Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair
9 juni 2020
Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.
Dit protocol beschrijft een nobele en eenvoudige methode voor het creëren van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke geïnduceerde lichaamsdelen en STAMcel afgeleide hartcellen. De flexibiliteit van de weefselgeometrie en de schaalbaarheid van de bewaarde weefselfunctie zijn de belangrijkste voordelen van deze techniek. De geïmplanteerde mesh vorm ECT's kan herstellen van een cardiale structuur en functie in een rat hartinfarct model.
Bevestiging van de haalbaarheid voor gebruik in cardiale regeneratieve therapie. Deze technieken vereisen reproduceerbare menselijke STAMcelverwerking en de weefselkweekvaardigheden voor consistente resultaten. Begin met het snijden van een uitgeharde PDMS vel op de juiste grootte om het blad te worden gebonden met siliconen lijm te fabriceren een 21 bij 20,5 millimeter rechthoekige lade met zeven millimeter lange 0,5 millimeter breed en 2,5 millimeter hoge rechthoekige palen op gespreide posities.
De horizontale afstand tussen twee lijnen van palen moet 2,5 millimeter zijn. Autoclave de lade op 120 graden Celsius gedurende 20 minuten voor de coating van de mal met 1%Poloxamer 407 in PBS gedurende een uur. Spoel vervolgens de mal grondig af met PBS en plaats de mal in een put van een zes-put plaat.
Voor lijnanalyse, combineren de cellen van de cardiomyocyte plus endotheel en vasculaire muurschildering cel protocollen. Zodat de uiteindelijke concentratie van muurschilderingcellen 10 tot 20% is in een totaal celaantal van zes keer 10 tot de zes cellen per constructie. Meng 133 microliter acid soluble rat tail collageen type een oplossing en 17 microliter alkali buffer tot 17 microliters van 10x minimum essentieel medium op ijs.
Voeg vervolgens 67 microliter van Basement Membrane Matrix toe aan de collageenoplossing. Vervolgens centrifugeren de cellen en resuspend de pellet in 167 microliters van High Glucose Dulbecco's Minimal Essential Medium aangevuld met foetale runderserum en antibiotica. Meng de cellen op de matrixoplossing op ijs.
Giet vervolgens voorzichtig 400 microliter van de celmatrixoping op de met poloxamer 407 gecoate PDMS-weefselmal. Incubeer het celmatrixmengsel in een standaard celkweek incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 60 minuten. Wanneer het weefsel is gevormd, zorgvuldig weken de mal met vier milliliter van ECT cultuur medium en de plaat terug te keren naar de celcultuur incubator voor 14 dagen.
Vóór ect-implantatie steriliseerde u fijne tangen om de ECT zorgvuldig uit de laadpalen te verwijderen. Weefselmallen kunnen worden vervaardigd met verschillende patronen, postlengtes en postafstand om verschillende uiteindelijke ECT-geometrieën te genereren. Voor deze analyse werd een mal met zeven millimeter lange palen met 2,5 millimeter brede intervallen gebruikt.
Poloxamer 407 voorkomt hechting van de cellen aan de mal en maakt de vorming van een karakteristieke mesh structuur, na snelle gel verdichting in 14 dagen. De structuur wordt gehandhaafd, zelfs nadat de ECT is vrijgegeven van de mal. De gefabriceerde weefselconstructie is ongeveer 1,5 centimeter breed en 0,5 millimeter dik.
En de breedte van elke bundel in het gaas is gemiddeld ongeveer 0,5 millimeter. Het is mogelijk om een 3 centimeter laatste breedte mesh ECT met 24 miljoen cellen te genereren uit een vier keer grotere mal met dezelfde gespreide post ontwerp. Deze grotere mesh ECT kan ook gemakkelijk worden verwijderd uit de mal en genereert een lokale daad van kracht gelijk aan de kleinere mesh ECT.
Het is belangrijk om de cel matrix mengsel gelijkmatig giet in het weefsel schimmel zonder het genereren van bellen om te voorkomen dat het gevoel gebreken in de uiteindelijke gel. Functionele karakterisering van de aannemer. en vierde frequentierelaties kunnen worden uitgevoerd met behulp van ingebouwde systemen.
Ons uiteindelijke doel is de vertaling van ECT-paradigma's in klinische therapieën die gebruik maken van grote dierlijke preklinische studies.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een nieuwe en eenvoudige methode voor het creëren van netvormig gemanipuleerd hartweefsel afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen. De techniek maakt het mogelijk om celimplantatietherapie bij hartaandoeningen te onderzoeken, in het bijzonder in een ratmodel voor myocardinfarct.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cardiale weefseltechnologie
- Stamceltherapie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Gemanipuleerde hartweefsels kunnen de hartstructuur en -functie herstellen.
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn een waardevolle bron voor de afleiding van hartcellen.
