Name: Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer een high-throughput FUS-methode voor tijdelijke doorbraak van de bloed-hersenbarrière bij muismodellen. Deze techniek maakt gecontroleerde sonoporatie mogelijk voor verbeterde aflevering van therapeutica naar de hersenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd door de KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Wij danken Ilya Skachkov en Charles Mougenot voor hun inbreng in de ontwikkeling van het systeem.

Alle in vivo experimenten zijn goedgekeurd door de Nederlandse ethische commissie (vergunningsnummer AVD114002017841) en het Dierenwelzijnsorgaan van de Vrije Universiteit Amsterdam. De onderzoekers werden getraind in de basis van het FUS-systeem om het ongemak van de dieren te minimaliseren.
1. Gericht echografiesysteem
OPMERKING: De beschreven opstelling is een in eigen huis gebouwd BBB-storingssysteem op basis van in de handel verkrijgbare componenten en bevat een 3D-geprinte op maat gemaakte kegel en een afneembaar stereotactisch platform. Het systeem is modulair ontworpen, wat aanpassingen mogelijk maakt op basis van beschikbare apparatuur en specifiek gebruik. Het protocol beschrijft de procedure voor de sonoporatie van een groter gebied in het pontinegebied van de muizenhersenen. Door de doellocatie aan te passen, kunnen verschillende delen van de hersenen worden getarget. In deze studie werd een 1 MHz mono-element transducer met een brandpuntsafstand van 75 mm, een diafragma van 60 mm en een brandpunt van 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM piekdruk) gebruikt. Het brandpuntsvlak van de transducer bevindt zich door de schedel van het dier in het horizontale vlak dat de oorstaven kruist.
<ol><li>Selecteer een geschikte transducer voor BBB-opening bij knaagdieren. OPMERKING: Op basis van de eigenschappen van de microbubbels en de gebruikte frequentie zijn de akoestische instellingen, met name de mechanische index (MI), onderhevig aan wijziging13,38.</li>
	<li>Plaats de transducer in de 3D-geprinte kegel.</li>
	<li>Gebruik een akoestisch transparant mylarmembraan aan de onderkant van de kegel om een akoestische koppeling van het straalvoortplantingspad te bereiken en vul de kegel met ontgast water.</li>
	<li>Monteer de transducer boven het dier op een gemotoriseerd lineair stadium zoals weergegeven in figuur 1, zodat de transducer automatisch verticaal kan worden geplaatst.</li>
	<li>Ontwerp een afneembaar stereotactisch platform op basis van de vereisten van het onderzoek, dat temperatuurgereguleerde verwarming, beet- en oorstaven, anesthesie en multimodale fiduciale markers omvat, zoals weergegeven in figuur 1 en figuur 2. De montage van het stereotactische platform bestaat uit een 2D lineair podiumsysteem, dat nauwkeurige automatische positionering (< 0,1 mm) van het dier onder de balk mogelijk maakt.</li>
	<li>Sluit de transducer aan op de akoestische emissieketen in figuur 1, bestaande uit een transducer, een functiegenerator en een eindversterker.</li>
	<li>Bedenk een beeldverwerkingspijplijn om de multimodale fiduciale markers te detecteren die nauwkeurige sonoporatietargeting van het hersengebied van belang en verzameling van de cavitatiegegevens die door de naaldhydrofoon worden gedetecteerd, mogelijk maakt.</li>
	<li>Kalibreer het systeem en bepaal het scherpstelpunt van de transducer in overeenstemming met de verticale positionering van het dier op het stereotactische platform.</li>
</ol>2. Voorbereiding van dieren
OPMERKING: Het volgende protocol is gespecificeerd voor muizen, maar kan worden aangepast voor ratten. Voor deze experimenten werden vrouwelijke athymische naakte Foxn1-/- muizen (6-8 weken oud) gebruikt.
<ol><li>Laat het dier minstens een week acclimatiseren in de dierenvoorziening en weeg het dier regelmatig.</li>
	<li>Toedienen van buprenorfine (0,05 mg/kg) via subcutane (s.c.) injectie 30 min voorafgaand aan fus behandeling om te beginnen met de pijnstillende behandeling.</li>
	<li>Verdoof het dier met 3% isofluraan, 2 L/min O2 en controleer of het dier diep verdoofd is. Houd de dieren tijdens de hele procedure verdoofd en controleer de ademhalingsfrequentie en hartslag om de concentratie isofluraan naar behoefte aan te passen.</li>
	<li>Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen en mogelijk letsel te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder het haar op de bovenkant van het hoofd met een scheermes en ontharingscrème en was daarna met water om eventuele resten te verwijderen om irritatie van de huid te voorkomen.</li>
	<li>Injecteer voor experimenten met BLI-tumormodellen 150 μL D-luciferine (30 mg/ml) intraperitoneaal (i.p.) met een 29 G insulinespuit voor BLI-beeldgeleiding.</li>
