Name: Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Ontdek een voorwaartse genetische screening met EMS-mutagenese en aequorine calciumreporter om nieuwe genen in calciumsignalering bij Arabidopsis te identificeren. Deze methode helpt onderzoekers bij het begrijpen van plantafweer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility voor plantengroei, Bombay Locale voor de videoshoot, en het Department of Biotechnology- eLibrary Consortium voor het verstrekken van toegang tot e-resources. Dit werk werd ondersteund door het Department of Biotechnology, India via het National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; en CSIR-Junior Research Fellowship (aan D.M. en S.M) en Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (naar R.P).

1. EMS mutagenesis en zaadverzameling op basis van één stamboom (1-3 maanden)
<ol><li>Weeg 150 mg zaden (~ 7500) van aequorine voor EMS mutagenesis (M0 zaden). Weeg nog eens 150 mg zaden om te worden gebruikt als een controle.</li>
	<li>Breng de zaden over op een buis van 50 mL en voeg 25 mL ems (v/v) (v/v) (VOOR behandeling) of 25 mL autoclaved water (voor controle) toe. OPMERKING: Ethyl-methaansulfonaat is een chemisch middel voor het mutageniseren van plantaardig materiaal.</li>
	<li>Verzegel de buis met parafilm en wikkel deze in aluminiumfolie. Draai de buis 18 uur overeind bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Laat de zaden te regelen. Verwijder de EMS-oplossing zorgvuldig en gooi deze weg in een afvalcontainer met 1 M NaOH in gelijke volumes (NaOH helpt ems te neutraliseren/inactiveren, waardoor het veilig is om te verwijderen). Gooi het gebruikte plasticgoed weg in een NaOH-oplossing van 1 M. OPMERKING: Na 24 uur moet u de teruggooi verwijderen volgens laboratoriumpraktijken voor gevaarlijke stoffen.</li>
	<li>Was de gemutageniseerde zaden grondig met 40 mL autoclaved water ten minste 8 keer. Gooi EMS met water in een NaOH afvalcontainer zoals hierboven vermeld.</li>
	<li>Voeg voor de laatste wasbeurt 40 mL natriumthiosulfaat van 100 mM toe en spoel 3 keer om sporen van EMS te verwijderen.</li>
	<li>Week de zaden in 40 mL autoclaved water voor ~ 1 uur om EMS diffuus uit zaden en leg ze op filterpapier tot volledig droog.</li>
	<li>Breng de zaden over op een microcentrifugebuis en stratificeer de zaden 2-4 dagen in 4 °C in 40 mL autoclaved water. Dit helpt bij het breken van zaad sluimeren en zorgt voor homogene groei.</li>
	<li>Breng zowel de gemutageniseerde zaden (M0) als de controlezaden over op de bodem (bodemsamenstelling: agropet: soilrite, 1:1) en breng ze over naar groeiruimten met een 16 uur licht/8 uur donkere fotoperiode, een lichtintensiteit van 150 μ·m−2−1 en ~70% relatieve vochtigheid.</li>
	<li>Om te bepalen of mutagenesis succesvol was, op zoek naar verminderde kiemsnelheid en zaailing groei, en chlorofyl sectoring18 (Figuur 1A). Vergelijk de gemutageniseerde planten met de controleplanten om deze fysiologische en ontwikkelingsverschillen te identificeren. LET OP: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt voor het oogsten van zaden van M1 planten. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de single stamboomgebaseerde zaadverzamelingsmethode. Elke M1 plant krijgt een uniek nummer, van A1 tot A3500.</li>
	<li>Houd individueel genummerde planten in stand als afzonderlijke plantenlijnen (figuur 1B).</li>
	<li>Bij rijping oogst u zaden van deze afzonderlijke gemuteerde planten en bewaar deze als afzonderlijke M1-lijnen (figuur 2). Uit de single pedigree-based seed collectie, verkregen we ongeveer 5000 M1 lijnen waarvan 3500 M1 lijnen werden gescreend.</li>
</ol>2. Screening met hoge doorvoer op geselecteerde mutanten (8 maanden)
<ol><li>Identificeer nieuwe mutanten op basis van de Ca2+ reactie op een geselecteerde stimulus. Hier gebruikten we H2O2 als voorbeeld.</li>
