Name: Eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie van Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie voor het bestuderen van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans. Deze methode ondersteunt hoogdoorvoeranalyse en is compatibel met diverse downstream toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Kansas INBRE, P20GM103418 aan Li en Zinovyeva en R35GM124828 aan Zinovyeva. We danken Min Han voor het royaal delen van het anti-AIN-1 antilichaam. Sommige van de stammen die in de loop van dit werk werden gebruikt, werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Wormmonsterverzameling
<ol><li>Zaad gemengd stadium ofgesynchroniseerd 13 wormen op NGM vaste platen op de vereiste temperatuur en laat de wormen groeien tot de gewenste fase. Voor basisgroei en onderhoud van C. elegans, zie Stiernagle et al. en Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Verzamel wormen in een conische centrifugebuis van 15 ml door de wormplaten te wassen met een M9-buffer.</li>
	<li>Pellet de wormen door 400 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten te centrifugeren en gooi het supernatant weg. OPMERKING: De grootte van de wormkorrel voor de bereiding van extracten ligt tussen 100 μL en 500 μL. Een pellet van 300 μL verpakte wormen wordt aanbevolen voor downstream immunoprecipitatie-experimenten en levert meestal ~ 4,5 mg totaal eiwit op, terwijl een pellet van 500 μL ~ 7,5 mg totaal eiwit oplevert.</li>
	<li>Voer extra 3-5 wasbeurten uit met M9-buffer (zie tabel 1)of totdat het supernatant niet langer troebel is.</li>
	<li>Voer nog een laatste wasbeurt uit met ddH2O.</li>
	<li>Verplaats de losse wormkorrel naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en draai gedurende 2 minuten bij RT bij 400 x g naar beneden. Gooi het resterende supernatant weg om een verpakte wormkorrel te verkrijgen en ga verder met het extraheren van de bereiding. OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Wormkorrels kunnen onmiddellijk in vloeibare stikstof worden ingevroren en bij -80 °C of in vloeibare stikstof worden opgeslagen. Houd er rekening mee dat wormkorrels slechts één keer kunnen worden ontdooid en niet kunnen worden gerevrozen.</li>
</ol>2. Extractpreparaat van de wormkorrel
OPMERKING: Het extractpreparaat moet op ijs of bij 4 °C worden uitgevoerd.
<ol><li>Indien bevroren, ontdooi wormkorrel op ijs. OPMERKING: Als de gewenste verpakte wormkorrelgrootte van 300 μL niet is verkregen tijdens het verzamelen van de monsters, kunnen meerdere kleinere pellets worden gecombineerd totdat er voldoende materiaal aanwezig is voor verdere extractie.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume ijskoude 2x lysisbuffer toe (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumchloride, 0,1% Triton X, 4 mM magnesiumchloride, 10% glycerol, 2 mM DTT met RNase-remmer, proteaseremmer en fosfataseremmers; zie tabel 1) en vortex of pipet op en neer om te mengen. Draai de buis(en) naar beneden om het mengsel aan de onderkant van de buis te verzamelen.</li>
	<li>Verplaats het mengsel in een RNase-vrije buis van 1,5 ml met metalen kralen (zie tabel met materialen)en plaats het monster in de homogenisator van de kraalmolen (zie tabel met materialen)bij 4 °C. Zorg ervoor dat de buisdoppen zijn vastgedraaid en dat de monsters in evenwicht zijn in de homogenisator.</li>
	<li>Homogeniseer het monster op de hoogste snelheid (instelling 12) gedurende 4 minuten.</li>
	<li>Verwijder het monster van de kralen en plaats het in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Als alternatief kan een magneet met de homogenisator worden gebruikt om de kralen uit het monster te verwijderen.</li>
	<li>Draai het extract bij 19.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het eiwitextract te verduidelijken.</li>
	<li>Breng het supernatant over in een verse buis van 1,5 ml op ijs, terwijl de overdracht van het witte, troebele neerslag dat zich bovenop het monster vormt, wordt vermeden. De supernatant is nu het geklaarde extract. OPMERKING: Bewaar 10 μL van het geklaarde extract om de totale eiwitconcentratie te bepalen.</li>