	<li>Plaats een 26-30 G staartaderkatheter en spoel de katheter en ader door met een klein volume heparineoplossing (5 UI/ml). Vul de katheter met heparineoplossing om bloedstolling te voorkomen. OPMERKING: Een goede katheterisatie wordt waargenomen wanneer er een reflux van bloed in de katheter is. Vermijd luchtbellen in de katheter om emboli te voorkomen. Om overmatige injectiedruk te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de lengte van de katheter zo kort mogelijk is.</li>
	<li>Plaats het dier op het temperatuurgeregelde stereotactische platform om onderkoeling te voorkomen. OPMERKING: Onderkoeling vermindert de bloedcirculatie, wat de injectie/circulatie van microbubbels en de farmacokinetiek van de geneesmiddelen kan beïnvloeden39.</li>
	<li>Immobiliseer en bevestig het hoofd van het dier op het stereotactische platform met behulp van oorstangen en een bijtbeugel. Fixeer het lichaam met een riem en plak de staart van het dier vast aan het platform.</li>
</ol>3. In vivo beeldgeleide gerichte echografie
OPMERKING: Voor dit protocol werd een 1 MHz mono-element transducer met een toon-burst puls met een duur van 10 ms, een MI van 0,4 en een pulsherhalingsfrequentie van 1,6 Hz met 40 cycli gedurende 240 s gebruikt. Het protocol is geoptimaliseerd voor microbubbels gestabiliseerd door fosfolipiden die zwavelhexafluoride (SF6) bevatten als onschadelijk gas, waarbij de gemiddelde bubbeldiameter 2,5 μm is en meer dan 90% van de bellen kleiner is dan 8 μm.
<ol><li>Plaats het stereotactische platform met het gemonteerde dier in de beeldvormingsmodaliteit (bijv. BLI of röntgenfoto's) en maak foto('s) van het dier.</li>
	<li>Gebruik de multimodale fiducial markers in combinatie met de beeldverwerkingspijplijn om de positie van het dier te markeren op basis van het scherpstelpunt van de transducer.</li>
	<li>Bepaal het doelgebied door een hersencontour over het verkregen röntgenbeeld te plaatsen of BLI-afbeeldingen te gebruiken om het centrum van de tumor te bepalen (figuur 2). De positie van specifieke delen van de hersenen wordt gespecificeerd in de Paxinos Brain Atlas40 met behulp van de schedelmarkeringen bregma en lambda als referentiepunten. De pons bevindt zich bijvoorbeeld x=-1.0, y=-0.8 en z=-4.5 van lambda.</li>
	<li>Bescherm de neusgaten en mond van het dier met plakband om te voorkomen dat ultrasone gel de ademhaling verstoort.</li>
	<li>Breng ultrasone gel aan op het hoofd van het dier.</li>
	<li>Trek de huid van de nek van de dieren in, smeer de naaldhydrofoon met ultrasone gel en plaats de naaldhydrofoon in de directe omgeving van het achterhoofdsbeen.</li>
	<li>Leid de transducer naar de juiste positie met behulp van de beeldverwerkingspijplijn en het scherpstelpunt.</li>
	<li>Pas de vooraf geconfigureerde instellingen toe op alle aangesloten apparaten en richt u op het hersengebied van belang. OPMERKING: Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen tumor- of hersengebieden worden gesnoopoeerd als één brandpunt of als volumetrische vorm, zoals weergegeven in figuur 2.</li>
	<li>Activeer microbubbels zoals beschreven door de fabrikant. Injecteer één bolus van 120 μL (5,4 μg) microbubbels.</li>
	<li>Spoel de staartaderkatheter met zoutoplossing om de opening van de katheter te controleren.</li>
	<li>Injecteer de microbubbels en start de insonatie.</li>
	<li>Neem microbubble cavitatie op met de naald hydrofoon.</li>
	<li>Dien een intravasculaire contrastmiddel of geneesmiddel toe na sonoporatie. De dosis, timing en planning zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek en het medicijn. OPMERKING: Evans blauw is een veel voorkomende kleurstof om BBB opening41te beoordelen .</li>
	<li>Bewaak het dier tot het vooraf bepaalde tijdspunt of vóór het humane eindpunt.</li>
</ol>4. Analyse van microbubble cavitatie
OPMERKING: Hier wordt de toegepaste procedure beschreven, die geschikt is voor in vivo experimenten voor SF6-fosfolipide microbubbels met een gemiddelde diameter van 2,5 μm (80% van de bellen onder 8 μm) opgewekt met een burst-tone puls van 10 ms duur bij een frequentie van 1 MHz, zoals oorspronkelijk gesuggereerd door McDannold et al.12.
<ol><li>Fourier transformeert het opgenomen PCD-signaal van het tijddomein naar het frequentiedomein.</li>
	<li>Integreer het resulterende spectrale vermogen voor stabiele cavitatiedetectie rond de2e en3e harmonische (± 50 kHz), zoals weergegeven in figuur 3 (groene doos op 2 en 3 MHz).</li>
	<li>Integreer het spectrale vermogen voor traagheids cavitatiedetectie, tussen de hoofdfrequentie, de 2e,3e harmonische, de1e en2e ultraharmonische en de eerste subharmonische (± 150 kHz), zoals weergegeven in figuur 3 (rode vakken).</li>
	<li>Integreer het spectrale vermogen rond de principefrequentie (1 MHz ± 50 kHz) voor de normalisatie van beide eerder verkregen PCD-signalen. OPMERKING: Het PCD-signaal, voor SF6-fosfolipide microbubbels in vivo experimenten op 1 MHz, geeft geen ultraharmonica of subharmonica weer voordat traagheidsholte ingaat, zoals weergegeven in figuur 3.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