	<li>Voor het identificeren van mutanten, het scherm van de M2 generatie. Aangezien recessieve mutanten bij 1/8-frequentie in M2-generatie scheiden op EMS mutagenesis14,beslaat screening van 8-12 M2-segregaterende planten één M1-lijn en identificeert een homozygoot recessieve mutant (met behulp van 12 zaailingen verhoogt de kans op het vinden van een mutant). Test van elke onafhankelijke M1-lijn 12 M2 zaailingen voor Ca2+ respons op H2O2 (12 M2 zaailingen per M1-lijn).</li>
	<li>Gebruik een hoge doorvoer zaad sterilisatie en hydrocultuur plantengroei protocol19. Plaats bijna 12-15 M2 zaden per M1 lijn in individuele putten van een 24-well weefsel kweekplaat en steriliseren met behulp van chloorgas (40 mL van 12% natriumhypochloriet en zoutzuur, 3:1, v/ v) in een desiccator voor 4 uur in een rookkap. Open na de procedure de desiccator en laat 's nachts chloorgas verdampen.</li>
	<li>Breng na sterilisatie platen naar buiten en voeg vloeibare 1/2 MS-media (halfsterkte MS zonder agar) toe aan individuele putten. Verzegel de platen met parafilm en stratificeer de zaden gedurende 2-4 dagen bij 4 °C en verplaats zaden naar een groeikamer met 10 uur licht/ 14 uur donkere fotoperiode bij 20-22 °C met 70% relatieve vochtigheid.</li>
	<li>Zodra de zaailingen zijn 8-12 dagen oud, plaats 12 M2 zaailing van elke lijn individueel in een 96-well luminometer plaat. Voor het meten van Ca2+ respons op H2O2, gebruik een luminometer plaatlezer.</li>
	<li>Voeg na zaailingoverdracht 150 μL 5-10 μM coelentrazineoplossing (verdund in autoclaved water uit een voorraad van 5 mM in methanol) (LET OP) toe in afzonderlijke putten in een donkere/weinig lichtruimte en bewaar deze in het donker bij 21 °C gedurende 8 uur. OPMERKING: Coelentrazine is een prothesegroep die zich bindt aan apo-aequorin en deze reconstrueert tot functioneel aequorin. Coelentrazine is lichtgevoelig en wordt dus opgeslagen in donkergekleurde flessen, beschermd tegen licht.</li>
	<li>De volgende dag voert u mutantenscherm uit met 10 mM H2O2 als stimulus en meet u de daaropvolgende Ca2+ respons.</li>
	<li>Voor gelijktijdige meting van 24 putten, maak een geautomatiseerd kinetisch programma dat de achtergrond meet voor 1 min, gevolgd door stimuli toevoeging (40 μL) en meting gedurende 10 min, gevolgd door totale aequorine ontlading (2 M CaCl2 in 150 μL 20% ethanol) voor 1-2 min. OPMERKING: Een eindontlading voor het totale aequorin is nodig om de gemeten Ca2+ te kwantificeren en als extra controle voor functioneel aequorin. Het einde kwijting is een korte termijn van 1-2 min en veroorzaakt geen significante plantendood. Als alternatief, als de planten sterven na de ontlading stap, dan opnieuw scherm van de specifieke M1 lijn en redding zonder ontlading. Dergelijke mutanten kunnen worden bevestigd in M3 en M4 generaties met behulp van de ontlading stap.</li>
	<li>Gebruik een 24-well formaat scanmethode die elke rij meet in 7 s interval met 300 ms integratietijd per put per meetpunt. Gebruik een wild-type zaailing als controle in elke rij voor vergelijking en evaluatie van de mutant. OPMERKING: Een enkele 96 putplaat met M2 zaailingen zal betrekking hebben op 8 individuele M1 lijn (8 M1* 12 = 96 M2) en kan worden vertoond in 2,5 uur en elke dag 32 M1 lijnen zou worden gescreend, 640 M1 planten per maand. De hele screening procedure nadat de planten klaar zijn zou ongeveer 8 maanden duren.</li>
	<li>Identificeer mutanten op basis van verlies van of verminderde Ca2+ respons met H2O2. Red de geselecteerde mutanten door middel van een op antibiotica gebaseerd wasproces. Was de zaailing twee keer met 25 mg/L cefotaxime-oplossing en breng vervolgens over naar het reddingsmedium dat 25 mg/L cefotaxime bevat in 1/2 MS agar.</li>
	<li>Laat de platen groeien met een 10 uur licht/ 14 uur donkere fotoperiode om een gemuteerde plant te verkrijgen. De cefotaxime wash helpt om schadelijke micro-organismen op de zaailing te verwijderen. Aangezien de zaailingen na de reconstructie niet-verzegeld worden gehouden, minimaliseert u verontreiniging bij het overbrengen naar steriele toestand.</li>
