Een verbeterd protocol om te zuiveren en direct Mono-Biotinylaat Recombinant BDNF in een tube voor cellulaire trafficking studies in neuronen

Het algemene doel van deze procedure is het produceren en zuiveren van BDNF oviduct in een geoptimaliseerd protocol met transfectie van HEK293 cellen en zuivering in een chromatografiekolom. De BDNF oviduct wordt vervolgens mono-biotinylated door een in vitro reactie voor posterior etikettering en detectie door fluorescentie microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat het de productie, zuivering en mono-biotinylation van BDNF op een geoptimaliseerde manier mogelijk maakt.

De zwangerschapsparameters zijn geoptimaliseerd voor maximale BDNF-productie met behulp van een kosteneffectief transfectiereagemiddel en het zuiveringsproces wordt uitgevoerd in een chromatografie-opstelling die manipulatie vergemakkelijkt en de procedure laat escaleren. Begin met het verdunnen van 60 microgram polyethyleen in 500 microliter van niet-aangevuld DMEM en 20 microgram BDNF oviduct plasmid in 500 microliters van niet-aangevulde DMEM per 15 centimeter schotel te worden doorsneden. Vijf minuten lang incuren bij kamertemperatuur en vervolgens de DNA-oplossing zorgvuldig in een polyethyleenbuis spuiten, waarbij u eenmaal omhoog/omlaag beweegt.

Incubeer gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur en druppel vervolgens een milliliter van het PEI/DNA-mengsel door elke schotel van 15 centimeter. Incubeer de cellen met het PEI/DNA-mengsel gedurende drie uur en verander vervolgens de medium-incubatiebuffer. 48 uur na de transfectie van de cellen, het verzamelen van het medium van alle gerechten.

Voeg vervolgens de bdnf-medium componenten toe aan de HEK293-supernatant, waaronder natriumchloride, fosfaatbuffers, imidazool en proteaseremmers. Incubeer in ijs gedurende 15 minuten. Dan aliquot het medium in centrifuge buizen.

Centrifuge gedurende 45 minuten op 10.000 g in een vier graden Celsius goudcentrifuge. Deze stap maakt de eliminatie van celpuin en dode cellen opgehangen in de media. Verzamel dan de supernatants.

Voeg BSA toe bij een laatste concentratie van 0,1% en bewaar maximaal twee maanden bij min 20 graden Celsius. Om het BDNF te zuiveren, begin met het ontdooien van de media in een 37 graden Celsius thermogereguleerd bad. Dan aliquot de media in centrifuge buizen.

Centrifuge voor een uur op 3, 500 g in een vier graden Celsius goudcentrifuge. Deze stap maakt het mogelijk de eliminatie van resterende puin om een adequate doorstroming door de chromatografie kolom te garanderen. Gebruik vervolgens de eiwitconcentrators om de media te verminderen van 500 milliliter tot 100 milliliter.

Volg de aanbevolen centrifugatieparameters van de fabrikant voor een optimale concentratie. Voeg vervolgens 500 microliters nikkel-NTA agarose kralen toe aan de geconcentreerde media en broeder 's nachts in een tuimelschakelaar bij vier graden Celsius. De volgende dag, monteer de chromatografie apparaat en giet de media in.

Laat het vijf minuten rusten en open dan de twee-weg stop pik om het medium door te laten stromen. Was met vijf milliliter wasbuffer gedurende vijf minuten om ervoor te zorgen dat de kralen in de kolom opnieuw worden opgetrokken. Herhaal dit drie keer.

Voeg ten slotte een milliliter elutiebuffer toe aan de kolom om de kralen opnieuw te plaatsen. Incubeer gedurende 15 minuten en verzamel het eluent in een microcentrifugebuis. Herhaal deze stap drie keer voor volledige elutie van BDNF.

Om het BDNF biotinylaat te biotinyëren, neem je een aliquot met 800 nanogram van het eiwit en voeg je het biotinylation buffer reagens en vervolgens wat BirA-GST toe in een één-op-één molaire relatie met BDNF. Incubeer in een hybridisatieoven op 30 graden Celsius gedurende 60 minuten, het mengen van de inhoud van de buis om de 15 minuten door inversie. Voeg vervolgens hetzelfde volume ATP en BirA-GST toe als in de eerste stap en broed gedurende 60 minuten in, waarbij de inhoud van de buis elke 15 minuten wordt gemengd.

De biotinylated BDNF kan vervolgens worden overgelaten in ijs voor onmiddellijke biotinylation verificatie of opgeslagen bij min 80 graden Celsius voor achterste analyse. Om de biotinylation van het BDNF-eivlies te verifiëren, begin met het blokkeren van 30 microliter streptavidin magnetische kralen per BDNF-monster in een blokkeringsbuffer. Een uur lang incubeeren bij kamertemperatuur en vervolgens de magnetische kralen in een magnetische rackafscheider neerslaan en gooi vervolgens de blokkeringsbuffer weg.

Voeg 50 microliter verse blokkeringsbuffer en het BDNF-monster toe aan de kralen, om ze volledig te laten hersuspend. Homogenize de inhoud van de buis en incubeer op vier graden Celsius gedurende een uur in een microcentrifuge buis rotator. Bereid het monster voor op westerse blotting zoals beschreven in de tekst om de efficiëntie van de biotinylation reactie te beoordelen.

Om de BDNF-oviduct te vervoegen aan de quantum dots, begin met het toevoegen van het benodigde volume van quantum dots om een één-op-één molaire relatie met BDNF te bereiken en vervolgens te verdunnen tot een eindvolume van 20 microliters. Homogenize de inhoud van de buis en wikkel het in aluminiumfolie om het te beschermen tegen het licht. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in een rocker.

