Eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie van Caenorhabditis elegans

Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor monsterverzameling, extractvoorbereiding en immunoprecipitatie voor de bevestiging van een succesvolle eiwitpull-down en de detectie van co-immunoprecipiteerde eiwitten van belang. De voorbereiding van het eiwitextract kan worden uitgevoerd voor maximaal 24 monsters en is compatibel met een aantal downstream-toepassingen, inclusief immunoprecipitatie en RNA pull-down-experimenten. Deze methode kan worden aangepast om het testen van interacties tussen twee of meer endogene, endogenelijk gelabelde of overgeëxprimeerde C.elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden te vergemakkelijken.

Visuele demonstratie van dit protocol is bedoeld om onderzoekers vertrouwd te maken met eiwitextractvoorbereiding en immunoprecipitatie, en hopelijk aan te moedigen dat degenen die nieuw zijn in de technieken deze in hun onderzoek gebruiken. Om een wormmonster te verzamelen, zaai eerst gemengde stadia of gesynchroniseerde wormen op solide nematodengroeimediumplaten bij de vereiste temperatuur en laat de wormen groeien tot het gewenste stadium. Aan het einde van de incubatie, gebruik M9-buffer om de wormen in een 15 milliliter conische buis te wassen en pellet de wormen door centrifugatie.

Aan het einde van de centrifugatie, verwijder het supernatant en was de wormen nog drie tot vijf keer in verse M9-buffer per wasbeurt. Wanneer het supernatant niet langer troebel is, voer een laatste wassing uit met dubbel gedistilleerd water en breng het losse wormpellet over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Pellet de wormen met een extra centrifugatie en gooi het resterende supernatant weg om een gepakt wormpellet te verkrijgen.

Om extract van het verzamelde wormpellet te bereiden, voeg een gelijk volume ijskoud 2X lysisbuffer toe aan een aanbevolen 300 microliter volume pellet en meng de resulterende suspensie krachtig. Draai het monster naar beneden om de mix op de bodem van de buis te verzamelen en breng de inhoud van de buis over in een 1,5 milliliter RNAse-vrije buis met metalen kralen. Na het goed afdichten van de buis, plaats het monster in een kralenmolenhomogenisator bij vier graden Celsius en zorg ervoor dat het monster in balans is in de homogenisator.

Homogeniseer het monster op de hoogste snelheid gedurende vier minuten voordat u het monster overbrengt naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis zonder kralen. Draai het monster naar beneden om het eiwitextract te verduidelijken en breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis op ijs zonder het witte troebele precipitaat aan de bovenkant van het monster over te brengen. Bewaar 10 microliter van het verdunde extract om de totale eiwitconcentratie te bepalen volgens standaardprotocollen en verdun het monster onmiddellijk tot vijf of 10 milligram eiwit per milliliter ijskoud 1X lysisbuffer op ijs.

Voor immunoprecipitatie van het eiwit van belang, hersuspenseer eerst de magnetische kralen door omkering en breng 150 microliter van de 50X kralensuspensie over in een 1,5 milliliter buis. Magnetiseer de kralen op ijs tegen een magnetisch statief gedurende ongeveer een minuut. Wanneer de oplossing helder is, gooi het supernatant weg.

Verwijder de buis van het magnetisch statief en was de kralen met drie 300 microliter volumes 1X lysisbuffer. Na de laatste wassing, hersuspenseer de kralen in 150 microliter ijskoude lysisbuffer en breng 75 microliter van de kralenslurry over naar twee milligram van het eiwitextractmonster. Na een uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie, plaats de monsterbuis gedurende ongeveer een minuut in de magneet op ijs.

Wanneer de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is, breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis zonder de kralen te verstoren. Bewaar 10% van het monster voor Western blot-analyse en voeg 20 microgram affiniteit gezuiverd antilichaam toe aan het vooraf opgeruimde lysaat voor een uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Aan het einde van de incubatie, voeg de resterende 75 microliter voorgewassen kralensuspensie toe aan het antilichaamlysaatmengsel voor een extra uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie.

Aan het einde van de incubatie, plaats het monster gedurende ongeveer een minuut terug op de magneet. Wanneer de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is, was de kralen met het immunoprecipitaat drie keer in 450 microliter wasbuffer op ijs. Na de laatste wassing, hersuspenseer het kralenpellet in 20 microliter 2X SDS bèta-mercaptoethanol eiwitgel-laadbuffer en kook het monster gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.

Voor detectie van de immunoprecipiteerde eiwitten door Western blot-analyse, laad het gedenatureerde eiwitmonster op een SDS-PAGE-gel zonder de kralen over te brengen en voer Western blot-analyse uit volgens standaardprotocollen met behulp van de juiste antilichamen voor de eiwitten van belang, en detecteer vervolgens de banden met behulp van chemiluminescentie op basis van paardenradenperoxidase. Het gedemonstreerde kralenmolenhomogenisatieprotocol is vergelijkbaar in totale eiwitextractie met dounce-gebaseerde methoden voor de efficiënte extractie van nucleaire en cytoplasmatische eiwitten. In deze analyse werd vastgesteld dat Argonaute-eiwitten interageren met leden van de GW182-eiwitfamilie die microRNA-geïnduceerde silencingcomplexen vormen die zich binden aan de doel-messenger RNA's en hun expressie onderdrukken.

De gedemonstreerde extract- en immunoprecipitatieprotocollen kunnen ook worden gebruikt om ALG-1 en HRPK-1 specifieke co-immunoprecipitaten succesvol te herstellen. Bovendien onthulde het testen van de ALG-1:AIN-1 interactie in verschillende genetische achtergronden dat HRPK-1 niet noodzakelijk is voor de ALG-1:AIN-1 microRNA-geïnduceerde silencingcomplexassemblage. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat eiwitextractie en de immunoprecipitatie worden uitgevoerd bij vier graden Celsius of op ijs om de stabiliteit van de monsters te behouden.

Deze totale eiwitextractvoorbereiding is compatibel met eiwitimmunoprecipitatie en microRNA pull-down-experimenten met behulp van een microRNA complementair oligonucleotide en vergemakkelijkt de downstream-verzameling van zowel eiwit- als RNA-componenten.