Name: Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer neurofilamenttransport analyseren in gemyeliniseerde axonen van transgene muizen met fluorescentiemicroscopie. Deze methode meet richting en snelheid van transport in geïsoleerde zenuwsegmenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Paula Monsma bedanken voor instructie en hulp met confocale microscopie en scheenbeen zenuwdissectie en Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger en Sana Chahande voor hulp bij de muishouderij. Dit werk werd mede ondersteund door collaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 aan A.B. en IOS1656765 naar P.J., en National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 en S10 OD010383 naar A.B. N.P.B. werd ondersteund door een fellowship van het Postdoctoral Scholars Program van de Ohio State University President.

<ol><li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li>
<li>Brown, A. Slow Axonal Transport. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+A+%22Reference+Module+in+Biomedical+Sciences%22">Reference Module in Biomedical Sciences</a>. , (2014).</li>
<li>Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li>
<li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li>
<li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li>
<li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li>
<li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li>
<li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li>
<li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li>
<li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).</li>
<li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li>
<li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD%28P%29H+and+flavoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li>
<li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li>
<li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li>
<li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li>
<li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).</li>
<li>Cohen, J. The effect size index: d. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+Power+Analysis+for+the+Behavioral+Sciences+2nd+ed%22">Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed</a>. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li>
<li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+%22P301L%22+tau+knockin+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li>
<li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li>
<li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er moet aandacht worden besreed bij de analyse van puls-escape en pulse-spread experimenten omdat er een aanzienlijk potentieel is voor de invoering van fouten tijdens de nabewerking, voornamelijk tijdens de vlakke veldcorrectie, beelduitlijning en bleekmiddelcorrectie. Correctie op vlak veld is noodzakelijk om te corrigeren voor niet-uniformiteit in de verlichting, wat resulteert in een val in intensiteit over het gezichtsveld van centrum naar periferie. De mate van niet-uniformiteit is golflengteafhankelijk en moet dus...

