Name: Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Leer hoe mesh-vormige cardiale weefsels van menselijke iPS-cellen worden bereid voor hartregeneratietherapie. Deze methode herstelt hartfunctie in een rattenmodel na myocardinfarct.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door het Kosair Charities Pediatric Heart Research Program van de Universiteit van Louisville en het Organoid Project van het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSC's die in onze gepubliceerde protocollen werden gebruikt, werden geleverd door het Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

1. Onderhoud van hiPSC's en cardiovasculaire differentiatie
<ol><li>Uitbreiden en onderhouden van hiPSC's op dunne-coat kelder membraan matrix (groeifactor verminderd, 1:60 verdunning) in geconditioneerd medium gewonnen uit muis embryonale fibroblasten (MEF-CM) met menselijke basis fibroblast groeifactor (hbFGF)4. OPMERKING: We gebruikten een hiPSC's (4-factor (Oct3/4, Sox2, Klf4 en c-Myc) lijn: 201B6). Voeg hbFGF toe bij de juiste concentratie voor elke cellijn. Laminin-511 fragment kan ook worden gebruikt voor de coating van cultuur schotel in plaats van kelder membraan matrix. Commercieel verkrijgbaar medium ontworpen voor feeder-vrije cultuur van hiPSC's kan worden gebruikt als een substituut voor MEF-CM.</li>
	<li>Gebruik Versene (0,48 mM ethylenediaminetetraaceticum (EDTA) om cellen los te maken en te scheiden wanneer celvloeiing 90\u2012100% bereikt. LET OP: Andere commercieel verkrijgde producten voor celdissociatie kunnen ook worden gebruikt.</li>
	<li>Plaatcellen met een dichtheid van 10.000 cellen/mm2 op met matrix gecoate celkweekplaten in MEF-CM met hbFGF en cultuur gedurende twee tot drie dagen.</li>
	<li>Wanneer de cultuur volledig samenvloeiend wordt, bedek de cellen met matrix (1:60 verdunning met MEF-CM) voor één dag.</li>
	<li>Vervang de MEF-CM door RPMI 1640 + B27 medium. Voeg 100 ng/mL Activin A en 100 ng/mL Wnt3A voor één dag toe aan het medium. LET OP: Dit is dag 0 van differentiatie. Om canonieke Wnt-signalering te upreguleren, kunnen GSK3β-remmers ook worden gebruikt in plaats van Wnt3A.</li>
	<li>Verander op dag 1 van differentiatie het medium naar nieuwe RPMI 1640 + B27 met 10 ng/mL BMP4 en 10 ng/mL hbFGF. Kweekcellen voor twee (MC-protocol) of vier (CM+EG-protocol) dagen zonder medium verandering5. OPMERKING: HET CM+EC-protocol is geoptimaliseerd om tegelijkertijd cardiomyocyten (CMs) en vasculaire endotheelcellen (EC's) op te wekken. MC-protocol is geoptimaliseerd om bij voorkeur vasculaire muurschilderingcellen (MC's) te induceren.</li>
	<li>CM+EG-protocol voor de inductie van CMs en EU's (figuur 1A).<ol>
<li>Vervang het medium op dag 5 van differentiatie door RPMI 1640 + B27 aangevuld met 50 ng/mL vegf165.</li>
		<li>Verander het cultuurmedium om de 48 uur tot dag 13\u201215 van differentiatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MC-protocol voor de inductie van vasculaire muurschilderingcellen(figuur 1B)<ol>
<li>Vervang het medium door RPMI1640 + 10% foetale runderserum (FBS) op dag 3 van differentiatie.</li>
		<li>Verander het cultuurmedium om de 48 uur tot dag 13\u201215 van differentiatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Celoogst- en afstammingsanalyse op differentiatiedag 13\u201215
<ol><li>Was de cellen met Ca2+ en Mg2+ vrij fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Voeg celdissociatieoplossing (met proteasen, collagenases en DNAses) toe in de celkweekschotel om de plaat te bedekken. Broed de plaat 5 min bij 37 °C.</li>
	<li>Verzamel en dissociale de cellen met cultuurmedium met behulp van een pipet na incubatie.</li>
	<li>Wijs 1 x 106 cellen toe voor lijnanalyse met stroomcytometrie. Om dode cellen te elimineren, bevlek de cellen met fixable levensvatbaarheid kleurstof.</li>
	<li>Bevlek de cellen met membraanoppervlakmarkeringen in PBS met 5% FBS. Gebruik de volgende verdunningen van antilichamen bij fluorescentie geactiveerde celsorteren (FACS) kleuringsbuffer: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE cadherine (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).</li>
	<li>Voor intracellulaire eiwitten, resuspend en fix de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.</li>
	<li>Vlek de cellen met anti-cardiale isoform van Troponin T (cTnT) in PBS met 5% FBS en 0,75% Saponin en label het cTnT-antilichaam vervolgens met 488 muis IgG1 (verdunning 1:50).</li>
	<li>Resuspend de gekleurde cellen in PBS met 5% FBS en zet ze in FACS buizen met celzeef.</li>