	<li>Gebruik het extract onmiddellijk voor de volgende experimenten of vries het extract in vloeibare stikstof in en bewaar het bij -80 °C. OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Extracten kunnen worden bewaard bij ultralage temperatuur (-80 °C vriezer of vloeibare stikstof gedurende ~ 6 maanden). Bevroren extracten kunnen eenmaal ontdooid worden en kunnen niet worden gerevrozen.</li>
	<li>Bepaal de totale eiwitconcentratie van het extract met behulp van een eiwitconcentratietestkit die compatibel is met detergentia (zie tabel met materialen)volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>3. Immunoprecipitatie
OPMERKING: Alle immunoprecipitatiestappen voor extractvoorbereiding moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 °C. Het wordt aanbevolen om 2 mg totaal eiwit te gebruiken voor elke immunoprecipitatie. Echter, succesvolle immunoprecipitaties met 0,8-1 mg van het totale eiwit zijn uitgevoerd. Gebruik altijd verse of vers ontdooide eiwitextracten. Het volgende protocol wordt beschreven om immunoprecipitatie uit te voeren van 2 mg totaal eiwit, of een enkel immunoprecipitatie-experiment. De hoeveelheid kralen en antilichamen kan dienovereenkomstig worden verhoogd of verlaagd voor meerdere monsters of als een andere hoeveelheid eiwitextract wordt gebruikt.
<ol><li>Plaats of ontdooi het eiwitextract op ijs. Het monster kan worden verdund tot 10 mg/ml of 5 mg/ml met ijskoude 1x lysisbuffer (zie tabel 1).</li>
	<li>Resuspend de magnetische kralen door inversie en breng 150 μL van de 50% kralen suspensie in een 1,5 ml buis. Magnetiseer de kralen op ijs tegen een magneetstandaard gedurende 1 min of totdat de oplossing helder is. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Verwijder de buis van de magnetische standaard en was de kralen in 1x lysisbuffer met 2 volumes (d.w.z. 300 μL) kraalmest. Herhaal de was 2x voor in totaal drie wasbeurten.</li>
	<li>Resuspend de kralen in 150 μL ijskoude lysisbuffer.</li>
	<li>Breng 75 μL van de kraalmest over op 2 mg eiwitextract en incubeer bij 4 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie. Bewaar de resterende kraalsuspensie op ijs voor later gebruik. OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om de niet-specifieke eiwitbinding aan kralen tijdens de immunoprecipitatiestap te verminderen.</li>
	<li>Plaats de buis met monster op de magnetische standaard op ijs gedurende 1 min of totdat de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 ml; verstoor de kralen niet. Dit is het precleared eiwitlysaat. Bespaar 10% van het monster voor westerse vlekanalyse.</li>
	<li>Voeg 20 μg affiniteit gezuiverd antilichaam toe aan het voorcleared lysaat en incubeer bij 4 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie. OPMERKING: De hoeveelheid antilichamen die wordt gebruikt voor immunoprecipitatie is specifiek voor het antilichaam en het eiwit en moet empirisch worden bepaald om een effectieve immunoprecipitatie van het doeleiwit te garanderen.</li>
	<li>Voeg de resterende 75 μL van de voorgewassen kralensuspensie (stap 3.5) toe aan het antilichaam/lysaatmengsel en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C met zachte agitatie.</li>
	<li>Plaats de buis in de magnetische standaard op ijs gedurende 1 min of totdat de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is. Bewaar het supernatant voor western blot analyse (optioneel).</li>
	<li>Was de kralen met het immunoprecipitaat 3x in 450 μL wasbuffer (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumchloride, 0,1% Triton X, 2 mM magnesiumchloride, 10% glycerol, 1 mM DTT; zie tabel 1) op ijs. OPMERKING: Extra wasbeurten kunnen worden uitgevoerd als strengere wasomstandigheden de voorkeur hebben.</li>
	<li>Resuspend de kraalkorrel in 20 μL 2x SDS/BME eiwitgellaadbuffer (zie tabel met materialen) en denature door 5 minuten te koken bij 95 °C voordat deze op een SDS-PAGE gel wordt geladen. Als alternatief kunnen gedenatureerde monsters enkele maanden bij -20 °C worden bewaard. OPMERKING: Een deel van het adal immunoprecipitaat kan worden opgeslagen voor downstream RNA-isolatie, indien gewenst.</li>
</ol>4. Westerse vlekdetectie van IP-monsters
<ol><li>Plaats de IP-monsters op de SDS-PAGE gel (zie Materiaaltabel). Vermijd het overbrengen van de kralen door de IP-buizen gedurende 1 minuut op de magnetische standaard te plaatsen voordat u het monster aspireert.</li>
