Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren
16 juli 2020
De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.
Hoogwaardige gliomen zoals diffuus intrinsiek pontine glioom zijn zeer invasieve tumoren met een hoge mortaliteit. Ondanks jaren van uitgebreid onderzoek, is de bloed-hersenbarrière een belangrijk aspect omdat chemotherapie niet effectief de hersenen kan bereiken. Gelukkig is gefocuste echografie in staat om de bloed-hersenbarrière tijdelijk en lokaal te openen voor effectieve behandelingen.
We ontwikkelden een klein en kosteneffectief neuro-genavigeerd gefocust echografiesysteem voor onderbreking van de bloed-hersenbarrière. Dit systeem is gebouwd met commercieel verkrijgbare componenten en met een hoge mate van automatisering, het maakt preklinische geneesmiddelevaluatiestudies mogelijk. Precisiegeneeskunde wordt gedefinieerd als het juiste medicijn in de juiste dosis voor de juiste patiënt op het juiste moment.
Om dit te bereiken, moeten veel vooraf geselecteerde geneesmiddelen worden gescreend. Ons compacte hoge-doorvoer gefocuste echografiesysteem voor onderbreking van de bloed-hersenbarrière stelt ons in staat om precies dat te doen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Rianne Haumann en Elvin t Hart, twee promovendi uit mijn onderzoeksgroep.
De workflow voor beeldgestuurde stereotactische neuro-navigatie gefocuste echografie omvat interventionele beeldvorming en akoestische koppeling voor sonoporatie op het echografieplatform. Daarna kan follow-up beeldvorming worden uitgevoerd. Selecteer een geschikte transducer op basis van de vereisten van het ontworpen experiment.
Plaats het in een 3D-geprinte kegel gevuld met ontgast water en sluit deze aan de onderkant af met een akoestisch transparante Mylar-membraan. Verbind de transducer met een functiegenerator en een vermogensversterker. Monteer de transducer op een gemotoriseerde lineaire stelling voor automatische verticale positionering en verbind deze met de vermogensversterker.
Gebruik een afneembaar stereotactisch platform dat temperatuurgeregelde verwarming, bijt- en oorbeugels, anesthesie en multi-modale fiducial markers omvat. Bevestig het platform aan de 2D-lineaire stelling. Voordat het FUS-systeem kan worden gebruikt, moet u het kalibreren en het focuspunt van de transducer bepalen.
Het focuspunt komt overeen met de verticale positie van het dier op het stereotactische platform. Acclimatiseer het dier gedurende ten minste één week na aankomst in de faciliteit en weeg het regelmatig. Op de dag van het experiment, dient u buprenorfine toe via een subcutane injectie 30 minuten voorafgaand aan de FUS-behandeling.
Na het anesthetiseren van de muis, breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen. Verwijder indien nodig het haar op de bovenkant van het hoofd van het dier met een scheermes en ontharingscreme. Was de huid met water om eventuele resten te verwijderen.
Voor experimenten met BLI-tumormodellen, injecteer 150 microliter D-luciferine intraperitoneaal met een 29 gauge insulinespuit. Voor het toedienen van microbubbels voor het openen van de BBB, plaats een 26 tot 30 gauge staartvenenkaver en spoel de ader door met een kleine hoeveelheid heparine-oplossing. Bevestig de katheter met weefselliniaal om losraken te voorkomen.
Als de katheterisatie succesvol is, vul de katheter met de heparine-oplossing om bloedstolling te voorkomen. Plaats het dier op het temperatuurgeregelde stereotactische platform om hypothermie te voorkomen. Bevestig de kop van het dier met behulp van een bijtbalk en oorbeugels en plak de staart en katheter op het platform.
Bevestig het lichaam van de muis met een riem. Plaats het stereotactische platform met de gemonteerde muis in de beeldvormingsmodaliteit en neem beelden van het dier. Bepaal of het dier correct op het platform is geplaatst.
Markeer de positie van het dier met behulp van de multi-modale fiducial markers in combinatie met de beeldverwerkingspijplijn volgens het focuspunt van de transducer. Bepaal het doelgebied door een hersencontour over de verkregen röntgenfoto te plaatsen of door BLI-beelden te gebruiken om het centrum van de tumor te bepalen. Voordat u de transducer positioneert, beschermt u de neusgaten en mond van het dier met tape om te voorkomen dat ultrasoundgel de ademhaling verstoort.
Breng ultrasoundgel aan op de kop van de muis voor goede geluidsgeleiding. Neem microbubbelcavitatie op met de naaldhydrofoon, die in de directe omgeving van het occipitale bot is geplaatst. Op basis van de kalibratiewaarden, leidt u de transducer naar de juiste positie boven het dier.
Pas vooraf geconfigureerde instellingen toe op alle aangesloten apparaten om het hersengebied van belang aan te sturen. Nadat de transducer in de juiste positie is geplaatst, lost u de microbubbels op en activeert u ze zoals beschreven door de fabrikant. Vóór het injecteren van microbubbels, spoelt u de staartvenenkaver met fysiologische zoutoplossing om de toegang tot de staartvene te bevestigen.
Start de insonicatie-traject en injecteer tegelijkertijd de microbubbels. Tegelijkertijd zal de naaldhydrofoon microbubbelcavitatie in real-time detecteren en verifiëren. Indien gewenst, dient u na sonoporatie een intravasculair contrastmiddel of geneesmiddel toe.
Bewaak het dier tot een vooraf bepaald tijdstip. Akoestische druk met een mechanische index van 0,4 in combinatie met microbubbels bleek een zeer gevoelige en betrouwbare methode voor stabiele cavitatiedetectie in vergelijking met geen detectie van subharmonische golven wanneer er geen microbubbels werden geïnjecteerd of de observatie van inertiële cavitatie wanneer een MI van 0,6 werd toegepast. Terwijl akoestische druk met een MI tot 0,6 geen macroscopisch schade veroorzaakte, werd microscopisch schade histologisch aangetoond bij een MI van 0,6.
Een drukamplitude met een MI van 0,8 resulteerde in een macroscopische hersenbloeding van grotere vaten en wijdverbreide weefselliyse met extravasatie van erytrocyten. Intraveneuze Evans blue werd geïnjecteerd om de opening van de BBB in het pontine gebied te valideren. Extravasatie van Evans blue-geconjugeerd albumine werd waargenomen op het niveau van de pons en het cerebellum bij de muis behandeld met FUS en microbubbels, wat een nauwkeurige targeting van het gebied van belang aantoonde.
De belangrijkste stappen van dit protocol zijn de juiste
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een hoogdoorvoerprotocol voor de tijdelijke verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB) met behulp van een modulair gefocust ultrageluid (FUS) systeem. Door gebruik te maken van microbubbel-gemedieerde sonoporatie, maakt deze techniek de effectieve toediening van behandelingen mogelijk voor aandoeningen zoals gliomen die worden belemmerd door de BBB. De methodologie is ontworpen voor toegankelijkheid, waardoor niet-experts in vivo BBB-opening kunnen implementeren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biomedische Techniek
- Therapeutische Toediening
Achtergrond
- Hooggradige gliomen zijn zeer invasieve tumoren met beperkte behandelingsopties vanwege de BBB.
- Gefocust ultrageluid is opgekomen als een veelbelovende methode voor BBB-verstoring.
- Er bestaat een behoefte aan kosteneffectieve apparaten die gemakkelijk kunnen worden bediend door niet-experts.
- Het hier beschreven protocol beoogt preklinische medicijnevaluatiestudies te versterken.
Doel van het onderzoek
- Een hoogdoorvoer FUS-systeem ontwikkelen voor BBB-verstoring.
- Screening van voorgeselecteerde geneesmiddelen faciliteren voor precisiegeneeskundetoepassingen.
- De procedure effectief demonstreren met behulp van een geautomatiseerd systeem.
Gebruikte methoden
- Een modulair gefocust ultrageluidsysteem werd gebruikt voor in vivo-experimenten.
- Muismodellen werden gebruikt om BBB-verstoring en de toediening van therapeutische middelen te bestuderen.
- Het proces omvat interventionele beeldvorming en akoestische koppeling voor sonoporatie.
- Kritieke stappen omvatten acclimatisatie van dieren, toediening van anesthesie, katheterisatie en nauwkeurige positionering van de ultrageluidtransducer.
Belangrijkste resultaten
- De procedure heeft betrouwbaar de mogelijkheid aangetoond om de medicijntoediening over de BBB te verbeteren.
- Microbubbelcavitatiedetectie was essentieel voor het monitoren van de effectiviteit van de behandeling.
- Kwantitatieve resultaten bevestigden de nauwkeurige lokalisatie van de BBB-verstoring.
- Systemische effecten werden gemeten na toepassing van ultrageluid, wat veiligheid en werkzaamheid aantoonde.
Conclusies
- Deze studie stelt een praktische en effectieve methode vast voor BBB-verstoring, waardoor verbeterde therapeutische interventies mogelijk worden.
- Het aanpasbare FUS-systeem biedt een basis voor verder onderzoek naar medicijntoediening en behandeling van CZS-aandoeningen.
- De verkregen inzichten kunnen de begrip van precisiegeneeskunde en therapeutische targeting bij neurologische aandoeningen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This high-throughput focused ultrasound system enables precise, reproducible blood-brain barrier opening in rodent models, directly supporting preclinical drug evaluation for CNS therapeutics. By integrating image-guided stereotactic navigation with automated cavitation monitoring, the system reduces variability and enhances data reliability in high-volume screening campaigns. Its cost-effective, modular design facilitates scalable implementation across discovery workflows targeting glioma and other brain diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of blood-brain barrier permeability for target validation in glioma models.
- Operational Value: Supports standardized, automated workflows that reduce intra-group variability and improve reproducibility in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cavitation detection as a biomarker for successful blood-brain barrier opening.
- Operational Value: Enables high-throughput screening of preselected drug compounds through automated transducer positioning and microbubble delivery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Validated in patient-derived xenograft models of glioblastoma and diffuse midline glioma, ensuring disease-relevant preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by confirming precise, localized drug delivery across the blood-brain barrier.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling image-guided, reproducible blood-brain barrier disruption for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of blood-brain barrier modulation in glioma models through precise, stereotactic targeting.
- Screening: Delivers assay readiness via automated workflows, standardized microbubble injection, and real-time cavitation monitoring for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cavitation signals, Evans blue extravasation, and histological confirmation of barrier opening.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through validation in patient-derived glioma models, supporting biomarker-aligned therapeutic assessment.
- Enterprise Reuse: Built from commercially available components with a modular design, enabling adaptation across multiple research questions and repeated use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in blood-brain barrier penetration data, reducing mechanistic ambiguity in CNS drug delivery.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation and image-guided targeting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative blood-brain barrier opening data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS drug candidates based on confirmed, localized barrier disruption and drug delivery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, ultrasound physics, and microbubble handling.
- Needs instrumentation including function generator, power amplifier, motorized linear stage, needle hydrophone, and imaging modalities (X-ray, bioluminescence).
- Demands cross-team standardization of animal preparation, catheterization, and transducer calibration procedures.
- Involves adaptation considerations for different transducer frequencies, targeting coordinates, and model systems (e.g., rat vs. mouse).
- Practical limitations include the need for surgical skill in tail vein catheterization and potential variability in skull thickness affecting ultrasound transmission.