In deze studie ontwikkelden we een kosteneffectief beeldgestuurd FUS-systeem voor voorbijgaande BBB-verstoring voor verhoogde medicijnafgifte in het hersenparenchym. Het systeem werd grotendeels gebouwd met in de handel verkrijge componenten en in combinatie met röntgen en BLI. De modulariteit van het voorgestelde ontwerp maakt het gebruik van verschillende beeldvormende modaliteiten mogelijk voor planning en beoordeling in workflows met hoge doorvoer. Het systeem kan worden gecombineerd met uitgebreidere 3D-beeldvorming...

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een groot obstakel voor de levering van geneesmiddelen in het parenchym van de hersenen. De meeste therapeutische geneesmiddelen die zijn ontwikkeld, kruisen de BBB niet vanwege hun fysisch-chemische parameters (bijv. lipofielheid, moleculair gewicht, waterstofbindingsacceptoren en donoren) of worden niet behouden vanwege hun affiniteit voor effluxtransporters in de hersenen1,2. De kleine groep geneesmiddelen die de BBB kunnen kruisen, zijn meestal kleine lipofiele moleculen, die slechts effectief zijn bij een beperkt aantal hersenziekten1,2. Als gevolg hiervan zijn voor de meeste hersenziekten de farmacologische behandelingsopties beperkt en zijn nieuwe strategieën voor de toediening van geneesmiddelen nodig3,4.
Therapeutische echografie is een opkomende techniek die kan worden gebruikt voor verschillende neurologische toepassingen zoals BBB-verstoring (BBBD), neuromodulatie en ablatie4,5,6,7. Om een BBB-opening te bereiken met een extracorporale echografie-emitter door de schedel, wordt gerichte echografie (FUS) gecombineerd met microbubbels. Microbubble-gemedieerde FUS resulteert in een verhoogde biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen in het hersenparenchym5,8,9. In aanwezigheid van geluidsgolven beginnen microbubbels te oscilleren bij het initiëren van transcytose en verstoring van de nauwe verbindingen tussen de endotheelcellen van de BBB, waardoor paracellulair transport van grotere moleculen mogelijk wordt10. Eerdere studies bevestigden de correlatie tussen de intensiteit van de akoestische emissie en de biologische impact op de BBB-opening11,12,13,14. FUS in combinatie met microbubbels is al gebruikt in klinische studies voor de behandeling van glioblastoom met temozolomide of liposomale doxorubicine als chemotherapeutisch middel, of voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer en amyotrofische laterale sclerose5,9,15,16.
Aangezien echografie gemedieerde BBB-opening resulteert in geheel nieuwe mogelijkheden voor farmacotherapie, is preklinisch onderzoek voor klinische vertaling nodig om de therapierespons van geselecteerde geneesmiddelkandidaten te beoordelen. Dit vereist meestal een workflow met hoge doorvoer met zowel hoge ruimtelijke precisie als bij voorkeur een geïntegreerde cavitatiedetectie voor het bewaken van gerichte BBB-opening met een hoge reproduceerbaarheid. Indien mogelijk moeten deze systemen kosteneffectief zijn in zowel initiële investeringen als bedrijfskosten om schaalbaar te zijn op basis van de studiegrootte. De meeste preklinische FUS-systemen worden gecombineerd met MRI voor beeldbegeleiding en behandelingsplanning15,17,18,19. Hoewel MRI gedetailleerde informatie geeft over de anatomie en het volume van de tumor, is het een dure techniek, die over het algemeen wordt uitgevoerd door getrainde / bekwame operators. Bovendien is MRI met hoge resolutie mogelijk niet altijd beschikbaar voor onderzoekers in preklinische faciliteiten en vereist het lange scantijden per dier, waardoor het minder geschikt is voor farmacologische studies met hoge doorvoer. Opmerkelijk is dat voor preklinisch onderzoek op het gebied van neuro-oncologie, in het bijzonder infiltratieve tumormodellen, de mogelijkheid om de tumor te visualiseren en te targeten essentieel is voor het succes van de behandeling20. Momenteel wordt aan deze eis alleen voldaan door MRI of door tumoren die worden getransduceerd met een fotoproteïne, waardoor visualisatie met bioluminescentiebeeldvorming (BLI) in combinatie met toediening van het fotoproteïnesubstraat mogelijk is.
MRI-geleide FUS-systemen gebruiken vaak een waterbad om ultrasone golfvoortplanting te garanderen voor transcraniële toepassingen, waarbij het hoofd van het dier gedeeltelijk in het water wordt ondergedompeld, de zogenaamde ''bottom-up'' systemen15,17,18. Hoewel deze ontwerpen over het algemeen goed werken in kleinere dierstudies, zijn ze een compromis tussen de bereidingstijden van dieren, draagbaarheid en realistisch handhaafbare hygiënische normen tijdens het gebruik. Als alternatief voor MRI omvatten andere geleidingsmethoden voor stereotactische navigatie het gebruik van een anatomische atlas voor knaagdieren21,22,23, laserpointer assisted visual sighting24, pinhole-assisted mechanical scanning device25, of BLI26. De meeste van deze ontwerpen zijn "top-down" systemen waarbij de transducer bovenop het hoofd van het dier wordt geplaatst, met het dier in een natuurlijke positie. De ''top-down'' workflow bestaat uit een waterbad22,25,26 of een met water gevulde kegel21,24. Het voordeel van het gebruik van een transducer in een gesloten kegel is de compactere voetafdruk, kortere insteltijd en eenvoudige ontsmettingsmogelijkheden die de hele workflow vereenvoudigen.