	<li>Voer de Western blotting15,16 en antilichaamkleuring16 uit met de volgende wijzigingen: verdun het ALG-1-antilichaam17 1:500 in 5% vetvrije droge melk (NFDM); verdun het HRPK-1 antilichaam2 1:1.000 in 5% NFDM; en verdun het AIN-1 antilichaam18 1:10.000 in 5% NFDM. Secundaire antilichamen (zie tabel met materialen)werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Detecteer de banden met op HRP gebaseerde chemiluminescentie (zie tabel met materialen).</li>
</ol>

<ol><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li>
<li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRPK-1%2C+a+conserved+KH-domain+protein%2C+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067(2019).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li>
<li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li>
<li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li>
<li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li>
<li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer%3A+an+old+tool+for+a+new+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li>
<li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans%3A+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117(2018).</li>
<li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li>
<li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li>
<li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li>
<li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2%E2%80%99-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759(2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286(2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins%2C+miRNAs%2C+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350(2018).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

C. elegans is een uitstekend model voor het bestuderen van fundamentele vragen in cel-, moleculaire en ontwikkelingsbiologie19. Naast zijn kracht als genetisch modelsysteem, is C. elegans vatbaar voor biochemische benaderingen, waaronder, maar niet beperkt tot, eiwit immunoprecipitatie en co-immunoprecipitatie. Een mogelijke hindernis bij het uitvoeren van immunoprecipitatie-experimenten is het ontbreken van antilichamen die specifiek zijn voor de eiwitten van belang. Als er geen antilichamen beschikbaar zijn, kunnen aangepaste polyklonale of monoklonale antilichamen worden gegenereerd. Recente innovaties in genoombewerkingstechnologie hebben onderzoekers echter in staat gesteld om snel mutaties te introduceren of endogene C. elegans-genen 20,21tetaggen , waardoor studies mogelijk zijn die de genetische, functionele en fysieke interacties tussen de genen en de gecodeerde eiwitten ontrafelen. Met name crispr/cas9-gemedieerde tagging van C. elegans genen op de endogene loci heeft de afhankelijkheid van immunoprecipitatie experimenten op de beschikbaarheid van antilichamen verminderd, waardoor co-immunoprecipitatie experimenten veel haalbaarder zijn geworden. C. elegans genen kunnen worden getagd met een verscheidenheid aan tags, variërend van fluorescerende tags zoals GFP of mCherry tot kleine tags zoals FLAG en HA. Antilichamen die deze tags herkennen, zijn direct commercieel beschikbaar, waardoor de studies naar eiwit-eiwitinteracties via immunoprecipitatiebenaderingen worden vergemakkelijkt.
Het gepresenteerde protocol, beschreven in figuur 1,kan worden uitgevoerd voor een klein aantal monsters of worden opgeschaald, waardoor maximaal 24 monsterpreparaten tegelijk mogelijk zijn. Hoewel de eerste karakteriseringen van eiwit-eiwitinteracties via immunoprecipitatie meestal worden gedaan in wilde typeachtergronden onder normale groeiomstandigheden, vereisen vervolgstudies vaak het testen van de eiwit-eiwitinteracties in verschillende genetische achtergronden of onder verschillende groeiomstandigheden. De mogelijkheid om tegelijkertijd meerdere extracten te bereiden bespaart tijd en, belangrijker nog, zorgt voor consistentie van de extractvoorbereiding tussen de verschillende monsters. Een negatieve controle is altijd vereist, waarbij de ideale controle een nulmutatie is in de gencodering voor het immunoprecipiteerde eiwit van belang (zie figuur 3 en figuur 4 voor voorbeelden).