	<li>Breng de gemuteerde plant naar de bodem voor het verkrijgen van de homozygoot M3 populatie.</li>
</ol>3. Gegevensanalyse en identificatie van mutanten (1-3 maanden)
OPMERKING: De metingen van de bovenstaande methode zijn in relatieve lichteenheden (RLU).
<ol><li>Gebruik voor de berekening van decytconcentratie [Ca2+] de volgende concentratievergelijking20. pCa = 0,332588(−log (L/Lmax))+ 5,5593 Luminescentie telt () en het totale resterende aantal(max).</li>
	<li>Converteer de verkregen pCa-waarden naar [Ca2+]cytwaarden in μM door te vermenigvuldigen met 106. Vervolgens grafisch plot tegen een aequorin (transgene Col-0 aequorin) controle voor het identificeren van vermeende H2O2 mutanten ca2 + reactie.</li>
	<li>Redding zaailingen met een verlies van of verminderde reactie op H2O2 applicatie gered.</li>
	<li>Bij rijping, oogst zaden van de geredde mutant en opnieuw screenen op reactie op H2O2 in M3 zaailingen. Als alle 12 M3 zaailingen een Ca2+ respons vertonen vergelijkbaar met de moederplant, beschouw de populatie dan als een homozygoot M3 mutant populatie. Als alle 12 zaailingen een dergelijke reactie niet vertonen, neem ze dan mee naar M4-generatie en opnieuw te screenen om homozygoot populatie te verkrijgen.</li>
	<li>Zodra een homozygoot plantenlijn is verkregen, identificeert u het gen dat leidt tot gewijzigd fenotype met behulp van de volgende generatie sequencing.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+The+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: The lead currency of plant information processing.</a> The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Wasternack, C., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonates%3A+biosynthesis%2C+perception%2C+signal+transduction+and+action+in+plant+stress+response%2C+growth+and+development.+An+update+to+the+2007+review+in+Annals+of+Botany%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany.</a> Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).</li>
<li>Kiep, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cytosolic+Ca2%2B+elevation+is+activated+upon+wounding+and+herbivory+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+Luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>White, P. J., Broadley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Calcium in plants.</a> Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).</li>
<li>Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+impaired+in+intracellular+calcium+elevation+is+sensitive+to+biotic+and+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).</li>
<li>Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The language of calcium signaling.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).</li>
<li>Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+calcium+signalling+and+early+signalling+elements+during+defence+responses+to+microbe-+or+damage-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns.</a> The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).</li>
<li>Downie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals+in+plant+immunity%3A+a+spiky+issue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium signals in plant immunity: a spiky issue.</a> New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).</li>
<li>Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+interplay+of+Ca2%2B+and+ROS+signaling+in+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response.</a> Plant Science. 283, 343-354 (2019).</li>
<li>McAnish, M. R., Pittman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+calcium+signature%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Shaping the calcium signature.</a> New Phytologist. 181, 275-294 (2009).</li>