De interactie van het akoestische veld met de microbubbels is drukafhankelijk en varieert van oscillaties met lage amplitude (stabiele cavitatie genoemd) tot voorbijgaande instorting van de bellen (inertial cavitatie genoemd)27,28. Er is een vaste consensus dat ultrasound-BBBD een akoestische druk vereist die ver boven de stabiele cavitatiedrempel ligt om succesvolle BBBD te bereiken, maar onder de traagheids cavitatiedrempel, die over het algemeen geassocieerd wordt met vasculaire/neuronale schade29. De meest voorkomende vorm van monitoring en controle is de analyse van het (back-)scattered akoestische signaal met behulp van passieve cavitatiedetectie (PCD), zoals voorgesteld door McDannold et al.12. PCD baseert zich op de analyse van de Fourier spectra van microbubble emissiesignalen, waarbij de sterkte en het uiterlijk van stabiele cavitatie-kenmerken (harmonischen, subharmonica en ultraharmonica) en traagheids cavitatiemarkers (breedbandrespons) in realtime kunnen worden gemeten.
Een "one size fits all" PCD-analyse voor nauwkeurige drukregeling is gecompliceerd vanwege de polydispersiteit van de microbubbelformulering (de oscillatieamplitude hangt sterk af van de bubbeldiameter), de verschillen in bubble shell-eigenschappen tussen merken en de akoestische oscillatie, die sterk afhankelijk is van frequentie en druk30,31,32. Als gevolg hiervan zijn veel verschillende PCD-detectieprotocollen voorgesteld, die zijn aangepast aan specifieke combinaties van al deze parameters en zijn gebruikt in verschillende toepassingsscenario's (variërend van in vitro experimenten over protocollen voor kleine dieren tot PCD voor klinisch gebruik) voor robuuste cavitatiedetectie en zelfs voor retroactieve feedbackcontrole van de druk11,14,30,31,32,33,34,35. Het PCD-protocol dat in het kader van deze studie wordt gebruikt, is rechtstreeks afgeleid van McDannold et al.12 en bewaakt de harmonische emissie voor de aanwezigheid van stabiele cavitatie en breedbandgeluid voor traagheids cavitatiedetectie.
We hebben een beeldgestuurd neuronavigatie FUS-systeem ontwikkeld voor het transiënt openen van de BBB om de afgifte van geneesmiddelen in het parenchym van de hersenen te verhogen. Het systeem is gebaseerd op in de handel verkrijgbaar componenten en kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende beeldvormingsmodaliteiten, afhankelijk van de beschikbare beeldvormingstechnieken in de dierenfaciliteit. Omdat we een workflow met hoge doorvoer nodig hebben, hebben we ervoor gekozen om röntgenfoto's en BLI te gebruiken voor beeldbegeleiding en behandelingsplanning. Tumorcellen getransduceerd met een fotoproteïne (bijv. luciferase) zijn geschikt voor BLI imaging20. Na toediening van het fotoproteïnesubstraat kunnen tumorcellen in vivo worden gecontroleerd en kunnen tumorgroei en locatie worden bepaald20,36. BLI is een goedkope beeldvormingsmodaliteit, het maakt het mogelijk om de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, het heeft snelle scantijden en het correleert goed met tumorgroei gemeten met MRI36,37. We hebben ervoor gekozen om het waterbad te vervangen door een met water gevulde kegel die aan de transducer is bevestigd om flexibiliteit mogelijk te maken om het platform waarop het knaagdier is gemonteerd vrij te verplaatsen8,24. Het ontwerp is gebaseerd op een afneembaar platform dat is uitgerust met integratie van (I) stereotactisch platform voor kleine dieren (II) fiducial markers met zowel röntgen- als optische beeldcompatibiliteit (III) snel-afneembare anesthesiemasker en (IV) geïntegreerd temperatuurgeregeld dierverwarmingssysteem. Na de eerste inductie van anesthesie wordt het dier in een precieze positie op het platform gemonteerd waar het tijdens de hele procedure blijft. Bijgevolg passeert het hele platform alle stations van de workflow van de hele interventie, met behoud van een nauwkeurige en reproduceerbare positionering en aanhoudende anesthesie. De besturingssoftware maakt de automatische detectie van de fiducial markers mogelijk en registreert automatisch alle soorten beelden en beeldmodaliteiten (d.w.z. micro-CT, röntgen, BLI en fluorescentiebeeldvorming) in het referentiekader van het stereotactische platform. Met behulp van een automatische kalibratieprocedure is de brandpuntsafstand van de ultrasone transducer precies bekend binnenin, wat de automatische fusie van interventionele planning, akoestische levering en follow-up beeldvormingsanalyse mogelijk maakt. Zoals weergegeven in figuur 1 en figuur 2,biedt deze opstelling een hoge mate van flexibiliteit om specifieke experimentele workflows te ontwerpen en maakt het mogelijk om het dier op verschillende stations met elkaar te behandelen, wat op zijn beurt experimenten met hoge doorvoer vergemakkelijkt. We hebben deze techniek gebruikt voor succesvolle medicijnafgifte bij muis xenografts van hoogwaardig glioom zoals diffuus midline glioom.