Dit extractprotocol maakt een snelle bereiding van eiwitextracten uit C. elegans-monsters mogelijk en is vergelijkbaar met homogenisatie op basis van zirkoniumkraal8. Kraalhomogenisatie in het algemeen kan worden opgeschaald naar meerdere gelijktijdige monsterpreparaten met behulp van een verscheidenheid aan kraalmolenhomogenisatoren of soortgelijke apparatuur. Sommige zuinigere kraalmolenhomogenisatoren kunnen echter het aantal monsters verminderen dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Als alternatief is het gepresenteerde extractprotocol compatibel met extractpreparaat op basis van dounce, wat een economisch alternatief is. Hoewel verschillende kraalmolenhomogenisatoren niet werden getest, zijn de meeste waarschijnlijk compatibel met dit eiwitextractprotocol, zolang volledige verstoring van de C. elegans-monsters wordt bereikt.
Zoals gepresenteerd, dit extract voorbereiding protocol is compatibel met meerdere downstream experimenten, met inbegrip van eiwit immunoprecipitatie2 en microRNA pull-down12 en maakt het mogelijk voor downstream verzameling van zowel eiwit en RNA componenten. Het extraheert ook efficiënt zowel nucleaire als cytoplasmatische eiwitten (figuur 2, figuur 3en figuur 4). Evenzo maakt het gepresenteerde immunoprecipitatieprotocol RNA-isolatie van eiwitgerelateerde immunoprecipitaten mogelijk. Terwijl het immunoprecipitatieprotocol oorspronkelijk werd ontwikkeld om ALG-1 eiwitinteracties te identificeren, kan de methode worden aangepast om te testen op interacties tussen alle eiwitten van belang. In feite werkten de gebruikte immunoprecipitatieomstandigheden even goed voor immunoprecipiterende ALG-1 (figuur 3) en HRPK-1 (figuur 4). Dit protocol is een uitstekend uitgangspunt voor immunopurificatie van RNA-bindende eiwitten. Er zij echter op gewezen dat sommige veranderingen in de buffersamenstelling nodig kunnen zijn voor andere eiwitten van belang. De veranderingen kunnen afhangen van de fysische en biochemische eigenschappen van het eiwit van belang en moeten van geval tot geval worden geïmplementeerd.
Zodra het doeleiwit (hier, ALG-1 of HRPK-1) immunoprecipitated is, kan western blotting worden gebruikt om het co-immunoprecipitaat te testen op specifieke eiwit interactoren.
Als alternatief kan het gecopureerde immunoprecipitaat worden onderworpen aan massaspectrometrieanalyse om alle putatieve interacterende eiwitten te identificeren. Bevestigde co-immunoprecipitatie interacties kunnen vervolgens worden onderzocht in een verscheidenheid van genetische achtergronden of voorwaarden om potentiële regulering van de specifieke interactie te identificeren. Om bijvoorbeeld te bepalen of hrpk-1 een rol speelt in alg-1/AIN-1 miRISC assemblage, werd ALG-1-AIN-1 coprecipitatie beoordeeld zowel op een wilde type achtergrond als bij afwezigheid van HRPK-1 (Figuur 3). hrpk-1 bleek overbodig te zijn voor ALG-1/AIN-1 interactie2 (figuur 3). Bovendien kan CRISPR/Cas9 genoombewerkingstechnologie worden gebruikt om mutaties met één punt of domeinverwijdering in de eiwitten van belang te genereren. Het opnieuw testen van het vermogen van de gegenereerde mutanten om te coprecipitaten met hun eiwitinteracties kan onthullen welke domeinen of residuen de fysieke interactie bemiddelen. Dergelijke toekomstige studies kunnen onschatbare informatie opleveren over het mechanisme van eiwitfunctie en -regulering. Deze benaderingen, gecombineerd met de kracht van C. elegans genetica, kunnen belangrijke inzichten bieden in de fundamentele moleculaire processen die de ontwikkeling van dieren en cellulaire functie bepalen.