Het axonale transport van neurofilamenten werd voor het eerst gedemonstreerd in de jaren 1970 door radio-isotopen pulse-labeling1. Deze aanpak heeft een schat aan informatie opgeleverd over neurofilament transport in vivo, maar het heeft een relatief lage ruimtelijke en temporele resolutie, meestal in de orde van millimeters en dagen op zijn best2. Bovendien is radio-isotopenpulslabeling een indirecte benadering die de injectie en het offer van meerdere dieren vereist om een eenmalige cursus te genereren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en vooruitgang in fluorescentiemicroscopie in de jaren 1990, werd het vervolgens mogelijk om neurofilament transport direct in gekweekte neuronen beeld op een tijdschaal van seconden of minuten en met sub-micrometer ruimtelijke resolutie, waardoor veel meer inzicht in het mechanisme van beweging3. Deze studies hebben aangetoond dat neurofilament polymeren in axonen snel en met tussenpozen bewegen in zowel anterograde als retrograde richtingen langs microtubulisporen, aangedreven door microtubuli motorische eiwitten. Echter, neurofilamenten zijn diffractie-beperkte structuren slechts 10 nm in diameter die meestal zijn verdeeld afgezien van hun buren door slechts tientallen nanometer; daarom kunnen de polymeren alleen worden gevolgd in gekweekte neuronen die schaars verdeelde neurofilamenten bevatten, zodat de bewegende polymeren kunnen worden opgelost van hun buren4. Zo is het momenteel niet mogelijk om enkele neurofilamenten in axonen te volgen die overvloedige neurofilament polymeren bevatten, zoals gesedineerde axonen.
Om het axale transport van neurofilamenten in neurofilamentrijke axonen te analyseren met behulp van fluorescentiemicroscopie, gebruiken we een fluorescentie fotoactivatie pulse-escape methode die we ontwikkelden om het langdurige pauzegedrag van neurofilamenten in gekweekte zenuwcellen4,5te bestuderen. Neurofilamenten gelabeld met een fotoactivatable fluorescerende neurofilament fusie-eiwit worden geactiveerd in een kort segment van axon, en vervolgens wordt de snelheid van vertrek van die filamenten uit het geactiveerde gebied gekwantificeerd door het fluorescentieverval in de loop van de tijd te meten. Het voordeel van deze aanpak is dat het een populatie-niveau analyse van neurofilament transport dat kan worden toegepast op een tijdschaal van minuten of uren zonder de noodzaak om de beweging van individuele neurofilament polymeren volgen. We hebben deze methode bijvoorbeeld gebruikt om de kinetiek van neurofilamenttransport in myelineculturen te analyseren6.
Onlangs hebben we beschreven de ontwikkeling van een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die lage niveaus van een paGFP-tagged neurofilament eiwit M (paGFP-NFM) in neuronen onder de controle van de menselijke neuron-specifieke Thy1 promotor7uitdrukt. Deze muis maakt de analyse van neurofilament transport in situ met behulp van fluorescentie microscopie. In dit artikel beschrijven we de experimentele benaderingen voor het analyseren van neurofilamenttransport in geïhileerde axonen van scheenzuwen van deze muizen met behulp van twee benaderingen. De eerste van deze benaderingen is de hierboven beschreven puls-escape methode. Deze methode kan informatie genereren over het pauzeren van gedrag van de neurofilamenten, maar is blind voor de richting waarin de filamenten het geactiveerde gebied verlaten, en laat daarom geen meting van de netto directionaliteit en transportsnelheid8toe. De tweede van deze benaderingen is een nieuwe puls-spread methode waarbij we analyseren niet alleen het verlies van fluorescentie uit de geactiveerde regio, maar ook de voorbijgaande toename van fluorescentie in twee flankerende ramen waardoor de fluorescerende filamenten bewegen als ze vertrekken de geactiveerde regio in zowel anterograde en retrograde richtingen. In beide benaderingen kunnen parameters van neurofilamenttransport zoals de gemiddelde snelheid, netto directionaliteit en pauzegedrag worden verkregen door wiskundige analyse en modellering van de veranderingen in fluorescentie in de meetvensters. Figuur 3 illustreert deze twee benaderingen.
Dit protocol toont dissectie en voorbereiding van de zenuw, activering en beeldvorming van de paGFP fluorescentie, en kwantificering van neurofilament vervoer van de verworven beelden met behulp van de FIJI distributiepakket van ImageJ9. We gebruiken de scheenzenuw omdat het lang is (enkele cm) en niet vertakt; in principe is elke zenuw die paGFP-NFM uitdrukt echter geschikt voor gebruik met deze techniek als deze kan worden ontleed en ontleed zonder de axonen te beschadigen.

<table><tbody><tr><td>14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>inner gasket</td></tr><tr><td>2-deoxy-D-glucose</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>30mm Round Gasket w/ Holes</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>outer gasket</td></tr><tr><td>35 x 10mm dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>dissection dishes</td></tr><tr><td>40mm round coverslips</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>60mL syringe - Luer-lock tip</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD spinning-disk confocal system</td><td>Andor</td><td></td><td>outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>for fluorescein slide</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>fine tipped forceps</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Dissection pan with wax</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>initial dissection scissors</td></tr><tr><td>FCS2 perfusion chamber</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Inline solution heater</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Laminectomy forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>initial dissection forceps</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Microaqueduct slide</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>for fluorescein slide</td></tr><tr><td>Microscope stage insert</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Objective heater system</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch with objective collar</td></tr><tr><td>Objective oil - type A</td><td>Nikon</td><td>discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium iodoacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Sage Instruments</td><td>Model 355</td><td></td></tr><tr><td>Tubing adapter - female</td><td>Small Parts Inc.</td><td>1005109</td><td></td></tr><tr><td>Tubing adapter - male</td><td>Small Parts Inc.</td><td>1005012</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16" ID, 1/32" wall thickness</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>fine scissors</td></tr></tbody></table>

beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament eiwit polymeren bewegen langs axonen in de langzame component van axon vervoer bij gemiddelde snelheden van ~ 0,35-3,5 mm per dag. Tot voor kort was de studie van deze beweging in situ alleen mogelijk met behulp van radio-isotopenpuls, die analyse van axonaal transport in hele zenuwen met een temporele resolutie van dagen en een ruimtelijke resolutie van millimeters mogelijk maakt. Om neurofilamenttransport in situ te bestuderen met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die neurofilament-eiwit M met fotoactiviteitbare GFP in neuronen uitdrukt. Hier beschrijven we fluorescentie fotoactivatie pulse-escape en pulse-spread methoden om neurofilament transport te analyseren in enkele myelinated axonen van scheenbeen zenuwen van deze muizen ex vivo. Geïsoleerde zenuwsegmenten worden gehandhaafd op de microscoop stadium door perfusie met zuurstofrijk zout en afgebeeld door spinnen schijf confocale fluorescentie microscopie. Violet licht wordt gebruikt om de fluorescentie te activeren in een kort axonaal venster. De fluorescentie in de geactiveerde en flankerende gebieden wordt na verloop van tijd geanalyseerd, waardoor de studie van neurofilament transport met tijdelijke en ruimtelijke resolutie op de volgorde van minuten en micron, respectievelijk. Wiskundige modellering kan worden gebruikt om kinetische parameters van neurofilament transport met inbegrip van de snelheid, directionele bias en pauzeren gedrag uit de resulterende gegevens te extraheren. De puls-escape en pulse-spread methoden kunnen ook worden aangepast om neurofilament transport in andere zenuwen te visualiseren. Met de ontwikkeling van extra transgene muizen kunnen deze methoden ook worden gebruikt om het axonale transport van andere cytoskeletale en cytosolische eiwitten in axoons te beelden en te analyseren.

Figuur 3 toont representatieve beelden van puls-escape en pulse-spread experimenten. We hebben verschillende studies gepubliceerd die gegevens beschrijven die zijn verkregen met behulp van de puls-escape-methode en onze methoden voor de analyse van die gegevens5,6,7,8,17. Hieronder laten we zien hoe de pulsspreadgegevens informati...