<table><tbody><tr><td>1 mL luer-lock syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>19 G needle</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>3M Transpore surgical tape</td><td>Science applied to life</td><td>7000032707</td><td>of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Arbitrary waveform generator</td><td>Siglent</td><td>n.a.</td><td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td></tr><tr><td>Automated stereotact</td><td>in-house built</td><td>n.a.</td><td>Stereotact met alle elementen zijn in-house gebouwd</td></tr><tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.</td><td>Inclusief software</td></tr><tr><td>Buffered NaCl solution</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine hydrochloride</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.</td><td>0.324 mg</td></tr><tr><td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td><td>Bio services</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Carbon filter</td><td>Bickford</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>Ceramic spoon</td><td>n.a</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VUmc pharmacy</td><td>n.a.</td><td>70%</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.</td><td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>n.a.</td><td>Histoacryl 0.5 mL</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0.5 mL en 0.3 mL</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Alfasan</td><td>n.a.</td><td>10 %, 10 mL</td></tr><tr><td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Neoflon catheter</td><td>Becton Dickinson</td><td>391349</td><td>26 GA 0.6 x 19 mm</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Keysight technologies</td><td>n.a.</td><td>InfiniiVision DSOX024A</td></tr><tr><td>Plastic tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Power amplifier</td><td>Electronics &amp; Innovation Ltd</td><td>210L</td><td>Model 210L</td></tr><tr><td>Preamplifier DC Coupler</td><td>Precision Acoustics</td><td>n..</td><td>Serienummer: DCPS94</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Sedazine</td><td>AST Farma</td><td>n.a.</td><td>2%</td></tr><tr><td>SonoVue microbubbles</td><td>Bracco</td><td>n.a.</td><td>8 &micro;l/ml</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>verschillende spuiten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.</td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.</td><td>1 MHz</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic gel</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.a.</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijke hindernis geweest voor de behandeling van verschillende hersenziekten. Endotheelcellen, verbonden door nauwe verbindingen, vormen een fysiologische barrière die voorkomt dat grote moleculen (>500 Da) het hersenweefsel binnendringen. Microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS) kan worden gebruikt om een voorbijgaande lokale BBB-opening te induceren, waardoor grotere geneesmiddelen het parenchym van de hersenen kunnen binnendringen.
Naast grootschalige klinische apparaten voor klinische vertaling, vereist preklinisch onderzoek voor therapieresponsbeoordeling van geneesmiddelkandidaten speciale echografie-opstellingen voor kleine dieren voor gerichte BBB-opening. Bij voorkeur maken deze systemen workflows met hoge doorvoer mogelijk met zowel hoge ruimtelijke precisie als geïntegreerde cavitatiebewaking, terwijl ze nog steeds kosteneffectief zijn in zowel initiële investeringen als bedrijfskosten.
Hier presenteren we een bioluminescentie- en röntgengeleid stereotactisch FUS-systeem voor kleine dieren dat is gebaseerd op in de handel verkrijgbaar componenten en voldoet aan de bovengenoemde vereisten. Bijzondere nadruk is gelegd op een hoge mate van automatisering die de uitdagingen vergemakkelijkt die doorgaans worden ondervonden in preklinische geneesmiddelenevaluatiestudies met een hoog volume. Voorbeelden van deze uitdagingen zijn de noodzaak van standaardisatie om de reproduceerbaarheid van gegevens te waarborgen, de variabiliteit binnen de groep te verminderen, de steekproefgrootte te verminderen en zo te voldoen aan ethische vereisten en onnodige werklast te verminderen. Het voorgestelde BBB-systeem is gevalideerd in het kader van BBB-opening gefaciliteerde geneesmiddelenleveringsproeven op patiënt-afgeleide xenograftmodellen van glioblastoom multiforme en diffuse midline glioma.