Het identificeren van de macromoleculaire interacties van een interessant eiwit kan de sleutel zijn om meer te weten te komen over de functie ervan. Immunoprecipitatie- en co-immunoprecipitatie-experimenten kunnen worden gebruikt om het volledige interactoom van een eiwit te identificeren via grootschalige proteomische benaderingen1 of om specifiek het vermogen van een eiwit om te coprecipitaten met een veronderstelde interactor te testen. Bij C. eleganszijn beide methoden met succes gebruikt om meer te weten te komen over de activiteit van een verscheidenheid aan eiwitten , waaronder die welke nauw samenwerken met microRNAs om genexpressie2,3,4te reguleren . Co-immunoprecipitatie-experimenten hebben het voordeel dat ze de eiwit-eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving testen, maar extractvoorbereiding kan uitdagend en tijdrovend zijn. Efficiënte lysis van het monster is noodzakelijk, maar er moet voor worden gezorgd dat de verstoring van eiwit-eiwitinteracties tot een minimum wordt beperkt. Methoden zoals douncing5,sonicatie6,Balch homogenisatie7,en zirkonia kralen-homogenisatie8,9 zijn gebruikt om met succes te bereiden C. elegans totale eiwitextracten. Deze methoden, met uitzondering van zirkonia kraal homogenisatie, hebben beperkingen in termen van het aantal monsters dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Gepresenteerd is een alternatieve methode die gemakkelijk kan worden opgeschaald om een snelle eiwitextractvoorbereiding met hoge doorvoer mogelijk te maken uit C. elegans-monsters, gevolgd door co-immunoprecipitatie. In het bijzonder kan de methode tot 24 monsters tegelijk bereiden, waardoor de tijd die nodig is voor het bereiden van extracten aanzienlijk wordt verkort. Douncing daarentegen maakt meestal slechts één monstervoorbereiding tegelijk mogelijk. Deze extractmethode kan worden gebruikt om extracten te bereiden uit elke ontwikkelingsfase van C. elegans.
Beschreven is een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van dierlijke monsters, extractvoorbereiding, immunoprecipitatie en presentatie van westerse blaasgegevens om succesvolle eiwituittrekkracht en detectie van het co-immunoprecipiterende eiwit van belang te bevestigen. Om de effectiviteit van het protocol aan te tonen, werden twee co-immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd tussen 1) microRNA Argonaute ALG-1 en AIN-1, een GW182 homolog; en 2) ALG-1 en HRPK-1, een nieuw geïdentificeerde ALG-1 interactor2. ALG-1 en AIN-1 zijn kerneiwitten die het microRNA-geïnduceerde geluiddempingscomplex (miRISC) omvatten en de interactie tussen deze twee eiwitten is goed ingeburgerd10,11. Het extractpreparaatprotocol was effectief in het ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitatie-experiment. Dit protocol bevestigde ook met succes de interactie tussen ALG-1 en zijn nieuw geïdentificeerde interactor, HRPK-12.
Samengevat beschrijft het manuscript een C. elegans extractpreparaatprotocol dat kan worden opgeschaald om tegelijkertijd 24 monsters te verwerken, samen met een co-immunoprecipitatieprotocol dat kan worden gebruikt om nieuwe of veronderstelde interacties tussen eiwitten te identificeren of te bevestigen. Het extractpreparaatprotocol is compatibel met een aantal downstream-experimenten, waaronder eiwitimmunoprecipitatie2 en microRNA pulldowns12. Bovendien kan het immunoprecipitatieprotocol worden aangepast om te testen op interacties tussen twee of meer endogene, endogene gelabelde of overexpressie C. elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoklonaal antilichaam</td><td>op maat gemaakt</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, zie ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoklonaal antilichaam</td><td>op maat gemaakt door PRF&amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoklonaal antilichaam</td><td>op maat gemaakt door PRF&amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A voor Immunoprecipitatie</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magneet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-vrije proteaseremmers</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>GFP antilichaam (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figuur 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secundair Antilichaam, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secundair Antilichaam, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substraat, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydraat ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfaat Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Fosfaatremmers cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Fosfaatremmers cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>beschikbaar op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>beschikbaar op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>beschikbaar op aanvraag</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie van caenorhabditis elegans

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitatiemethoden worden vaak gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen. Bevestiging van veronderstelde eiwit-eiwit interacties of identificatie van nieuwe kan onschatbare informatie over de functie van een eiwit van belang. Sommige van de traditionele methoden voor extractvoorbereiding vereisen vaak arbeidsintensieve en tijdrovende technieken. Hier wordt een aangepast extractvoorbereidingsprotocol met behulp van een kraalmolenhomogenisator en metalen kralen beschreven als een snel alternatief voor traditionele eiwitbereidingsmethoden. Deze extractpreparaatmethode is compatibel met downstream co-immunoprecipitatiestudies. Als voorbeeld werd de methode gebruikt om C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 en twee bekende ALG-1 interactors met succes te co-immunoprecipitaat: AIN-1 en HRPK-1. Dit protocol bevat beschrijvingen van het verzamelen van dierlijke monsters, het bereiden van extracten, het verduidelijken van extracten en eiwitimmunoprecipitatie. Het beschreven protocol kan worden aangepast om te testen op interacties tussen twee of meer endogene, endogene gelabelde of overexpressie C. elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden.