Verdun vervolgens de BDNF-oviduct tot de gewenste uiteindelijke concentratie en voeg het toe aan het axonale compartiment van een microfluïde kamer, dat gedurende 210 minuten uitbroedt voor achterste live of vaste celbeeldvorming. Het gebruik van een chromatografie kolom gebaseerd protocol maakt de verwerking van aanzienlijke volumes van HEK293 geconditioneerde media. In dit experiment, 500 milliliter geconditioneerde media werden verwerkt om BDNF oviduct te zuiveren.

Vier opeenvolgende elutions van elk 15 minuten leverden afnemende concentraties BDNF-oviduct op, variërend van zes tot 28 nanogram per microliter. De totale opbrengst bedroeg ongeveer 60 microgram BDNF oviduct. Deze gezuiverde BDNF werd vervolgens biotinylated door een in vitro reactie bemiddeld door BirA-GST.

Het monster werd homogeen biotinylated zoals aangetoond door het ontbreken van niet-biotinylated BDNF oviduct in de supernatant van de magnetische kraal gewistbuffer. Deze resultaten tonen aan dat het voorgestelde protocol het mogelijk maakt aanzienlijke hoeveelheden BDNF-oviduct en homogene in vitro mono-biotinylation te zuiveren. Vervolgens werd de biologische activiteit van het mono-biotinylated BDNF geëvalueerd met behulp van twee verschillende experimentele benaderingen.

Ten eerste werden corticale neuronen gezaaid in 60 millimeter platen gestimuleerd met 50 nanogram per milliliter mono-biotinylated BDNF gedurende 30 minuten en vervolgens werden eiwitten voorbereid voor westerse vlekanalyse. De biologische activiteit van het mono-biotinylated BDNF werd gekwantificeerd door het detecteren van fosfo-TrkB en fosfo-ERK. Binding van BDNF aan TrkB activeert de automatische fosforylatie van de receptor en de activering van verschillende downstream kinases waaronder ERK.

Een negatieve controlevoorwaarde die niet werd gestimuleerd met BDNF en een positieve controlevoorwaarde die werd gestimuleerd met commercieel verkrijgbaar BDNF werden opgenomen voor de analyse van bdnf oviduct biologische activiteit. De banden waren beide fosforyleerde eiwitten, hadden een vergelijkbare intensiteit in neuronen behandeld met commerciële BDNF en mono-biotinylated BDNF, en beide toonden een sterker signaal dan de negatieve controle voorwaarde. Vervolgens werd de biologische activiteit van mono-biotinylated BDNF gekoppeld aan streptavidin quantum dots geëvalueerd om aan te tonen dat ze kunnen worden gebruikt in live imaging experimenten.

Corticale neuronen werden gezaaid in 10 millimeter covers en behandeld met een laatste concentratie van 200 picomolar of twee nanomolar BDNF quantum dots gedurende 30 minuten voor de vaststelling en kleuring voor fosfo-CREB. CREB is een transcriptiefactor die het doelwit is van geactiveerde ERK12 in corticale neuronen. Stimulerende neuronen met toenemende concentraties van BDNF quantum dots resulteerde in een dosis-afhankelijke toename van de fosforylatie van CREB en de aanwezigheid van quantum dot deeltjes rond de kern wat aangeeft dat de BDNF quantum dot deeltjes werden geïndocyeerd en geactiveerd de activering van signalering trajecten geassocieerd met BDNF-gemedieerde TrkB activering.

Een tweevoudige toename van fosfo-CREB signaal werd gedetecteerd bij het stimuleren van neuronen met 200 picomolar BDNF quantum dots, terwijl stimuleren met twee nanomolar BDNF quantum dots resulteerde in een 3,5-voudige toename van de fosfo-CREB signaal. Daarom is de biotinylated BDNF oviduct biologisch actief en verliest het zijn activiteit niet wanneer gekoppeld aan streptavidin quantum dots waardoor het geschikt is voor immunofluorescentie en live celbeeldvorming. Ten slotte werd het beeldvormingspotentieel van BDNF-quantum dots geëvalueerd in gecompartimenteerde culturen met behulp van microfluïde kamers.

Corticale neuronen werden gezaaid in microfluïde kamers om de axonale en somatodendritische compartimenten te scheiden en werden gestimuleerd met twee nanomolar BDNF quantum dots gedurende 3,5 uur. Live celmicroscopie werd uitgevoerd en de resulterende kymografen werden gebruikt om de snelheid van BDNF quantum dot met organellen te kwantificeren. Er werd een gemiddelde voortschrijdende snelheid van 0,91 micrometer per seconde gedetecteerd, wat in overeenstemming is met eerdere analyse van cytoplasmisch thymine-gemedieerd transport.

Microfluïde kamers behandeld met twee nanomolar streptavidin quantum dots toonde geen bewegende quantum dots in de microgroepen, zoals blijkt uit de kymograaf. Cellen geteeld onder dezelfde omstandigheden werden gestimuleerd met 500 picomolar of twee nanomolar BDNF quantum dots voor 210 minuten en vervolgens vastgesteld en gelabeld met een nucleaire vlek. Neuronen behandeld met BDNF quantum dots tonen een dosis-afhankelijke accumulatie van het gelabelde eiwit in alle geanalyseerde subcompartimenten, waaronder de proximale en distale delen van de microgroep en het somatodendritische compartiment.

In tegenstelling, controle neuronen toonde bijna geen quantum dot signaal in de kamer. Daarom kan de BDNF-quantumdot worden gedetecteerd in levende en vaste cellen in microfluïde kamers. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe mono-biotinylated BDNF oviduct produceren in een chromatografie kolom-gebaseerde kosteneffectieve procedure.