Het beschrevenFUS-systeem ( figuur 1 en figuur 2) en de bijbehorende workflow zijn gebruikt bij meer dan 100 dieren en produceerden reproduceerbare gegevens over zowel gezonde als tumordragende muizen. Op basis van de geregistreerde cavitatie en de spectrale dichtheid bij de harmonischen op het piekmoment van de microbubble bolus injectie, kan het spectrale vermogen van elke frequentie worden berekend met behulp van de Fourier-analyse zoals uitgelegd in stap 4 v...

De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Hoogwaardige gliomen zoals diffuus intrinsiek pontine glioom zijn zeer invasieve tumoren met een hoge mortaliteit. Ondanks jaren van uitgebreid onderzoek, is de bloed-hersenbarrière een belangrijk aspect omdat chemotherapie niet effectief de hersenen kan bereiken. Gelukkig is gefocuste echografie in staat om de bloed-hersenbarrière tijdelijk en lokaal te openen voor effectieve behandelingen.We ontwikkelden een klein en kosteneffectief neuro-genavigeerd gefocust echografiesysteem voor onderbreking van de bloed-hersenbarrière. Dit systeem is gebouwd met commercieel verkrijgbare componenten en met een hoge mate van automatisering, het maakt preklinische geneesmiddelevaluatiestudies mogelijk. Precisiegeneeskunde wordt gedefinieerd als het juiste medicijn in de juiste dosis voor de juiste patiënt op het juiste moment.Om dit te bereiken, moeten veel vooraf geselecteerde geneesmiddelen worden gescreend. Ons compacte hoge-doorvoer gefocuste echografiesysteem voor onderbreking van de bloed-hersenbarrière stelt ons in staat om precies dat te doen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Rianne Haumann en Elvin t Hart, twee promovendi uit mijn onderzoeksgroep.De workflow voor beeldgestuurde stereotactische neuro-navigatie gefocuste echografie omvat interventionele beeldvorming en akoestische koppeling voor sonoporatie op het echografieplatform. Daarna kan follow-up beeldvorming worden uitgevoerd. Selecteer een geschikte transducer op basis van de vereisten van het ontworpen experiment.Plaats het in een 3D-geprinte kegel gevuld met ontgast water en sluit deze aan de onderkant af met een akoestisch transparante Mylar-membraan. Verbind de transducer met een functiegenerator en een vermogensversterker. Monteer de transducer op een gemotoriseerde lineaire stelling voor automatische verticale positionering en verbind deze met de vermogensversterker.Gebruik een afneembaar stereotactisch platform dat temperatuurgeregelde verwarming, bijt- en oorbeugels, anesthesie en multi-modale fiducial markers omvat. Bevestig het platform aan de 2D-lineaire stelling. Voordat het FUS-systeem kan worden gebruikt, moet u het kalibreren en het focuspunt van de transducer bepalen.Het focuspunt komt overeen met de verticale positie van het dier op het stereotactische platform. Acclimatiseer het dier gedurende ten minste één week na aankomst in de faciliteit en weeg het regelmatig. Op de dag van het experiment, dient u buprenorfine toe via een subcutane injectie 30 minuten voorafgaand aan de FUS-behandeling.Na het anesthetiseren van de muis, breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen. Verwijder indien nodig het haar op de bovenkant van het hoofd van het dier met een scheermes en ontharingscreme. Was de huid met water om eventuele resten te verwijderen.Voor experimenten met BLI-tumormodellen, injecteer 150 microliter