knip het linker orakel van het hart om het perfusaat in staat te stellen de vasculatuur te verlaten. Gebruik vervolgens een spuitpomp om de natrium nitroprusside in te spuiten met een stroomsnelheid van 0,5 ml/min om zowel het bloed te spoelen als de vaatculatuur maximaal te verwijden, totdat het perfusaat helder is. Om de longinflatie-eenheid te construeren, snijdt u de flexibele plastic 24-gauge intraveneuze katheter uit een bad en sluit u aan op de naald van een vlinderinfusieset.Bevestig dit apparaat aan de stopcock, en bevestig de stopcock aan een open 50-milliliter spuit. Na het laden van de spuit met formaline en priming de katheter, met de stopcock gesloten, plaats de spuit in een ring staan, tot het punt waarop de meniscus is 20 centimeter boven de luchtpijp. Plaats twee losse hechtingen, twee tot vier millimeter uit elkaar, inferieur aan het kraakbeen van cricoïde, en gebruik een schaar om een kleine incisie te maken in de cricothyroid ligament, superieur aan de hechtingen.Steek de katheter in de opening en zet de punt voorbij de twee losse hechtingen. Draai de hechtingen rond de luchtpijp aan en open de stopcock om de formaline door de zwaartekracht in de longen te laten komen. Wacht vijf minuten tot de longen volledig opblazen.Als de longen zich hechten aan de ribbenkast tijdens de inflatie, gebruik bot-getipt tangen om de buitenkant van de ribbenkast te grijpen, en beweeg de ribben in alle richtingen om te helpen bij het bevrijden van de lobben zonder direct contact met de longen. Trek na vijf minuten de katheter achter de eerste hechting en ligate in. Trek vervolgens de katheter achter de tweede hechting en ligate in.De longen moeten nu worden opgeblazen in een gesloten, onder druk staat. Om de vasculatuur te werpen, laadt u een milliliter van een 8-1-1-oplossing van polymeerverwijdend middel in een spuit van één milliliter. En steek voorzichtig de zuiger in.Met de spuit omgekeerd, druk de zuiger om de lucht te verwijderen, en om de vorming van een meniscus op het puntje van de spuit mogelijk te maken. Verwijder de natrium nitroprusside spuit uit de naaf van de naald, en druppel toevoeging PBS in de hub, om een meniscus te creëren. Sluit de polymeersamenstellingspuit aan bij de naaf en start de infusie op 0,02 millimeter per minuut.Controleer de verbinding als het beweegt vrij door de slang, wijzend op de spuit volume als het in de longslagader stam. Ga door met de overvloed totdat alle lobben volledig zijn gevuld, tot in het kleinste vat. Stop de pomp, en nogmaals, let nogmaals op de spuit volume.Bedek de longen met een glasvezel reinigingsdoek, en royaal van toepassing PBS. Laat het monster 30 tot 40 minuten ongestoord zitten bij kamertemperatuur. Zodra het polymeer verbinding is genezen en gehard, verbreken de ledematen en de onderste helft van de muis.En plaats het hoofd en de thorax in een 50-milliliter conische gevulde 10% gebufferde formaline, 's nachts. De volgende ochtend, pak de luchtpijp om voorzichtig te scheiden van het hart en de longen eenheid van de resterende ribbenkast en thorax. Plaats het geoogste weefselblok in een met formalin gevulde scintillatieblad.Een succesvolle cast zal resulteren in een uniforme vulling van het gehele longslagadernetwerk. Als er schade is aan de long- of long airways, zullen kleine lekken voorkomen dat de longen druk vasthouden. Fragmentarisch of onvolledig vullen kan ontstaan uit een luchtsluis als gevolg van lucht wordt geïntroduceerd in het vasculaire systeem via de katheter, blokkeren stroomafwaartse stroom van de verbinding.Ondervulling treedt op wanneer er te weinig verbinding in de vasculatuur wordt gebracht. Als alternatief kan overvulling, of de invoering van te veel polymeer verbinding te snel, kan leiden tot arteriële breuk, of, meer in het algemeen, veneuze doorvoer. Het bevorderen van de katheter te ver naar beneden de longstam kan leiden tot de tip te wig in een longslagader tak, het creëren van een onbalans in de stroom, en waardoor de ene kant sneller te vullen dan de andere.Zorgvuldige prestaties van de techniek zoals aangetoond, met behulp van de juiste directe monitoring van distale vasculatuur eindpunten, en standaard infusie tarieven kunnen resulteren in een optimale vulling van longva vasculatuur. Bovendien kan het aanpassen van deze techniek aan de systemische vasculatuur even gunstige resultaten opleveren in andere vaatbedden. Na het gieten kunnen monsters worden verwerkt voor het scannen van micro-computertomografie.Voor nabewerking kan een commercieel softwarepakket worden gebruikt om een 3D-volumeweergave van de long-vasculaire boom te genereren. Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, vooral voorzichtig zijn rond de fragiele longen, en de longslagader. Belangrijker nog, vermijd de invoering van lucht in het vasculaire circuit.Na een succesvolle cast kan een monster worden gescand door micro-CT, en vragen met betrekking tot vasculaire morfometrie en architectuur kunnen worden onderzocht.