Dit protocol (schematisch weergegeven in figuur 1) werd met succes gebruikt om C. elegans totale eiwitextracten (figuur 2) te verkrijgen voor downstream immunoprecipitatie van verschillende eiwitten2 (figuur 3 en figuur 4). Het gepresenteerde homogenisatorprotocol voor kraalmolens was qua totale eiwitextractie vergelijkbaar met dounce-gebaseerde methoden (figuur 2) en efficiënt geëxtraheerd nucleair (COL-19::GFP(NLS) (figuur 2) en cytoplasmatische eiwitten (figuur 3 en figuur 4). Meerdere monsters van verschillende grootte werden tegelijkertijd geëxtraheerd (figuur 2). Argonaute-eiwitten interageren met leden van de GW182-eiwitfamilie en vormen de miRISCs die zich binden aan de doelboodschapper RNA's en hun expressie onderdrukken10. Figuur 3 toont succesvolle co-immunoprecipitatie van de kernmiRISC-componenten ALG-1 en AIN-1, in overeenstemming met eerdere rapporten11,17. Meer recentelijk werden inspanningen geleverd om extra eiwit interactoren van Argonaute ALG-13 te identificeren om meer te weten te komen over hoe microRNA biogenese en activiteit kunnen worden gereguleerd door hulpfactoren. Het RNA-bindende eiwit HRPK-1 werd geïdentificeerd in ALG-1 immunoprecipitaten3. Deze interactie werd onlangs bevestigd in een wederkerig HRPK-1 immunoprecipitatie-experiment2. Het gepresenteerde extract en immunoprecipitatieprotocollen herstelden met succes ALG-1 in HRPK-1-specifieke co-immunoprecipitaten (Figuur 4). Bovendien werd de ALG-1-AIN-1 interactie getest op verschillende genetische achtergronden en HSPK-1 bleek niet nodig te zijn voor de ALG-1/AIN-1 miRISC assemblage2 (Figuur 3). Aanvullende cijfers worden verstrekt om het volledige onderzochte membraan weer te geven (Aanvullende figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figuur 1: Workflow schematisch voor C. elegans extract voorbereiding en immunoprecipitatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figuur 2: Westerse vlekvergelijking van een nucleair gelokaliseerd GFP, COL-19::GFP(NLS), niveaus in dounce-bereide en gehomogeniseerde monsters van 250 μL en 100 μL wormkorrels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figuur 3: GW182 homolog AIN-1 co-immunoprecipitaten met ALG-1. Westerse blotting voor ALG-1 en AIN-1 eiwitten in ALG-1 immunoprecipitaten. De ALG-1/AIN-1 co-immunoprecipitatie werd niet beïnvloed door de afwezigheid van hrpk-1. Input = 10% van IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figuur 4: ALG-1 co-immunoprecipitaten met HRPK-1. Western blotting voor HRPK-1 en ALG-1 bij HRPK-1 immunoprecipitaten wordt getoond. Input = 10% van IP. * duidt op antilichaam zware ketting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 buffer (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>tot 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lysis buffer (5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7,4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glycerol</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>tot 5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voeg vers toe:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA-vrije proteaseremmer</td>
			<td>1 tablet</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfataseremmer cocktail 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfataseremmer cocktail 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Lysis buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Verdun 2x Lysis buffer met een gelijk volume ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Wasbuffer 10 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7,4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glycerol</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>tot 10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (vers toevoegen)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Recepten
Aanvullend figuur 1. Volledige onderzochte westerse vlekkenmembranen die worden gebruikt om figuren 2-4 te genereren, worden weergegeven. (A) Onderzocht membraan voor figuur 2. Merk op dat het membraan is gesneden om gelijktijdige tasten voor GFP en Tubulin mogelijk te maken, waardoor de totale vlekgrootte wordt verminderd. B) Onderzocht membraan voor figuur 3. (C) Onderzocht membraan voor figuur 3. *duidt op antilichaam zware ketting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Deze methode beschrijft een protocol voor eiwitextractpreparaat met hoge doorvoer uit Caenorhabditis elegans-monsters en daaropvolgende co-immunoprecipitatie.

Eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie van Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor monsterverzameling, extractvoorbereiding en immunoprecipitatie voor de bevestiging van een succesvolle eiwitpull-down en de detectie van co-immunoprecipiteerde eiwitten van belang. De voorbereiding van het eiwitextract kan worden uitgevoerd voor maximaal 24 monsters en is compatibel met een aantal downstream-toepassingen, inclusief immunoprecipitatie en RNA pull-down-experimenten. Deze methode kan worden aangepast om het testen van interacties tussen twee of meer endogene, endogenelijk gelabelde of overgeëxprimeerde C.elegans-eiwitten in verschillende genetische achtergronden te vergemakkelijken.Visuele demonstratie van dit protocol is bedoeld om onderzoekers vertrouwd te maken met eiwitextractvoorbereiding en immunoprecipitatie, en hopelijk aan te moedigen dat degenen die nieuw zijn in de technieken deze in hun onderzoek gebruiken. Om een wormmonster te verzamelen, zaai eerst gemengde stadia of gesynchroniseerde wormen op solide nematodengroeimediumplaten bij de vereiste temperatuur en laat de wormen groeien tot het gewenste stadium. Aan het einde van de incubatie, gebruik M9-buffer om de wormen in een 15 milliliter conische buis te wassen en pellet de wormen door centrifugatie.Aan het einde van de centrifugatie, verwijder het supernatant en was de wormen nog drie tot vijf keer in verse M9-buffer per wasbeurt. Wanneer het supernatant niet langer troebel is, voer een laatste wassing uit met dubbel gedistilleerd water en breng het losse wormpellet over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Pellet de wormen met een extra centrifugatie en gooi het resterende supernatant weg om een gepakt wormpellet te verkrijgen.Om extract van het verzamelde wormpellet te bereiden, voeg een gelijk volume ijskoud 2X lysisbuffer toe aan een aanbevolen 300 microliter volume pellet en meng de resulterende suspensie krachtig. Draai het monster naar beneden om de mix op de bodem van de buis te verzamelen en breng de inhoud van de buis over in een 1,5 milliliter RNAse-vrije buis met metalen kralen. Na het goed afdichten van de buis, plaats het monster in een kralenmolenhomogenisator bij vier graden Celsius en zorg ervoor dat het monster in balans is in de homogenisator.Homogeniseer het monster op de hoogste snelheid gedurende vier minuten voordat u het monster overbrengt naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis zonder kralen. Draai het monster naar beneden om het eiwitextract te verduidelijken en breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis op ijs zonder het witte troebele precipitaat aan de bovenkant van het monster over te brengen. Bewaar 10 microliter van het verdunde extract om de totale eiwitconcentratie te bepalen volgens standaardprotocollen en verdun het monster onmiddellijk tot vijf of 10 milligram eiwit per milliliter ijskoud 1X lysisbuffer op ijs.Voor immunoprecipitatie van het eiwit van belang, hersuspenseer eerst de magnetische kralen door omkering en breng 150 microliter van de 50X kralensuspensie over in een 1,5 milliliter buis. Magnetiseer de kralen op ijs tegen een magnetisch statief gedurende ongeveer een minuut. Wanneer de oplossing helder is, gooi het supernatant weg.Verwijder de buis van het magnetisch statief en was de kralen met drie 300 microliter volumes 1X lysisbuffer. Na de laatste wassing, hersuspenseer de kralen in 150 microliter ijskoude lysisbuffer en breng 75 microliter van de kralenslurry over naar twee milligram van het eiwitextractmonster. Na een uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie, plaats de monsterbuis gedurende ongeveer een minuut in de magneet op ijs.Wanneer de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is, breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis zonder de kralen te verstoren. Bewaar 10% van het monster voor Western blot-analyse en voeg 20 microgram affiniteit gezuiverd antilichaam toe aan het