D-luciferine intraperitoneaal met een 29 gauge insulinespuit. Voor het toedienen van microbubbels voor het openen van de BBB, plaats een 26 tot 30 gauge staartvenenkaver en spoel de ader door met een kleine hoeveelheid heparine-oplossing. Bevestig de katheter met weefselliniaal om losraken te voorkomen.Als de katheterisatie succesvol is, vul de katheter met de heparine-oplossing om bloedstolling te voorkomen. Plaats het dier op het temperatuurgeregelde stereotactische platform om hypothermie te voorkomen. Bevestig de kop van het dier met behulp van een bijtbalk en oorbeugels en plak de staart en katheter op het platform.Bevestig het lichaam van de muis met een riem. Plaats het stereotactische platform met de gemonteerde muis in de beeldvormingsmodaliteit en neem beelden van het dier. Bepaal of het dier correct op het platform is geplaatst.Markeer de positie van het dier met behulp van de multi-modale fiducial markers in combinatie met de beeldverwerkingspijplijn volgens het focuspunt van de transducer. Bepaal het doelgebied door een hersencontour over de verkregen röntgenfoto te plaatsen of door BLI-beelden te gebruiken om het centrum van de tumor te bepalen. Voordat u de transducer positioneert, beschermt u de neusgaten en mond van het dier met tape om te voorkomen dat ultrasoundgel de ademhaling verstoort.Breng ultrasoundgel aan op de kop van de muis voor goede geluidsgeleiding. Neem microbubbelcavitatie op met de naaldhydrofoon, die in de directe omgeving van het occipitale bot is geplaatst. Op basis van de kalibratiewaarden, leidt u de transducer naar de juiste positie boven het dier.Pas vooraf geconfigureerde instellingen toe op alle aangesloten apparaten om het hersengebied van belang aan te sturen. Nadat de transducer in de juiste positie is geplaatst, lost u de microbubbels op en activeert u ze zoals beschreven door de fabrikant. Vóór het injecteren van microbubbels, spoelt u de staartvenenkaver met fysiologische zoutoplossing om de toegang tot de staartvene te bevestigen.Start de insonicatie-traject en injecteer tegelijkertijd de microbubbels. Tegelijkertijd zal de naaldhydrofoon microbubbelcavitatie in real-time detecteren en verifiëren. Indien gewenst, dient u na sonoporatie een intravasculair contrastmiddel of geneesmiddel toe.Bewaak het dier tot een vooraf bepaald tijdstip. Akoestische druk met een mechanische index van 0,4 in combinatie met microbubbels bleek een zeer gevoelige en betrouwbare methode voor stabiele cavitatiedetectie in vergelijking met geen detectie van subharmonische golven wanneer er geen microbubbels werden geïnjecteerd of de observatie van inertiële cavitatie wanneer een MI van 0,6 werd toegepast. Terwijl akoestische druk met een MI tot 0,6 geen macroscopisch schade veroorzaakte, werd microscopisch schade histologisch aangetoond bij een MI van 0,6.Een drukamplitude met een MI van 0,8 resulteerde in een macroscopische hersenbloeding van grotere vaten en wijdverbreide weefselliyse met extravasatie van erytrocyten. Intraveneuze Evans blue werd geïnjecteerd om de opening van de BBB in het pontine gebied te valideren. Extravasatie van Evans blue-geconjugeerd albumine werd waargenomen op het niveau van de pons en het cerebellum bij de muis behandeld met FUS en microbubbels, wat een nauwkeurige targeting van het gebied van belang aantoonde.De belangrijkste stappen van dit protocol zijn de juiste

