Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Dit protocol biedt een van stamcellen afgeleid leverdifferentiatiesysteem dat een reproduceerbare tool biedt voor het bestuderen van leverbiologie voor zowel fundamenteel als klinisch onderzoek. Door een gestandaardiseerd en gemakkelijk te volgen protocol te combineren met kant-en-klare kweekreagentia, maakt dit systeem de productie mogelijk van levervoorlopercellen en hepatocyte-achtige cellen op grote schaal. Houd menselijke pluripotente cellen op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een 10 centimeter schaal op laminine-531, door ze dagelijks te voeren met 10 milliliter stamceell maintenance medium per schaal.

Om laminine 521 platen te bereiden, verdun bevroren laminine 521 in ijskoud DPBS met calcium en magnesium tot een uiteindelijke concentratie van acht microgram per milliliter. Voeg 250 microliter van de laminine oplossing toe aan elke put van een 24-puts plaat of 50 microliter aan elke put van een 96-puts plaat. Schud de plaat voorzichtig van zijde naar zijde om de putten gelijkmatig te bedekken, verzegeld vervolgens de platen met een semi-transparante flexibele folie en bewaar ze een nacht op vier graden Celsius.

Op de dag van celzaaien, verwarm de vooraf gecoate platen in een celkweekincubator gedurende 30 tot 60 minuten. Zuig de laminine 521 oplossing af en voeg stamceell maintenance medium aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer toe aan elke put, breng vervolgens de plaat terug naar de incubator. Wanneer de celtelling vloeiend is 70 tot 80%, zuig het gebruikte medium uit de kweekschaal en was elke kweekschaal met vijf milliliter DPBS zonder calcium of magnesium op kamertemperatuur.

Zuig de DPBS-was uit de kweekschaal, voeg vervolgens vijf milliliter enzymvrij disassociatiereagens toe aan de schaal en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende acht tot tien minuten totdat de cellen zichtbaar loskomen van de schaal. Los de cellen voorzichtig van de kweekschaal met een celschraper, pipet vervolgens de inhoud van elke put op en neer met een vijf milliliter serologische pipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Voor elke cellijn, verzamel cellen uit alle onderhoudsputten in een steriele 50 milliliter buis.

Was elke geleegd kweekschaal met vijf milliliter van dit stamceell maintenance medium en voeg de was toe aan de overeenkomstige buis met de verzamelde cellen. Voer drie levensvatbare celtellingen uit op elk verzamelde monster. Centrifugeer de verzamelde monsters gedurende vijf minuten bij 250 x g.

Zuig vervolgens de supernatant af en resuspendeer de cellen in één tot drie milliliter kamertemperatuur als stamceell maintenance medium aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer Y27632. Bereken na bepaling van het vereiste aantal cellen om de gewenste zaadindichtheid te bereiken, resuspendeer de cellen in de juiste concentratie en verdeel ze in de vooraf gecoate platen. Het totale volume per put moet één milliliter zijn voor een 24-puts plaat en 0,1 milliliter voor een 96-puts plaat.

Schud de platen voorzichtig van zijde naar zijde en voor- en achteruit om een gelijkmatige celdispersie te garanderen en plaats de gezaaide platen in de incubator, schud ze heen en weer en van zijde naar zijde. Bereid media voor definitieve endoderminductie en voor de daaropvolgende differentiatie van levervoorlopercellen zoals beschreven in de tekst. Op dag een van de differentiatie, verwijder het gebruikte medium uit de putten en vervang het door stadium één medium één.

Op dagen twee, drie en vier, verwijder het gebruikte medium en voed elke put met stadium één medium twee. Op dag vijf, fixeer de putten die bedoeld zijn voor definitieve endoderm differentiatieanalyse. Voor de resterende putten, verwijder het gebruikte medium en voed elke put met stam diff levervoorloper medium.

Op dag 10, oogst cellen voor levervoorloper differentiatieanalyse of ga verder met verdere hepatocyte-achtige celdifferentiatie. Om de levervoorloper differentiatieculturen te karakteriseren, gebruik immunokleuring om expressie van specifieke endodermmarkers op dag vijf en levervoorloper specifieke markers op dag tien te detecteren en kwantificeer het percentage HNF4 alfa positieve cellen. Op dag tien, meet ook alfa-foetoproteïne en albumine secretie via ELISA.

Dit protocol werd gebruikt om levervoorlopercellen te differentiëren van zowel humane embryonale stamcellen als humane geïnduceerde pluripotente stamcellen. Op dag vijf van het differentiatieprotocol werd definitieve endoderm specificatie beoordeeld via Sox 17 expressie. In beide cellijnen werd Sox 17 sterk tot uitdrukking gebracht met 80 en 87,8% van Sox 17 positieve cellen voor H9 en P106, respectievelijk.

Op dag 10 vertoonden levervoorlopers een kasseien-achtige morfologie. Bovendien werd levervoorloper specificatie beoordeeld voor HNF4 alfa, AFP, albumine en cytokeratine 19 expressie. Beide levervoorloperculturen drukten foetale levermarkers uit, zoals HNF4 alfa, AFP en CK 19.

Alfa-foetoproteïne secretie werd op dag 10 gedetecteerd in beide cellijnen terwijl albumine secretie niet werd gedetecteerd met ELISA. Celaantalk en levervoorloper differentiatie-efficiëntie werd beoordeeld door HNF4 alfa expressie te kwantificeren. Op dag tien vertoonden levervoorlopers geen significante variabiliteit tussen rijen met meer dan 95 en 97% van HNF4 alfa positieve cellen per put voor H9 en P106, respectievelijk.

Een gelijkmatige celverdeling voorafgaand aan het begin van de differentiatie is essentieel om een homogene populatie levervoorlopercellen te garanderen. Om dit te bereiken, schud de platen voorzichtig van zijde naar zijde en voor- en achteruit om een gelijkmatige celdispersie te garanderen. Levervoorlopercellen geproduceerd door dit protocol kunnen verder worden gedifferentieerd tot hepatocyte-achtige cellen voor andere assays, wat een reproduceerbaar en gestandaardiseerd hulpmiddel biedt voor ziektemodellering of geneesmiddelscreening.