vascular-casting-adult-early-postnatal-mouse-lungs-for-micro-ct

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Contrast verbeterde kleine dier schip beeldvorming door microCT is een snelle, rendabele en high-throughput techniek voor...

Contrast Enhanced Imaging Schip met behulp van microCT

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

In dit artikel presenteren we een eenvoudige, praktische techniek voor cerebrovasculaire gieten, dat is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt om het imago van de vasculaire boom van de volwassen hersenen van muizen.

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

We presenteren een protocol om de snelheid van alveolaire vochtopruiming of longoedeem in de long van neonatale muizen te beoordelen met behulp van röntgenbeeldvormingstechnologie.

Real-time X-ray Imaging van Lung Fluid Volumes in Neonatale Mouse Lung

We beschrijven een methode voor de detectie van tumorknobbelontwikkeling in de longen van een adenocarcinoom muismodel met behulp van micro-computertomografie en het gebruik ervan voor het monitoren van veranderingen in knobbelgrootte over tijd en als reactie op behandeling. De nauwkeurigheid van de beoordeling werd bevestigd met histologische kwantificering aan het eindpunt.

Met behulp van micro-computertomografie voor de evaluatie van de ontwikkeling van tumoren en follow-up van de respons op de behandeling in een muismodel van longkanker

Beschrijven we een niet-invasieve multimodale aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordelingvan de muismodel van lung fibrosis geïnduceerd door dubbele intratracheale instillatietest van bleomycine imaging.

Een multimodale Imaging aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordeling van bleomycine-geïnduceerde Lung Fibrosis in muizen

Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.

Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Dubbelharsgieten micro-computertomografie, of DUCT, maakt visualisatie, digitalisering en segmentatie van twee buisvormige systemen tegelijkertijd mogelijk om 3D-analyse van orgelarchitectuur te vergemakkelijken. DUCT combineert ex vivo injectie van twee radiopaqueharsen gevolgd door micro-computertomografiescanning en segmentatie van de tomografische gegevens.

DUCT: Double Resin Casting gevolgd door Micro-Computed Tomography voor 3D Leveranalyse

Hier presenteren we een protocol om micro-computertomografie (micro-CT) te gebruiken om geventileerde gebieden te kwantificeren in een unilateraal bleomycine-geïnduceerd longfibrosemodel via intratracheale instillatie aan de laesiezijde.

Unilaterale longvolumeanalyse met behulp van micro-CT voor verbeterde beoordeling van longfibrose in preklinische modellen

Leer vasculaire casting van longvaten bij volwassen en postnatale muizen voor micro-CT-beeldvorming. Deze methode behoudt zacht weefsel en visualiseert het volledige vaatnetwerk voor morfologisch onderzoek.

Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Meer video's verkennen