<li>Colbert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-throughput+screening+for+induced+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">High -throughput screening for induced point mutations.</a> Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).</li>
<li>Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoornneef%2C+M+%22Molecular+Plant+Biology%22">Molecular Plant Biology</a>. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).</li>
<li>Page, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+K+%22G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+in+Plants.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).</li>
<li>Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+aequorin+monitors+cytosolic+calcium+transients+in+soybean+cells+challenged+with+beta-glucan+or+chitin+elicitors%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors.</a> Planta. 207 (4), 566-574 (1999).</li>
<li>Arisha, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methane+sulfonate+induced+mutations+in+M2+generation+and+physiological+variations+in+M1+generation+of+peppers+%28Capsicum+annuum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.).</a> Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Rentel, M. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+calcium+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).</li>
<li>Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagenesis+of+seed+and+vegetatively+propagated+plants+using+EMS%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).</li>
<li>Espina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Phenotypic+Screening+of+an+Ethyl+Methane+Sulfonate+Mutant+Population+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetics+in+Arabidopsis%3A+Finding+Mutations+that+Cause+Particular+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).</li>
<li>Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaple%2C+J+%22Circadian+Rhythms.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology</a>. Rosato, E. , 362(2007).</li>
<li>Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQu%2C+LJ+%22Arabidopsis+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).</li>
<li>Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeyser%2C+HMO+%22Arabidopsis%3A+the+Complete+Guide+%28Electronic+v.+1.4%29%22">Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4)</a>. Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).</li>
<li>Pauly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+together+with+the+cytosol+generates+patterns+of+specific+cellular+calcium+signatures+in+tobacco+suspension+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells.</a> Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).</li>
<li>Mithöfer, A., Mazars, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+measurements+of+intracellular+Ca2%2B-signatures+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells.</a> Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).</li>
<li>Mehlmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signatures+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation.</a> The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).</li>
<li>Sello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Ca2%2B+fluxes+into+and+across+thylakoids+revealed+by+thylakoid-targeted+aequorin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes.</a> Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-localized+BICAT+proteins+shape+stromal+calcium+signals+and+are+required+for+efficient+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis.</a> New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+receptor+for+extracellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant receptor for extracellular ATP.</a> Science. 343 (6168), 290-294 (2014).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCA1+mediates+osmotic-stress-evoked+Ca2%2B+increases+vital+for+osmosensing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis.</a> Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