	<li>Analyseer de celsamenstelling van de gekleurde cellen van elk differentiatieprotocol met stroomcytometrie om het genereren van celsuspensies met gedefinieerde afstammingsverdelingen te vergemakkelijken. OPMERKING: Tijdens het uitvoeren van deze procedure wordt de resterende celsuspensie voor EC's bewaard in een koelkast van 4 °C.</li>
</ol>3. Fabricage van PDMS-weefselmal
<ol><li>Giet een laag van 0,5 mm dik en meer dan 30 mm x 30 mm polydimethylsiloxaan (PDMS) door de voorpolymeer- en kruiskoppelingsoplossing te mengen met een verhouding van 10:1 en vervolgens te genezen bij 80 °C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Snijd de PDMS-plaat en bind het met siliconenlijm om een rechthoekige lade van 21 mm x 20,5 mm te fabriceren met een lengte van 7 mm, 0,5 mm breed en 2,5 mm hoge rechthoekige palen in een gespreide positie. De horizontale afstand tussen twee lijnen van palen bedraagt 2,5 mm (figuur 2B).</li>
	<li>Autoclave de lade op 120 °C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Bekleed de lade met 1% poloxamer 407 in PBS voor 1 uur. Spoel de poloxamer 407 en spoel de mal voldoende voor gebruik af met PBS.</li>
</ol>4. ECT-constructie
<ol><li>Na de analyse van de cellijn, combineer de cellen van CM+EG- en MC-protocollen zodat de uiteindelijke concentratie van MC's 10 tot 20% is in een totaal celaantal van zes miljoen cellen per constructie5.</li>
	<li>Schort gemengde zes miljoen cellen op in ECT-kweekmedium (alfa minimaal essentieel medium aangevuld met 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol en 100 U/mL Penicilline-Streptomycin).</li>
	<li>Voorbereiding van matrixoplossing<ol>
<li>Meng 133 μL van zuur oplosbare rat staart collageen type I oplossing (2 mg/mL, pH 3) met 17 μL van 10x minimaal essentieel medium (MEM). Meng vervolgens de oplossing met 17 μL alkalibuffer (0,2 M NaHCO3,0,2 M HEPES en 0,1 M NaOH). LET OP: Collageen moet op ijs worden gehouden (4 °C). Controleer buffer kleur en als het medium niet rozeachtig wanneer alle oplossingen worden gemengd, voeg extra alkali buffer aan het medium. De mengstappen moeten collageen I + 10x MEM mengen en vervolgens alkalibuffer toevoegen. Wijzig deze volgorde NIET. Genereer GEEN bubbels in de mix.</li>
		<li>Voeg 67 μL keldermembraanmatrix toe aan de geneutraliseerde collageenoplossing. LET OP: De gemengde oplossing moet op ijs worden gehouden (4 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge de voorbereide celsuspensie met zes miljoen cellen bij 1.100 tpm (240 x g)gedurende 5 min en resuspend de cellen met 167 μL high-glucose DMEM + 20% FBS + 1% penicilline-streptomycine (100x).</li>
	<li>Meng de celopening en de matrixoplossing. Het totale volume van cel/matrixmengsel voor één constructie is 400 μL. OPMERKING: Het cel/matrixmengsel moet bij deze stap niet-stroperig en rozeachtig zijn. Houd het op ijs als de gel zal stollen bij kamertemperatuur. De uiteindelijke concentratie van collageen type I is 0,67 mg/mL.</li>
	<li>Giet de cel / matrix mengsel gelijkmatig over de poloxamer 407 gecoate PDMS weefsel mal, die is geplaatst in een zes-put cultuur plaat12. OPMERKING: Giet het mengsel voorzichtig om te voorkomen dat het genereren van bellen om te voorkomen dat vulling gebreken in de gegoten gel.</li>
	<li>Het cel/matrixmengsel incuren in een standaard CO2-incubator (37C, 5 % CO2) gedurende 60 minuten.</li>
	<li>Nadat het weefsel is gevormd, weken de weefselmal met 4 mL van ECT cultuurmedium. OPMERKING: Hoewel de cel/matrix in 60 minuten is gekruist, is de constructie nog steeds erg kwetsbaar. Voeg medium voorzichtig toe om beschadiging te voorkomen.</li>
	<li>Kweek het weefsel gedurende 14 dagen met medium verandering elke dag.</li>
	<li>Verwijder de ECT voorzichtig van de laadpalen met gesteriliseerde fijne tangen voordat de ECT-implantatie wordt gesteriliseerd. OPMERKING: De uiteindelijke ECT-afmetingen na verwijdering uit de mal zijn minder dan de oorspronkelijke mal. Een mal van 2,1 cm x 2,05 cm genereert een vrijgekomen ECT van ongeveer 1,5 cm x 1,5 cm. Een grotere mal van 3,9 cm x 4,05 cm genereert een ECT van ongeveer 3 cm x 3 cm. Losted ECT toont intrinsieke spontane afstraffing in warme cultuurmedium. Hoewel het in eerste instantie een mesh-structuur behoudt, krimpt en condenseert een ongeladen ECT in de loop van de tijd. Het is mogelijk om het weefsel zachtjes te houden met fijne tangen en vervolgens 7-0 zijden hechting te gebruiken om de ECT aan het epicardium te bevestigen.</li>
</ol>

