Een Drosophila Model om wound-geïnduceerde polyploïdie te bestuderen

Dit protocol kan worden gebruikt om wond-geïnduceerde polyploïdie te bestuderen. Een conserve weefselreparatieproces, waarbij cellen groeien in plaats van delen in de volwassen fruitvlieg. Een eenvoudige steekwond kan worden gemaakt om polyploïdie in het vliegeptheel binnen slechts twee dagen te veroorzaken.

Epitheelcelgrootte, ploidy en organisatie, kan dan gemakkelijk worden beoordeeld. Begin met het verzamelen van twee flesjes, met 10 tot 15 nieuw gesloten vrouwelijke fruitvliegjes van de stam van belang. En het verouderen van de vliegen in verse voedsel flesjes, met ongeveer vijf mannelijke vliegen per flesje op 25 graden celsius, tot drie tot vijf dagen oud.

Voor buikwonden, aan het einde van de incubatie, gebruik dan een enkele 0,1 millimeter roestvrijstalen pin om verschillende pinhouders te monteren, met het scherpe uiteinde van elke pin die uitbeert. Verdoven de oude vrouwelijke fruitvliegjes op een koolstofdioxide vliegpad onder een stereomicroscoop. En gebruik een penseel om de vliegen in een rij te zetten.

Het dragen van een veiligheidsbril, met een pinhouder in de ene hand en tangen in de andere, gebruik maken van de tangen om de vliegen positie met hun ventrale buiken naar boven. Prik vervolgens de volwassen vrouwelijke vliegen binnen het epitheelblauwe rechtergebied van doel A4 aan weerszijden van de ventrale middenlijn roernachten en breng de gewonde vliegen terug naar het voedselflintaal tot het gewenste experimentele tijdpunt na het letsel. Controleer op het experimentele eindpunt op de aanwezigheid van de wond en litteken in elke verdoofde vlieg onder de stereomicroscoop en vul een put van een negen goed glazen dissectieschotel met Grace's oplossing.

Met behulp van een paar tangen, pak een gewonde vrouwelijke vlieg door de rug kant van de thorax en dompel de vlieg in de put van de oplossing. Met de andere kant, gebruik een tweede paar tangen te punctie en verwijder de dorsale cuticula onder doel A6, aan de achterzijde van de fruitvlieg. Als de inwendige organen niet worden geëxtraheerd, druk uitoefenen op de rugzijde van de buik uit te persen van de resterende organen.

Gebruik de tangen om de volledige buik af te breken bij de thoraxverbinding boven doel A2 en breng de buik over naar een put met ongeveer 100 microliters van Grace's oplossing. Wanneer alle buiken zijn verzameld, verklein het volume van Grace's oplossing in de collectie goed tot 30 microliter. Gebruik tangen in de ene hand om de buik rugzijde naar beneden te houden en gebruik de andere hand om het onderste blad van Venetië lente schaar in de buikholte van elke buik en snijd langs de dorsale middellijn totdat de buiken volledig open zijn.

Voeg 30 microliters van Grace's oplossing toe aan elk montagegebied van een droge ontleedplaat met 4,1 millimeter pinnen per buikbevestigingsgebied En plaats de gefileerde buik in de druppel van de oplossing. Wanneer alle van de buiken zijn gefileerd en geplaatst, pin de buiken aan de schotel op de vier rughoeken. Ervoor zorgen dat de weefsels plat liggen zonder het buikweefsel te scheuren of te overbelasten.

Vervang vervolgens de Grace-oplossing door 30 microliters een fixatieve oplossing per montagegebied. En plaats een tape label op de bodem van elk gerecht om elke controle en experimentele groep te markeren. Om de vliegweefselmonsters te monteren.

Gebruik na het beitsen tangen om de buiken los te maken van de ontleedplaat onder de stereomicroscoop. En gebruik tangen om elk monster door zijn rugflank over te brengen in ongeveer 30 microliter van montagemedium op individuele glazen afdekbonnen. Onder de stereo microscoop oriënteren het buikweefsel, zodat de binnenkant naar beneden wordt gericht in de richting van de cover slip en gebruik tangen om de georiënteerde buiken te trekken naar de rand van elke media druppel.

Plaats elke gemonteerde deksel slip op een gelabelde glazen glijbaan. En gebruik een lab weefsel om overtollig montagemedium te verwijderen. Sluit vervolgens de randen van de afdekstrook af met heldere nagellak en bewaar de dia's in de diabox op vier graden celsius tot hun beeldvorming.

De septaat knooppunt eiwit snel drie die labels celcel knooppunten, geeft een indicator van de vraag of er een verwerking verstoringen opgetreden tijdens de voorbereiding. Buiken met grote krassen van onbevlekt gebied dat het wondgebied verstoren, moeten worden weggegooid en niet in de analyse worden opgenomen. Wondherstel is voltooid wanneer een centrale grote multinucleated cel de wondkorst bedekt.

Hiaten van meer dan 10 micrometer op het epitheliale blad worden beschouwd als defecten in wondsluiting en herepithelialisatie. In deze representatieve analyse met behulp van vliegen met geremde mitotische celactivering, was 52% van de wonden niet in staat om een continu epitheliaal blad over de wondkork te vormen. Dit membraan wond healing essay biedt meer informatie over de omvang van de wond reparatie defect waardoor re-epithelialisatie gebreken worden gegroepeerd als ofwel volledig open, gedeeltelijk gesloten of volledig gesloten.

Bijvoorbeeld, in dit experiment de remming van wond geïnduceerde polyploïdie door het gelijktijdig blokkeren van endo replicatie en celfusie, veroorzaakt bij 92% van de epitheliale wonden volledig open te blijven. Terwijl de activering van de mitotische celcyclus resulteerde in een epitheliale wondsluitingsdefect. Bovendien werd celcyclusactiviteit gedetecteerd door de integratie van de thymidine analoge EDU en werd epitheeltruidy bepaald door het nucleaire DNA-gehalte rechtstreeks te meten.

Bij het ontleden van de buikeptheel, zorg ervoor dat het weefsel niet aanraken met een van de ontledende instrumenten als dit zal krassen op het monster. Na dissectie kunnen celproliferatie, celdood, celverliesincisiegrootte of nucleaire DNA-inhoudsbeoordelingen worden uitgevoerd om de geïnduceerde polyploïdie van de wond beter te begrijpen. of andere processen binnen het epitheel.