EMS mutagenesis is een krachtig hulpmiddel om mutaties in de bevolking te genereren. De klassieke voorwaartse genetische schermen met EMS zijn een effectief instrument geweest om nieuwe genen te identificeren om twee belangrijke redenen: ten eerste vereisen ze geen eerdere veronderstellingen over de genidentiteit en ten tweede introduceren ze geen vooringenomenheid. Er zijn verschillende methoden om een screening populaties zoals EMS, T-DNA inserties, straling etc. genereren. Van alle methoden heeft ems-gebaseerde mutage...

Een verandering in cytosolic calcium (Ca2+) concentratie op de perceptie van biotische of abiotische stimulus is een goed bestudeerde vroege signalering gebeurtenis die veel signalering trajectenactiveert 1,2,3,4. Een cel in zijn basale rusttoestand behoudt een lagere Ca2+ concentratie in de cytosol en sekwestreert overtollige Ca2+ in verschillende intracellulaire organellen en extracellulaire apoplast die leidt tot een steile Ca2+ hellingsgraad 5,6. Bij signaalperceptie stijgen ca2+ niveaus in de cytosol als gevolg van een toestroom van Ca2+ uit extracellulaire en/of intracellulaire bronnen en genereren ze een stimulispecifieke calciumsignatuur7,8,9. Ca2+ verhogingen in de cytosol worden geactiveerd door vele stimuli, maar de specificiteit wordt gehandhaafd door verschillende winkels die Ca2+vrijgeven, een unieke Ca2+ handtekening en geschikte sensoreiwitten10,11.
Het gebruik van alkylaatmiddel, ethyl-methaansulfonaat (EMS) voor mutagenesis is een krachtig hulpmiddel in klassieke voorwaartse genetische schermen om meerdere onafhankelijke genen te identificeren die betrokken zijn bij een proces. EMS is een chemische mutageen die voornamelijk C tot T en G naar A leidt, willekeurig door het genoom en produceert een verandering van 1 bp in elke 125 kb van het genoom. EMS mutagenesis zal leiden tot ≈1000 single base pair veranderingen, hetzij inbrengen / schrappingen (InDel) of single nucleotide polymorfisme (SNP) per genoom12. EMS-geïnduceerde mutaties zijn meervoudige puntmutaties met een mutatiefrequentie variërend van 1/300 tot 1/30000 per locus. Dit vermindert het aantal M1 planten die nodig zijn om een mutatie in een bepaald gen te vinden. Een M1 zaadpopulatie bereik van 2000-3000 wordt meestal gebruikt om mutaties van belang in Arabidopsis thaliana13,14te verkrijgen .
Aequorin transgenics zijn Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planten uitdrukken p35S-apoaequorin (pMAQ2) in de cytosol15. Aequorin is een Ca2+ bindend eiwit bestaande uit apoproteïne en een prothetische groep bestaande uit luciferine molecuul, coelenterazine. De binding van Ca2+ aan aequorin, dat drie Ca2+ bindende EF-hands sites heeft, resulteert in coelenterazine wordt geoxideerd en cyclized om de dioxetanon intermediair te geven, gevolgd door een conformatieverandering van het eiwit vergezeld van het vrijkomen van kooldioxide en singlet-opgewonden coelenteramide16. De aldus geproduceerde coelenteramide zendt een blauw licht (λmax, 470 nm) uit dat kan worden gedetecteerd door de luminometer17. De extreem snelle Ca2+ verhogingen kunnen dus in real time worden gemeten en worden benut voor snelle voorwaartse genetische schermen. Dit protocol is bedoeld om de specificiteit van calciumrespons te gebruiken om nieuwe belangrijke spelers te identificeren die betrokken zijn bij de Ca2+ handtekening. Om deze taak te volbrengen, gebruiken we EMS mutagenesis in transgene aequorine en identificeren we de SNPs die zijn gekoppeld aan gewijzigde Ca2+ signalering. Het protocol identificeert mutanten die geen of verminderde Ca2+ verhogingen vertonen bij toevoeging van stimuli. Deze mutanten kunnen vervolgens in kaart worden gebracht om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de Ca2+ respons. De methode is van toepassing op elke vorm van vloeibare stimuli in planten die resulteert in een Ca2 + hoogte. Aangezien Ca2 + hoogte is een van de eerste reacties in de plant verdediging signalering traject, de identificatie van upstream respons componenten kunnen kandidaten voor genetische manipulatie om veerkrachtige planten te ontwikkelen.