<ol><li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+heart+failure%3A+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies%2C+current+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li>
<li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%3A+Figure+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933(2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li>
<li>Lancaster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+for+heart+failure%3A+cell-based+therapy+with+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vessel+Plus%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue.</a> Vessel Plus. 2019, (2019).</li>
<li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963(2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641(2017).</li>
<li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+%283D%29+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële of wetenschappelijke conflicten te onthullen.

Na de voltooiing van ons onderzoek naar een lineair formaat, hiPSC afgeleid ECT5, hebben we het protocol aangepast om hiPSC-afgeleide CMs, MC's en MC's te mengen om de in vitro expansie van vasculaire cellen binnen ECT's en de daaropvolgende in vivo vasculaire koppeling tussen ECT's en ontvanger myocardium te vergemakkelijken.
Om het genereren van grotere, implanteerbare mesh ECT-geometrieën te vergemakkelijken, hebben we dunne PDMS-platen gebruikt om de 3D-mallen te on...

Talrijke preklinische studies en klinische studies hebben de efficiëntie van op cellen gebaseerde hartregeneratieve therapieën voor falende harten1,2,3bevestigd . Onder verschillende celtypen, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) zijn veelbelovende celbronnen op grond van hun proliferative vermogen, potentieel om verschillende cardiovasculaire afstammingen4,,5, en allogene te genereren. Bovendien hebben weefseltechnische technologieën het mogelijk gemaakt om miljoenen cellen over te brengen op een beschadigd hart5,6,7,8.
Eerder rapporteerden we de generatie van driedimensionale (3D) lineair ontworpen hartweefsels (ECT's) uit hiPSC-afgeleide cardiovasculaire afstammingen met behulp van een commercieel beschikbaar kweeksysteem voor 3D biokunstweefsels5,7. We ontdekten dat de coëxistentie van vasculaire endotheelcellen en muurschilderingcellen met cardiomyocyten binnen de ECT structurele en elektrofysiologische weefselrijping vergemakkelijkte. Bovendien hebben we het therapeutisch potentieel van geïmplanteerde hiPSC-ECT's gevalideerd in een immuuntolerante rat hartinfarct model om de hartfunctie te verbeteren, myocardium te regenereren en angiogenese5te verbeteren. De lineaire ECT's die met deze methode werden geconstrueerd, waren echter 1 bij 10 mm cilinders en dus niet geschikt voor implantatie in preklinische studies met grotere dieren of klinisch gebruik.
Op basis van het succesvolle gebruik van weefselmallen om poreuze weefselvorming te genereren met behulp van rat skeletmyoblasten en cardiomyocyten9, menselijke ESC-afgeleide cardiomyocyten10 en muis iPSCs11, ontwikkelden we een protocol voor het genereren van schaalbare hiPSC-afgeleide grotere implanteerbare weefsel met behulp van polydimethylsiloxane (PDMS) mallen. We evalueerden een reeks schimmelgeometrieën om de meest effectieve schimmelkenmerken te bepalen. Mesh-vormige ECT's met meerdere bundels en knooppunten vertoonden uitstekende kenmerken in celconsistenties, weefselfunctie en schaalbaarheid in vergelijking met gewone of lineaire formaten die poriën of knooppunten misten. We implanteerden de mesh-vormige ECT in een rat hartinfarct model en bevestigde de therapeutische effecten vergelijkbaar met geïmplanteerde cilindrische ECTs12. Hier beschrijven we het protocol om een hiPSC-afgeleide mesh-vormige ECT te genereren.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dishes 100x20 mm style</td><td>Falcon/ Thomas scientific</td><td>9380C51</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS</td><td>Falcon / Thomas scientific</td><td>6902A01</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>BMP4, recombinant (10&micro;g)</td><td>R&amp;D</td><td>RSD-314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Collagen, Type I solution from rat tail</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF (165) IS, premium grade</td><td>Miltenyi</td><td>130-109-385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &micro;m filtered (10% Solution in Water)</td><td>Molecular Probes</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human bFGF</td><td>WAKO</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50&micro;g)</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>rh Wnt-3a (10&micro;g)</td><td>R&amp;D</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>Versene solution</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture medium and supplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11430</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptro Ethanol</td><td>SIGMA</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement minus insulin</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (500ml)</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (500ml)</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 medium</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11900024</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560380</td><td></td></tr><tr><td>anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision</td><td>Fisher</td><td>MS-295-P0</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Clean Solution</td><td>BD</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSFlow Sheath Fluid</td><td>BD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSRinse Solution</td><td>BD</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (500ml)</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td><td>Molecular Probes</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>558821</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47306-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>Z25002</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke ips cellen voor in vivo myocardial repair