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Dit protocol maakt directe beeldvorming van de neurofilamentpopulatie in geïhileerde axonen van jonge of volwassen muizen met behulp van fluorescentiemicroscopie mogelijk, waardoor het mogelijk is om de directionaliteit en snelheid van neurofilamenttransport in geïsoleerde zenuwsegmenten te meten. Deze methode is afhankelijk van de beschikbaarheid van muizen die een fotoactiviteitbare fluorescerende fusie van het eiwit van belang uitdrukken, maar kan worden aangepast voor gebruik in elke gemakkelijk ontleedzende zenuw. Om te beginnen, giet zuurstofrijk zout in een 60 milliliter spuit en zorg ervoor dat er minimale lucht overblijft in de spuit.Sluit de spuit aan op de slang en plaats de uitstroombuis in een afvalfles. Plaats de buitenste pakking in de perfusiekamer, zorg ervoor dat de stroominlaat en uitlaatpalen zijn uitgelijnd met de gaten in de pakking, leg vervolgens de binnenpakking op een nummer 1.5 cirkelhoezenlip en maak eventuele rimpels in de pakking voorzichtig glad om een strakke afdichting te garanderen. Leg de hoezenlip en pakking op een papieren handdoek of een taak doekje met de pakking naar boven.Gebruik een paar grote dissectie schaar om een dorsale incisie in de huid in de buurt van het midden van de wervelkolom te maken en blijven snijden rond de ventrale aspect van het dier. Langzaam trek de huid uit de buurt van de spier en snijd de fascia. Gebruik vervolgens een microdissection schaar om een incisie te maken in de dijspieren halverwege tussen de staart en knie om de heupzenuw bloot te leggen.Zorg ervoor dat de zenuw, die zichtbaar is door de spier, niet wordt gesneden. Breid de incisie dorsaal en ventrally om de spier te verwijderen, verwijder dan de spieren van het kalf, het houden van de bezuinigingen ondiep en kort om te voorkomen dat schadelijke zenuwen. Doorgaan met het verwijderen van de spieren totdat de scheenbeenzenuw volledig is blootgesteld vanaf het punt waar het takken van de heupzenuw naar de hiel.Grijp de scheenzenuw aan de wervelkolom proximale einde met een paar tangen en snijd het met een paar microdissection schaar, ervoor te zorgen dat niet te veel spanning van toepassing op de zenuw. Til het voorzichtig weg van de spier en snijd eventuele bijlagen, waarbij u ervoor zorgt dat u geen spanning op de zenuw legt. Snijd de wervelkolom distale einde van de scheenzenuw en breng het naar een kleine petrischaal van kamertemperatuur zuurstofrijk zout.Vanaf het proximale uiteinde van de zenuw, pak voorzichtig de blootgestelde axonuiteinden met een paar zeer fijne tip tangen. Met een tweede paar tangen, pak de zenuwschede proximally en langzaam trek naar het distale uiteinde van de zenuw ervoor te zorgen dat er geen onnodige spanning wordt toegepast tijdens dit proces. Pak het proximale uiteinde van de zenuw en leg het langzaam neer op een coverslip en maak het vervolgens recht onder zachte spanning.Plaats de microaqueduct schuif over de zenuw met de gegroefde glijbaan naar beneden en de positie van de richting van de stroom parallel aan de zenuw. Draai de coverslip en microaqueduct montage over en plaats het in de perfusie kamer behuizing met de dia in tegenstelling tot de buitenste pakking. Om de overfusiekamer te beveiligen, plaatst u deze in de metalen behuizing en draait u de vergrendelingsring.Druk de zoutspuitzuir langzaam in en vul de perfusiekamer. Houd de inlaat- en uitlaatbuizen, uitlaatkolf en spuit te allen tijde boven de kamer zelf tijdens de installatie en beeldvorming. Breng de overfusieassemblage over naar een omgekeerde microscoopfase en monteer de zoutspuit in de spuitpomp, start de motor en pas de snelheid aan voor een stroomsnelheid van 0,25 milliliter per minuut.Sluit de inline oplossing kachel en zet het op 37 graden Celsius. Sluit de objectieve kachel en zet het op 37 graden Celsius. Breng olie aan op het doel en steek de overfusiekamer in de podiumbevestiging.Breng olie aan op het kachelkussen van de kamer en bevestig deze aan de perfusiekamer, sluit deze aan en stel deze in op 37 graden Celsius. Vergrendel de overfusiekamer in de stadiumadapter en breng de objectieve olie in contact met de coverslip aan de onderkant van de kamer. Gebruik Brightfield verlichting om zich te concentreren op de laag van axonen op het onderste oppervlak van de zenuw het dichtst bij de coverslip oppervlak.Myelinated axonen kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een myelineschede die zichtbaar is onder Brightfield uitgezonden lichtverlichting zonder contrastverbetering. Verwerf een Brightfield referentiebeeld, het opnemen van de directionaliteit van de zenuw, dan verwerven van een confocale beeld met behulp van een 488 nanometer laser en een emissiefilter geschikt voor foto-activiteit GFP. Stel de laserkracht in op ongeveer vijf keer normale beeldvormingskracht en verwerf een beeld met een belichtingstijd van drie tot vier minuten en verwerf vervolgens een ander confocal beeld om de autofluorescentie van de pre-activering op te nemen na de bleekstap.Teken een lijn die parallel loopt aan de axonen met een lengte die gelijk is aan de gewenste grootte van het activeringsvenster van de Brightfield-afbeelding. Teken met deze lijn als leidraad een rechthoekig gebied dat van belang is in het gezichtsveld loodrecht op de axonen. Activeer de GFP fluorescentie in dit gebied door patroonexcitatie met het 405 nanometerlicht, zodat een afbeelding net voor en onmiddellijk na activering wordt verkregen.Als de activering is voltooid, start u een timer van één minuut. Wanneer het afgaat, start de overname van een timelapse-serie. Voeg 250 milligram fluoresceïnepoeder toe aan 0,5 milliliter dubbel gedestilleerd water en meng het tot er geen zichtbare deeltjes zijn, draai de oplossing vervolgens gedurende 30 seconden in een centrifuge van tafelop om onopgelost materiaal te verdoven.Voeg acht microliter fluoresceïneoplossing toe aan een dia en breng een nummer 1.5 coverslip aan. Dep de overtollige vloeistof, verzegel de coverslip met nagellak, en laat de glijbaan drogen. Plaats de schuifhoezenzijde naar beneden op het omgekeerde microscoopstadium en pas de focus aan op het dunne vlak van fluorescentie aan het oppervlak van de coverslip.Verplaats de dia om een gezichtsveld te vinden dat geen luchtbellen of grote fluoresceïnedeeltjes bevat en verwerf een Z-stack van zes micrometer met intervallen van 0,2 micrometer, zodat het middelste beeld het oorspronkelijke focusvlak is. Sluit alle lichtpadluiken, inclusief de cameraluik en stel de laserkracht en de belichtingstijd in op nul seconden. Verwerf een stapel van 100 afbeeldingen met deze instellingen, die gemiddeld worden berekend om het donkere veldbeeld te genereren.Representatieve beelden van puls-escape en pulse-spread experimenten worden hier getoond. Voor de puls-escape methode, de fluorescentie verval kinetiek in de geactiveerde regio kan informatie opleveren over de lange termijn en korte termijn pauzeren gedrag. Het geactiveerde gebied kan een afkorting zijn voor deze experimenten.Een langer geactiveerde regio wordt gebruikt voor de puls-spread methode om een grotere pool van fluorescerende neurofilamenten te bieden. Dit verlengt de tijd waarover de fluorescentietoename in de flankerende gebieden lineair blijft. Hier worden 15 micrometer flankerende ramen gebruikt.De totale fluorescentie van het meetvenster werd gekwantificeerd. Het verval is bifasisch voor de puls-escape methode met een eerste exponentiële verval dat het vertrek van on-track neurofilamenten en een tweede langzamer exponentieel verval op 10 tot 20 minuten dat het vertrek van off-track filamenten vertegenwoordigt. Voor de pulsspreadstrategie zijn de berekeningen van de snelheid en directionaliteit van de beweging alleen afhankelijk van de hellingen in de flankerende ramen.Voor de vensterlengtes die hier worden gebruikt, strekt de lineaire fase zich ongeveer vijf minuten uit. Een timelapse van een glycolytically geremde zenuw wordt hier getoond, die een duidelijke vermindering van vervoer uit de geactiveerde gebied aantoont. Inderdaad, de distale en proximale hellingen zijn aanzienlijk lager in zenuwen behandeld met remmer.Er is ook een aanzienlijke daling van de bevolkingssnelheid tussen deze twee voorwaarden. Bij een poging dit protocol, bedenk dan dat het cruciaal is om overhaast te zijn bij het uitvoeren van de dissectie en kamer vergadering gedeelten als zenuw gezondheid afneemt na het offer van het dier. Neuronale celcultuur kan het mogelijk maken meting en analyse van de beweging van individuele neurofilamenten, die de bevolkingsschaal gegevens verzameld met behulp van dit protocol zou aanvullen.