<table><tbody><tr><td>24 well tissue culture plate</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>voor het kweken van zaailingen</td></tr><tr><td>96 well white cliniplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>voor luminometer metingen</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>voor plantengroei</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>voor ontlaaddoplossing</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>prothetische groep voor aequorin</td></tr><tr><td>Ehtylmethane sulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>voor zaadmutagenese</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Analytisch reagens</td><td>1170</td><td>voor ontlaaddoplossing</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>steriliseringsoplossing</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>15465</td><td>als stimulus voor calciumverhoging</td></tr><tr><td>Luminoskan ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5300172</td><td>aequorin luminescentiemeting</td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>Himedia</td><td>RM1128-100G</td><td>plantengroei</td></tr><tr><td>Murashige en Skoog media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>plantengroei</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>voor het neutraliseren van EMS</td></tr><tr><td>Natriumhypochloriet</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>steriliseringsoplossing</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>voor zaadwassing in stap 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>voor plantengroei</td></tr><tr><td>Vierkante potten</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>voor plantengroei</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>plantengroei</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td>voor zaailingredding</td></tr></tbody></table>

forward genetisch scherm met behulp van transgene calcium reporter aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Voorwaartse genetische schermen zijn belangrijke instrumenten geweest bij de onbevooroordeelde identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij verschillende biologische trajecten. De basis van het scherm is het genereren van een mutant populatie die kan worden gescreend met een fenotype van belang. EMS (ethylmethaansulfonaat) is een veelgebruikt alkylaatmiddel voor het induceren van willekeurige mutatie in een klassiek voorwaarts genetisch scherm om meerdere genen te identificeren die betrokken zijn bij een bepaald proces. Cytosolic calcium (Ca2 +) hoogte is een belangrijke vroege signalering traject dat wordt geactiveerd op stress perceptie. Maar de identiteit van receptoren, kanalen, pompen en transporters van Ca2 + is nog steeds ongrijpbaar in veel studiesystemen. Aequorin is een cellulair calcium reporter eiwit geïsoleerd van Aequorea victoria en stabiel uitgedrukt in Arabidopsis. Door dit te benutten, ontwierpen we een voorwaarts genetisch scherm waarin we ems-mutagenized de aequorine transgene. De zaden van de gemuteerde planten werden verzameld (M1) en screening op het fenotype van belang werd uitgevoerd in de segregatie (M2) populatie. Met behulp van een 96-well high-throughput Ca2+ meetprotocol kunnen verschillende nieuwe mutanten worden geïdentificeerd die een wisselende calciumrespons hebben en in realtime worden gemeten. De mutanten met het fenotype van belang worden gered en gepropageerd tot een homozygoot gemuteerde plantenpopulatie wordt verkregen. Dit protocol biedt een methode voor voorwaartse genetische schermen in Ca2 + reporter achtergrond en identificeren van nieuwe Ca2 + gereguleerde doelen.

De EMS-populatie werd gescreend op H2O2 geïnduceerde Ca2+ hoogte. Zoals eerder besproken, 12 individuele M2 zaailingen werden gescreend van elke M1 lijn. In figuur 3wordt een dergelijke M1-lijn uitgezet met elk paneel met 12 individuele M2 zaailingen. Een wild-type aequorin wordt gebruikt als controle voor het vergelijken en evalueren van de mutant respons. Een recessieve mutant scheidt in de verhouding van 1:7 (mut...

Een voorwaarts genetisch scherm op basis van Ca2 + hoogte als een read-out leidt tot de identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij calcium afhankelijke signalering trajecten in planten.

Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Het doel van dit protocol is het identificeren van een methode die kan worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe genen die betrokken zijn bij calciumsignalering. Hiervoor gebruiken we het klassieke voorwaartse genetische scherm. Calcium signalering is een belangrijke verdediging reactie traject in verschillende plant systemen.Om de genen die betrokken zijn bij dit traject te identificeren, hebben we het klassieke voorwaartse genetische scherm gebruikt. Bij deze methode zou EMS worden gebruikt als een alkylating agent om willekeurige mutaties in de plant systemen te introduceren. De ontwikkelde mutantgeneratie kan vervolgens worden gebruikt voor screening op een fenotype van belang.Zodra het fenotype van belang is geïdentificeerd, kan het oorzakelijk gen in kaart worden gebracht. In deze studie gebruiken we de modelplant Arabidopsis die de calciumverslaggever aequorin in zijn spectrum heeft. Weeg 150 mg zaden van aequorine voor EMS mutagenesis en nog eens 150 mg zaden te gebruiken als controle.Breng de zaden over in een Falcon tube van 50 ml en voeg 2%EMS of autoclaved water toe. Wees tijdens het gebruik van EMS voorzichtig, want het is kankerverwekkend. Beschermende tuig moet worden gedragen tijdens het gebruik van EMS en elke vorm van morsen moet worden voorkomen.Verzegel de Falcon buizen met paraffine en wikkel het aluminiumfolie. Draai de buis 18 uur lang op kamertemperatuur. Laat de zaden zich goed nestelen en verwijder de EMS-oplossing zorgvuldig en gooi deze weg in een afvalcontainer met één kies NaOH.Was de gemutageniseerde zaden minstens acht keer grondig met 40 ml automatisch gelavend water. Voeg voor de laatste wasbeurt 100 millimolar natriumthiosulfaat toe en spoel minstens drie keer om sporen van EMS te verwijderen. Week de zaden in 40 ml autoclaved water gedurende een uur om EMS uit de zaden te verspreiden en leg ze vervolgens op Whatman papier tot het volledig droog is.Breng de zaden naar Eppendorf en broed op vier graden Celsius gedurende twee tot vier dagen voor stratificatie. Breng zowel de gemutageniseerde zaden als met water behandelde zaden over op de grond en breng ze over naar groeiruimten met een licht- en acht uur durende donkere fotoperiode bij 22 graden Celsius en een relatieve luchtvochtigheid van 70%. Om te bepalen of mutagenesis succesvol was, op zoek naar chlorofyl sectoring.We hebben gebruik gemaakt van de single stamboom-gebaseerde zaad collectie methode en elke M1 plant krijgt een uniek nummer. Bij rijping worden zaden geoogst uit deze individuele gemuteerde planten en opgeslagen als individuele M1-lijnen. Een hoge doorvoer zaad sterilisatie en hydrocultuur plant wortel protocol wordt gebruikt, aangepast van Ranf et al.Plaats op dag één bijna 12 tot 15 M2 zaden per M1 één regel in afzonderlijke putten van een 24-bron weefselkweekplaat en steriliseer met natriumhypochloriet en zoutzuuroplossing met een verhouding van drie is op één. Dit geeft chloorgas af dat de zaden steriliseert. Laat de plaat 's nachts om het resterende chloorgas volledig te verdampen.Voeg na sterilisatie de halfsterke MS-media toe aan individuele putten en stratificeer de zaden twee tot vier dagen bij vier graden Celsius en verplaats de zaden vervolgens naar een groeikamer met fotoperiode van 10-uurs licht en 14-uurs donker bij 22 graden Celsius, 70% relatieve vochtigheid. Op dag 14, zodra de zaailingen acht tot 12 dagen oud zijn, plaats 12 M2 zaailingen van elke lijn afzonderlijk in een 96-well luminometerplaat. Voeg na zaailingoverdracht 150 microliter van vijf micromolar Coelenterazine-oplossing toe in afzonderlijke putten en bewaar deze acht uur lang in het donker bij 21 graden Celsius.Coelenterazine is een prothesegroep die zich bindt aan apoaequorin om functionele aequorine te vormen. Coelenterazine is lichtgevoelig en wordt daarom opgeslagen in donkergekleurde flessen beschermd tegen licht. Volgende dag, screen mutanten met behulp van waterstofperoxide als stimulus en meten latere calcium hoogte.Voor gelijktijdige meting van 24 putten wordt een uit geautomatiseerd kinetisch programma gemaakt, dat het meten van de achtergrond gedurende één minuut omvat, gevolgd door stimulustoevoeling en meting gedurende 10 minuten, gevolgd door ontladingsinjectie 150 microliter en meting gedurende drie tot vijf minuten. En elke lozing voor de dochter aequorin zou worden