- De flexibiliteit van de weefselgeometrie is cruciaal voor een effectieve implantatie.
- Reproduceerbaarheid bij de verwerking van stamcellen is essentieel voor consistente resultaten.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het creëren van genetisch gemanipuleerde hartweefsels in de vorm van een net.
- Om de haalbaarheid van deze weefsels te evalueren in de regeneratieve harttherapie.
- Om het herstel van de hartfunctie na implantatie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een rechthoekige tray met behulp van PDMS en siliconenlijm.
- Creatie van steunpilaren voor het ondersteunen van de gekweekte weefsels.
- Implantatie van de gekweekte hartweefsels in een ratmodel.
- Beoordeling van het herstel van de hartstructuur en -functie.
Belangrijkste resultaten
- De netvormige gemanipuleerde hartweefsels herstelden succesvol de hartfunctie.
- De methode demonstreerde schaalbaarheid en flexibiliteit in de geometrie van het weefsel.
- Consistente resultaten werden behaald door middel van reproduceerbare stamcelverwerking.
- De techniek is haalbaar voor gebruik bij regeneratieve harttherapie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het creëren van genetisch gemodificeerde hartweefsels.
- Maasvormige weefsels kunnen de hartfunctie effectief herstellen in een model van myocardinfarct.
- Deze aanpak is veelbelovend voor toekomstige regeneratieve harttherapieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit protocol maakt schaalbare productie mogelijk van netvormige engineered hartweefsels uit menselijke iPSC-afgeleide cardiovasculaire cellen, wat een reproduceerbaar platform biedt voor myocardiale herstelstrategieën. De aanpak ondersteunt preklinische evaluatie van weefselintegratie en functioneel herstel in ischemische letselmodellen, waardoor een kritisch gat in de regeneratieve cardiologie wordt gedicht. Door een geometrisch instelbaar en schaalbaar construct te bieden, faciliteert het de translationele risicoreductie van stamcelgebaseerde therapieën voor hartfalen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de structurele en functionele integratie van hiPSC-afgeleide hartcellen in vivo te beoordelen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar weefselformaat voor consistente preklinische resultaten over verschillende studies heen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare structurele metrieken (bijv. uitlijning van myofiberbundels, synchrone contractie) voor de ontwikkeling van functionele assays.
- Operationele waarde: Ondersteunt schaalbaarheid naar grotere constructen (tot 3,0 cm), wat testen van dosis-respons en batchconsistentie mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de haalbaarheid van het herstel van de cardiale structuur en functie in een ratmodel voor myocardinfarct, wat bijdraagt aan het mechanistisch verminderen van risico's.
- Operationele waarde: Slaat de brug tussen discovery en preklinische validatie via gestandaardiseerde workflows voor implantatie en functionele beoordeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode positioneert mesh-vormige ECT's als een brug van ontdekking naar preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetesten in de vroege ontdekkingsfase en functionele validatie in preklinische stadia mogelijk worden gemaakt via schaalbare, reproduceerbare weefselproductie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie door gecontroleerde beoordeling mogelijk te maken van de integratie en electromechanische functie van hiPSC-afgeleide hartcellen.
- Screening: Levert assay-klare, gestandaardiseerde weefsels met kwantificeerbare output (slag-synchroniteit, uitlijning) voor de vergelijking van verbindingen of condities.
- Analytics: Biedt structurele en functionele read-outs (afmetingen van het construct, diameter van de myofiber, contractiesynchroniteit) om comparatieve analyse tussen experimentele groepen mogelijk te maken.
- Translationeel onderzoek: Waarborgt continuïteit van in vitro rijping tot in vivo functioneel herstel, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platformtechnologie die aanpasbaar is aan diverse geometrieën en schalen, wat de reproduceerbaarheid tussen projecten en de efficiëntie van middelen bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij de transplantatie van stamcellen en hun functionele bijdrage aan hartreparatie te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en schaalbaarheid door gedefinieerde celverhoudingen, matrixformulering en malgeometrie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door reproduceerbare preklinische effectiviteitsgegevens te leveren, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten voor hartregeneratie mogelijk op basis van gevalideerde weefselprestaties en schaalbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in menselijke iPSC-differentiatie, specificatie van cardiovasculaire cellijnen en 3D-weefselkweektechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot PDMS-gietapparatuur, sterilisatiemogelijkheden en precisievloeistofbehandeling voor het mengen van matrix en cellen.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams wat betreft celbronnen, matrixpreparatie en incubatieprotocollen om consistentie tussen batches te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het opschalen naar grotere constructen of alternatieve geometrieën, met name met betrekking tot nutriëntendiffusie en elektrische koppeling.
- Beperkt door de huidige afhankelijkheid van knaagdiermodellen voor functionele validatie, waardoor grotere preklinische systemen nodig zijn voor klinische translatie.