imaging-analysis-neurofilament-transport-excised-mouse-tibial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.

Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse

Using fluorescence microscopy, visualize the injured nerve, which exhibits a progressive increase in axonal swellings and disconnections.

Electron Microscopic Analysis of Axonal Damage in the Optic Nerve of Mice with Brain Injury

Source: Boyer, N. P. et. al., Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the fluorescence photoactivation method to analyze neurofilament transport in myelinated axons of peripheral nerves. By tracking photoactivated green fluorophore-tagged neurofilaments, the technique provides insights into axonal transport in neurodegenerative diseases.

Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons 

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Het protocol toont een methode om ruimtelijke correlatie tussen de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en peri-synaptische Schwann-cellen in de mediale gastrocnemius-spier van de rat te onderzoeken met behulp van fluorescerende immunohistochemie met verschillende biomarkers, namelijk neurofilament 200, vesiculaire acetylcholinetransporter, alfa-bungarotoxine en S100.

Visualisatie van de morfologische kenmerken van neuromusculaire overgang in rat mediale gastrocnemiusspier

Leer neurofilamenttransport analyseren in gemyeliniseerde axonen van transgene muizen met fluorescentiemicroscopie. Deze methode meet richting en snelheid van transport in geïsoleerde zenuwsegmenten.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Meer video's verkennen