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het genereren van schaalbare, mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels (ECT's) samengesteld uit cardiovasculaire cellen afkomstig van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), die zijn ontwikkeld naar het doel van klinisch gebruik. HiPSC-afgeleide cardiomyocyten, endotheelcellen en vasculaire muurschilderingcellen worden gemengd met gelmatrix en vervolgens gegoten in een polydimethylsiloxane (PDMS) weefselmal met rechthoekige interne gespreide palen. Op cultuurdag 14 ECT's vervallen in een 1,5 cm x 1,5 cm mesh structuur met 0,5 mm diameter myofiber bundels. Cardiomyocyten stemmen op de lange as van elke bundel en slaan spontaan synchroon. Deze aanpak kan worden opgeschaald naar een grotere (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT met behoud van de bouw rijping en functie. Zo kunnen mesh-vormige ECT's gegenereerd uit hiPSC-afgeleide hartcellen haalbaar zijn voor cardiale regeneratieparadigma's.

Figuur 1A,B toont de schema's van het CM+EC- en MC-protocol. Na het induceren van CMs en ECs uit het CM+EC-protocol en MC-protocol, worden de cellen gemengd om de uiteindelijke MC-concentraties aan te passen om 10 tot 20% van de totale cellen te vertegenwoordigen. De 2 cm brede weefselmal is vervaardigd volgens de ontwerptekening van 0,5 mm dik PDMS-vel(figuur 2A,B). Zes miljoen CM+EC+MC cellen worden gecombineerd met collageen ...

Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Dit protocol beschrijft een nobele en eenvoudige methode voor het creëren van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke geïnduceerde lichaamsdelen en STAMcel afgeleide hartcellen. De flexibiliteit van de weefselgeometrie en de schaalbaarheid van de bewaarde weefselfunctie zijn de belangrijkste voordelen van deze techniek. De geïmplanteerde mesh vorm ECT's kan herstellen van een cardiale structuur en functie in een rat hartinfarct model.Bevestiging van de haalbaarheid voor gebruik in cardiale regeneratieve therapie. Deze technieken vereisen reproduceerbare menselijke STAMcelverwerking en de weefselkweekvaardigheden voor consistente resultaten. Begin met het snijden van een uitgeharde PDMS vel op de juiste grootte om het blad te worden gebonden met siliconen lijm te fabriceren een 21 bij 20,5 millimeter rechthoekige lade met zeven millimeter lange 0,5 millimeter breed en 2,5 millimeter hoge rechthoekige palen op gespreide posities.De horizontale afstand tussen twee lijnen van palen moet 2,5 millimeter zijn. Autoclave de lade op 120 graden Celsius gedurende 20 minuten voor de coating van de mal met 1%Poloxamer 407 in PBS gedurende een uur. Spoel vervolgens de mal grondig af met PBS en plaats de mal in een put van een zes-put plaat.Voor lijnanalyse, combineren de cellen van de cardiomyocyte plus endotheel en vasculaire muurschildering cel protocollen. Zodat de uiteindelijke concentratie van muurschilderingcellen 10 tot 20% is in een totaal celaantal van zes keer 10 tot de zes cellen per constructie. Meng 133 microliter acid soluble rat tail collageen type een oplossing en 17 microliter alkali buffer tot 17 microliters van 10x minimum essentieel medium op ijs.Voeg vervolgens 67 microliter van Basement Membrane Matrix toe aan de collageenoplossing. Vervolgens centrifugeren de cellen en resuspend de pellet in 167 microliters van High Glucose Dulbecco's Minimal Essential Medium aangevuld met foetale runderserum en antibiotica. Meng de cellen op de matrixoplossing op ijs.Giet vervolgens voorzichtig 400 microliter van de celmatrixoping op de met poloxamer 407 gecoate PDMS-weefselmal. Incubeer het celmatrixmengsel in een standaard celkweek incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 60 minuten. Wanneer het weefsel is gevormd, zorgvuldig weken de mal met vier milliliter van ECT cultuur medium en de plaat terug te keren naar de celcultuur incubator voor 14 dagen.Vóór ect-implantatie steriliseerde u fijne tangen om de ECT zorgvuldig uit de laadpalen te verwijderen. Weefselmallen kunnen worden vervaardigd met verschillende patronen, postlengtes en postafstand om verschillende uiteindelijke ECT-geometrieën te genereren. Voor deze analyse werd een mal met zeven millimeter lange palen met 2,5 millimeter brede intervallen gebruikt.Poloxamer 407 voorkomt hechting van de cellen aan de mal en maakt de vorming van een karakteristieke mesh structuur, na snelle gel verdichting in 14 dagen. De structuur wordt gehandhaafd, zelfs nadat de ECT is vrijgegeven van de mal. De gefabriceerde weefselconstructie is ongeveer 1,5 centimeter breed en 0,5 millimeter dik.En de breedte van elke bundel in het gaas is gemiddeld ongeveer 0,5 millimeter. Het is mogelijk om een 3 centimeter laatste breedte mesh ECT met 24 miljoen cellen te genereren uit een vier keer grotere mal met dezelfde gespreide post ontwerp. Deze grotere mesh ECT kan ook gemakkelijk worden verwijderd uit de mal en genereert een lokale daad van kracht gelijk aan de kleinere mesh ECT.Het is belangrijk om de cel matrix mengsel gelijkmatig giet in het weefsel schimmel zonder het genereren van bellen om te voorkomen dat het gevoel gebreken in de uiteindelijke gel. Functionele karakterisering van de aannemer. en vierde frequentierelaties kunnen worden uitgevoerd met behulp van ingebouwde systemen.Ons uiteindelijke doel is de vertaling van ECT-paradigma's in klinische therapieën die gebruik maken van grote dierlijke preklinische studies.

preparation-mesh-shaped-engineered-cardiac-tissues-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Werkwijzen voor het bereiden een injecteerbare gel matrix van gedecellulariseerde weefsel en het injecteren van het in rat...

Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering

De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.

Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Dit protocol beschrijft een netto schimmel gebaseerde methode om te maken van driedimensionale steiger-vrije cardiale weefsels met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag.

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

Hier presenteren we een protocol voor de inductie van links ventriculaire cryoinjury gevolgd door de inplanting van een patch van de hartspier, afgeleid van menselijke iPS-cel cardiomyocytes in een cavia-model.

Implantatie van hiPSC afkomstige hartspier Patches na myocardiale letsel in een cavia-Model

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het genereren en cryopreservatie van cardiale sferoïden (CSs) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gekweekt in een multidimensionaal formaat met hoge doorvoer. Dit driedimensionale model functioneert als een robuust platform voor ziektemodellering, high-throughput screenings en behoudt zijn functionaliteit na cryopreservatie.

Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer hoe mesh-vormige cardiale weefsels van menselijke iPS-cellen worden bereid voor hartregeneratietherapie. Deze methode herstelt hartfunctie in een rattenmodel na myocardinfarct.

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

Meer video's verkennen