opgenomen in de lezing om de gemeten calcium te kwantificeren en als extra controle voor functionele aequorin. De metingen van de bovenstaande methode zijn in relatieve lichteenheden.Voor de berekening van de cytosolische calciumionenconcentratie wordt een eerder beschreven concentratievergelijking gebruikt die Rental and Knight in 2004 gaf, wat wordt beschreven in het protocol. De RLUs verkregen uit luminometer worden toegevoegd aan de vergelijking om de calciumionconcentratie te berekenen. De verkregen cytosolische calciumionenwaarden worden vervolgens grafisch uitgezet tegen een wild-type controle voor het identificeren van vermeende waterstofperoxide mutanten aan calcium respons.Dit is een representatief resultaat van het getoonde protocol. We hebben een M1-lijn met 12 individuele zaailingen getoond die zijn gemeten voor de verhoging van de calciumionconcentratie. Groene lijn in de grafiek geeft wild-type aequorin die werd gemeten samen met mutanten.Rood is gemiddeld van alle 12 zaailingen, en zwarte lijn is individuele M2 zaailingen gemeten voor de calcium ionen hoogte. Zaailingen met een sterk verminderde respons op waterstofperoxide toepassing worden vervolgens gered. Geredde mutanten worden vervolgens opnieuw bevestigd in de volgende generatie, gevolgd door mapping om causale genen te identificeren.Voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van EMS als mutageen, omdat het een kankerverwekkende stof is. Beschermende gearing moet te allen tijde worden gedragen en eventuele morsen moet worden behandeld met goede laboratoriumpraktijken. Bovendien moeten bij het doen van een stamboomgebaseerde verzameling zaden, individuele planten met de grootste zorg worden geoogst, zodat er in geen enkel stadium zaden worden gemengd.Dit zal helpen om terug te gaan en de moeder plant, dat is de homozygoot mutant plant te traceren. Bovendien, aangezien deze methode geen bias of eerdere veronderstellingen in de screeningsmethode introduceert, kan het voor een of meer voorwaarden worden gebruikt om een fenotype van belang te identificeren. Daarnaast kunnen ook meerdere onafhankelijke genen worden geïdentificeerd met behulp van hetzelfde protocol.Het protocol is gemakkelijk te gebruiken, omdat met de kleine dosering, een groot aantal planten kan worden mutagenized. Dit enorme aantal gemuteerde planten kan worden gebruikt voor verschillende populaties en voor verschillende aandoeningen en om verschillende genen te identificeren. Een gedeeltelijk functieverlies, een gewijzigde functie, een volledig functieverlies of ook constitutieve genfunctie kunnen via deze methode worden geïdentificeerd.In kaart brengen moet een gemakkelijke taak zijn gezien de vooruitgang in het in kaart brengen van technologieën in de huidige scenario's. Een de novo-gebaseerde mapping systeem, een SNP-gebaseerde racial plotting en vele anderen kunnen worden gebruikt om het oorzakelijke gen waardoor het fenotype van belang te identificeren. Gezien de toepasbaarheid van deze methode, kan het niet alleen worden gebruikt op de Arabidopsis model planten, maar ook andere modelplanten op voorwaarde dat een fenotype van belang uitlezing kan worden vastgesteld.

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en...

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux...

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

Het huidige protocol beschrijft volledig optische controle en observatie van geactiveerde cellulaire activiteit in iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) voor high-throughput geneesmiddelenscreening en toxiciteitstests. Multiparametrische kwantificering van fenotypische patronen in tijd en ruimte worden getoond. Langetermijneffecten van geneesmiddelen gedurende uren, of opeenvolgende metingen gedurende dagen, worden aangetoond.

High-Throughput optische controle en opname calciumsignaal in iPSC-afgeleide cardiomyocyten voor toxiciteitstests en fenotypische geneesmiddelenscreening

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Ontdek een voorwaartse genetische screening met EMS-mutagenese en aequorine calciumreporter om nieuwe genen in calciumsignalering bij Arabidopsis te identificeren. Deze methode helpt onderzoekers bij het begrijpen van plantafweer.

Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering (Video) | JoVE Journal

Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering

Meer video's verkennen