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Microbellen-gemedieerde focused ultrasound verstoring van de bloed-hersen barrière (BBB) ​​is een veelbelovende techniek voor niet-invasieve gerichte toediening van medicijnen in de...

MRI-geleide Verstoring van de bloed-hersen barrière met behulp van Transcraniële Focused Ultrasound in een ratmodel

This video describes a method of temporarily disrupting the blood-brain barrier (BBB) by creating transient openings using microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). These transient local BBB openings can eventually be used to deliver larger-sized drug molecules directly into the brain parenchyma.

Focus Ultrasound Based Microbubble Mediated Blood-Brain Barrier Opening: A Technique to Create Localized Transient Openings in Blood-Brain Barrier of Mouse by Sonoporation

Gerichte echografie met microbubble-middelen kan de bloed-hersenbarrière focal en voorbijgaand openen. Deze techniek is gebruikt om een breed scala aan middelen over de bloed-hersenbarrière te leveren. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de gelokaliseerde levering aan de knaagdierhersenen met of zonder MRI-begeleiding.

Een benchtop benadering van de locatie specifieke bloed hersenbarrière opening met behulp van gerichte echografie in een rat model

Dit protocol beschrijft stappen die nodig zijn voor de genafgifte door middel van gerichte ultrasone bloed-hersenbarrière (BBB) opening, evaluatie van de resulterende genexpressie en meting van neuromodulatie-activiteit van chemogenetische receptoren door middel van histologische tests.

Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

Deze studie beschrijft een gecombineerd protocol van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en laag-intensiteit gepulseerde gerichte ultrasone golf (FUS), gebruikmakend van levende ratten met katheterisatie van de halsader om de opening van de bloed-hersenbarrière (BBB) te monitoren.

Monitoring van de bloed-hersenbarrièreopening bij ratten met een preklinisch gerichte echografiesysteem

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

In dit rapport presenteren we een volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdig systeem dat in staat gelijktijdig testen van multi-cognitief gedrag en het opnemen van neuronale activiteiten voor knaagdieren.

Een Volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdige systeem voor het testen van meerdere cognitieve functies en opnemen Neuronale Activiteiten in Knaagdieren

Wordt een techniek beschreven voor het in grote lijnen het openen van de bloed-hersen barrière in de muis met behulp van microbellen en ultrageluid. Met deze techniek kan mangaan worden toegediend aan de hersenen van muizen. Omdat mangaan is een MRI-contrastmiddel dat zich ophoopt in gedepolariseerd neuronen, deze aanpak maakt beeldvorming van neuronale activiteit.

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

Leer een high-throughput FUS-methode voor tijdelijke doorbraak van de bloed-hersenbarrière bij muismodellen. Deze techniek maakt gecontroleerde sonoporatie mogelijk voor verbeterde aflevering van therapeutica naar de hersenen.

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren (Video) | JoVE Journal

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

Meer video's verkennen