vooraf opgeruimde lysaat voor een uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Aan het einde van de incubatie, voeg de resterende 75 microliter voorgewassen kralensuspensie toe aan het antilichaamlysaatmengsel voor een extra uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie.Aan het einde van de incubatie, plaats het monster gedurende ongeveer een minuut terug op de magneet. Wanneer de kralen volledig gemagnetiseerd zijn en het monster helder is, was de kralen met het immunoprecipitaat drie keer in 450 microliter wasbuffer op ijs. Na de laatste wassing, hersuspenseer het kralenpellet in 20 microliter 2X SDS bèta-mercaptoethanol eiwitgel-laadbuffer en kook het monster gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.Voor detectie van de immunoprecipiteerde eiwitten door Western blot-analyse, laad het gedenatureerde eiwitmonster op een SDS-PAGE-gel zonder de kralen over te brengen en voer Western blot-analyse uit volgens standaardprotocollen met behulp van de juiste antilichamen voor de eiwitten van belang, en detecteer vervolgens de banden met behulp van chemiluminescentie op basis van paardenradenperoxidase. Het gedemonstreerde kralenmolenhomogenisatieprotocol is vergelijkbaar in totale eiwitextractie met dounce-gebaseerde methoden voor de efficiënte extractie van nucleaire en cytoplasmatische eiwitten. In deze analyse werd vastgesteld dat Argonaute-eiwitten interageren met leden van de GW182-eiwitfamilie die microRNA-geïnduceerde silencingcomplexen vormen die zich binden aan de doel-messenger RNA's en hun expressie onderdrukken.De gedemonstreerde extract- en immunoprecipitatieprotocollen kunnen ook worden gebruikt om ALG-1 en HRPK-1 specifieke co-immunoprecipitaten succesvol te herstellen. Bovendien onthulde het testen van de ALG-1:AIN-1 interactie in verschillende genetische achtergronden dat HRPK-1 niet noodzakelijk is voor de ALG-1:AIN-1 microRNA-geïnduceerde silencingcomplexassemblage. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat eiwitextractie en de immunoprecipitatie worden uitgevoerd bij vier graden Celsius of op ijs om de stabiliteit van de monsters te behouden.Deze totale eiwitextractvoorbereiding is compatibel met eiwitimmunoprecipitatie en microRNA pull-down-experimenten met behulp van een microRNA complementair oligonucleotide en vergemakkelijkt de downstream-verzameling van zowel eiwit- als RNA-componenten.

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd voor de extractie en analyse van prostaglandines en andere eicosanoïden...

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

In vivo snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IV-FPOP) is een hydroxyl radicale eiwit footprinting techniek die het mogelijk maakt voor het in kaart brengen van eiwitstructuur in hun eigen omgeving. Dit protocol beschrijft de assemblage en opzet van het IV-FPOP microfluidic flow systeem.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van actief nucleair extract uit larvale stadium 4 C. elegans en het visualiseren van transcriptieactiviteit in een in vitro systeem.

Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.

Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Dit protocol beschrijft een snelle, reproduceerbare organische, oplosmiddelgebaseerde extractie- en neerslagmethode voor het zuiveren van elastine-achtige polypeptide (ELP) uit Escherichia coli, waarmee een potentieel schaalbaar alternatief wordt geboden voor conventionele ELP-zuiveringsmethoden.

Efficiënte zuivering van elastine-achtige polypeptiden (ELP's) uit E. coli met behulp van een organisch-oplosmiddelgebaseerde extractie- en precipitatiemethode

Leer eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie voor het bestuderen van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans. Deze methode ondersteunt hoogdoorvoeranalyse en is compatibel met diverse downstream toepassingen.

Eiwitextractpreparaat en co-immunoprecipitatie van Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen