Name: Faagtherapie toepassing om pseudomonas aeruginosa infectie tegen te gaan in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer faagtherapie toepassen tegen Pseudomonas aeruginosa-infectie in cystic fibrosis-zebravisembryo's. Deze methode maakt in vivo-evaluatie van faagefficiëntie mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo en FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

Volwassen zebravissen(Danio rerio)van de AB-stam (European Zebrafish Resource Center EZRC) worden onderhouden volgens internationale (EU-richtlijn 2010/63/EU) en nationale richtsnoeren (Italiaans decreet4 maart 2014, nr. 26) betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. In de visfaciliteit worden standaardomstandigheden vastgesteld met een donkere cyclus van 14 uur licht/10 uur en een temperatuur van het tankwater bij 28°C.
1. Voorbereiding van oplossingen en instrumenten
<ol><li>Bereid een 50x stockoplossing en 1x werkoplossingen voor E3 embryomedium voor het kweken van zebravisembryo's (zie tabel 1).</li>
	<li>Maak pigmentatieblokkeringsoplossing, om de embryopigmentatie te blokkeren vanaf 24 uur na de bevruchting (24 pk) (zie tabel 1).</li>
	<li>Bereid 25x voorraad en 1x werkende Tricane verdovingsoplossing zoals beschreven in tabel 1. OPMERKING: Om te voorkomen dat de oplossing herhaaldelijk wordt bevroren en ontdooid die de voorraadoplossing kan beschadigen, maakt u aliquots van 2 mL 25x tricaine en bewaar ze op -20 °C.</li>
	<li>Bereid sporen voor op embryomicro-injectie door 1 g agarose op te lossen in 100 mL gedistilleerde H2O in een microwavable kolf of fles. Magnetron gedurende 1-3 min tot de agarose volledig is opgelost.</li>
	<li>Plaats zebravis microinjectiemallen (zie Tabel van Materialen)ondersteboven gedraaid in een petrischaal (90 mm x 15 mm) en bedek het gehele oppervlak door de vloeibare agarose gel met een breedte van ongeveer 10 mm te gieten.</li>
	<li>Verwijder de mal zodra de agarose is gestold. Vul de Petri schotel met 1x E3 embryo medium. Dit kan ongeveer een week bij 4 °C worden bewaard. Voor gebruik vervangen door het verse E3-medium dat Tricaine bevat. OPMERKING: Oudere schimmels kunnen schimmels of bacteriële besmettingen ontwikkelen.</li>
	<li>Gebruik vuur gepolijst 10 cm borosilicaat haarvaten om naalden voor te bereiden op microinjectie en zet ze vast aan de micropipet trekker door het aandraaien van de handgrepen. Stel de trekker met de volgende instellingen: warmte 500, snelheid 100, tijd 150, trek 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) inoculumpreparaat
<ol><li>Inenting 1 kolonie GFP+P. aeruginosa stam PAO119 in 5 mL LB bouillon (zie tabel 1) en groeien 's nachts bij 37 °C met schudden (200 rpm).</li>
	<li>Verdun de bovenstaande nachtcultuur tot OD600 = 0,1 in 10 mL LB-bouillon en groei tot OD600 = 0,5 bij 37 °C met schudden (200 rpm).</li>
	<li>Centrifuge 2 mL van de cultuur gedurende 2 min bij 4 °C bij 16.100 x g en resuspend de celpellet tot OD600 = 1, gelijk aan ongeveer 1 x 109 cfu/mL, in 1 mL van de fysiologische oplossing (zie tabel 1).</li>
	<li>Verdun de celsuspensie tot ongeveer 5 x 107cfu/mL in fysiologische oplossing en bewaar bij 4 °C.</li>
</ol>3. Preparaat van faagvoorraden
<ol><li>Inenting 1 kolonie P. aeruginosa stam PAO1 in 5 mL LB bouillon en incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden. Verdun de nachtcultuur tot OD600 = 0,01 in 500 mL LB-bouillon en groei bij 37 °C met schudden tot OD600 = 0,05, wat overeenkomt met ongeveer 2,5 x 107 cfu/mL.</li>
	<li>Aan de verdunde cultuur van P. aeruginosa, voeg ongeveer 1,25 x 107 fagen toe, om de veelheid van infectie (M.O.I.) van 10-3te krijgen. Incubeer bij 37 °C met schudden tot de OD600 daalt tot ongeveer 0,1-0,3 (in ongeveer 3 tot 5 uur, afhankelijk van de gebruikte faag). OPMERKING: Vier fagen werden geselecteerd voor dit experiment dat PAO1-stam infecteert: Twee Podoviridae, GenBank-toetredingsnummers vB_PaeP_PYO2, MF490236 en vB_PaeP_DEV, MF490238 en twee Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 en vB_PaeM_E217, MF490240. Voer de onderstaande stappen voor elke faag afzonderlijk uit.</li>
	<li>Incubeer het lysaat met 1 mg/mL DNase en RNase gedurende 30 min bij 37 °C. Centrifuge bij 5.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en herstel voorzichtig de supernatant (SN). Filter de SN met een filter met een poriediameter van 0,8 μm.</li>
	<li>Voeg aan de SN 58 g/L NaCl en 105 g/L PEG6000 toe. Los op met roeren op RT 20 min en houd het dan 's nachts op 4 °C. Centrifuge bij 20, 000 x g gedurende 30 min bij 4 °C voor faagneerslag. Verwijder de SN en los de faagpellet voorzichtig op in 15 mL TN-buffer (zie tabel 1).</li>
	<li>Zuiver de fagen met cscl-dichtheidsgradiënt zoals beschreven in onderstaande stappen.<ol>
<li>Bereid in een polyallomer ultracentrifugebuizen voor SW41-rotor een CsCl-trapdichtheidsgradiënt voor door 2 mL van de vier CsCl-oplossingen te stratificeren die in tabel 1 zijnbeschreven.  Voeg 3,5 mL faagsuspensie toe in elk van de 4 buizen. OPMERKING: CsCl is giftig, hanteert de juiste veiligheidsprocedures om het te verwerken en weg te gooien.</li>
		<li>Introduceer de buizen in de rotor en zorg ervoor dat de buizen in balans zijn (het gewichtsverschil tussen de twee uit de ogen moet ≤ 0,01g zijn).</li>
		<li>Centrifuge voor 2 uur bij 4 °C en 100, 000 x g (25.000 tpm voor SW41 rotor). Na centrifugatie, langzaam verwijderen van de buizen en zorgvuldig immobiliseren ze op een steun. Met behulp van een spuit met 19 G naald, het opstellen van de witte / opalescente band die zich meestal tussen de d = 1,5 en de d = 1,4 dichtheid regio.</li>
		<li>Breng de suspensies van de spuit over in nieuwe polyallomerbuizen voor SW60-rotor en gebruik de d=1.4-oplossing om de buizen nauwkeurig in balans te brengen.</li>
		<li>Verenig de ophanging bij 4 °C en 150.0000 x g (38.000 tpm voor de SW60 rotor) voor ten minste 16 uur.</li>
		<li>Verzamel de zichtbare band zoals hierboven (zie stap 3.3.3) en breng ze over in dialysebuizen met 6.000 Da cut-off. Dialyze de verkregen zichtbare band 2x voor 20 min tegen 500 mL water en 's nachts tegen 500 mL TN buffer. Filter met een poriefilter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Faagcocktailbereiding
<ol><li>Maak een mix van vier fagen die de stam PAO1 infecteren, eerder geïsoleerd en gekenmerkt8. Voor het mengen, schat de titer van elke faagbouillon door plaque test20.</li>
	<li>Monteer de faagcocktail, met een totale titer van 5 ×10 8 pfu/mL, door evengoed vier faagpreparaten vlak voor elk experiment te mengen in dezelfde pfu/mL, om nauwkeurige faagtiters te garanderen.</li>
</ol>5. Inzameling en bereiding van embryo's van zebravis voor cftr morpholinos microinjectie
OPMERKING: Verzamel 1-2 celembryo's van wilde type zebravissen voor cftr morpholinos(cftr-MOs) microinjectie.
<ol><li>Twee dagen voor het bacteriële micro-injectieexperiment, zet zekpaars op en verzamelt embryo's zoals eerder beschreven21. Volwassen zebravissen (Danio rerio) van de AB stam werden gekocht van de Europese Zebrafish Resource Center, EZRC.</li>
	<li>De dag erna verzamelen de embryo's onmiddellijk na de bevruchting met een plastic pipet of met behulp van een fijnmazige zeef. Plaats de verzamelde embryo's in een petrischaaltje met E3-embryomedium en verwijder het puin voorzichtig met een plastic pipet om besmetting te voorkomen die de embryoontwikkeling zou kunnen beschadigen.</li>
	<li>Bereid 5 μL morpholino injectieoplossing voor door de twee morpholino stock oplossingen (1 mM) in steriel water te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splice-MO. Om de embryo-injectie te traceren, voeg 0,5 μL fenolrood toe aan de morpholino-injectieoplossingsmix.</li>
	<li>Laad een microinjectienaald met ongeveer 5 μL van de morpholino-mengoplossing met behulp van een 20 μL micropipet met een fijne gellaadpunt. Bevestig de naald op de micromanipulator aangesloten op een standaard en plaats deze onder een stereomicroscoop. OPMERKING: Het is niet nodig dat de oplossing de punt van de naald bereikt, omdat de druk van de microinjectorpomp het zal duwen.</li>
	<li>Knip de punt van de naald af door de naaldpunt met fijne steriele pincet door te snijden. Meet de diameter van de druppel met behulp van een schaalbalk in de oculaire van de microscoop. U ook een druppel minerale olie op een micrometerdia afschuifen en het microinjectievolume instellen door de oplossing in de oliedruppel te injecteren om de druppelgrootte te evalueren. Gebruik een druppel met een diameter van 156 μm om een volume van 2 nL te injecteren.</li>
	<li>Stel de microinjector in door de compensatiedruk aan te passen op 15 hPa, injectietijd op 0,5 s en injectiedruk tussen 300 en 600 hPa om het juiste injectievolume te verkrijgen, afhankelijk van de gebruikte naald.</li>
	<li>Met een plastic pipet schik je de embryo's van stap 5.2 op een glas in een petrischaal met een diameter van 96 mm. OPMERKING: Te veel E3-medium voorkomt de juiste penetratie van de micro-injectienaald in de chorion van de embryo's.</li>
	<li>Penetreer het chorion en vervolgens de dooier met de naald om 2 nL in het embryo te injecteren zoals eerder beschreven22.</li>
	<li>Plaats geïnjecteerde embryo's in een petrischaaltje met E3-medium en leg ze in een couveuse bij 28 °C om ze te laten ontwikkelen tot de dag erna.</li>
</ol>6. Microinjectie van embryo's van zebravis met bacteriën en faagcocktail
OPMERKING: Om een systemische infectie uit te voeren, moet het embryo een bloedcirculatie hebben die meestal begint na 26 pk.
<ol><li>Na 26 pkf (voor zebravis ontwikkelingsstadia verwijzen naar Kimmel21) dechorionate embryo's met pronaza oplossing bereid door het oplossen van pronaza poeder in E3 medium bij een concentratie van 2 mg/mL. Voorzichtig pipette de embryo's om het chorion te breken. Gooi het pronaza/E3-medium weg en spoel de schotel meerdere malen af met verse E3 om alle pronaza te verwijderen.</li>
	<li>Verdoes zebravisembryo's in E3-medium met Tricaine ongeveer 5 minuten voor injecties.</li>
	<li>Pipette de gesheste embryo's in de baan bereid in stap 1. Gebruik een fijne gel laadtip om de embryo's in de zijdelingse positie te lijnen.</li>
	<li>Laad een microinjectienaald met ongeveer 5 μL van het P. aeruginosa preparaat zoals beschreven in deel 5.</li>
	<li>Plaats de naald dorsally aan het beginpunt van het kanaal van Cuvier waar het begint te verspreiden over de dooier zak. Injecteer een volume van 1-3 nL en zorg ervoor dat het volume direct in het kanaal uitzet en in het verkeer komt.</li>
	<li>Ongeveer na elke 50 geïnjecteerd-embryo, injecteer een druppel van de bacteriën in een 1,5 mL centrifuge buis met 100 μL steriele PBS om te controleren of het injectievolume hetzelfde blijft. Plaats het entmateriaal op LB agar (zie tabel 1) op 37 °C 's nachts om de CFU te beoordelen.</li>
	<li>Breng de microinjected embryo's in twee schone petrischaaltjes met vers E3-medium + PTU en broed ze uit op 28 °C.</li>
	<li>Op twee geselecteerde tijdstippen: 30 min of 3 uur na de bacteriële injectie, neem een van de petrischaaltjes met bacteriële geïnjecteerde embryo's uit de couveuse en lijn ze uit in het spoor zoals beschreven in 6.3 voor de faagcocktailinjectie.</li>
	<li>Laad een microinjectienaald met ongeveer 5 μL van de faagcocktail (bereid in stap 4) met een fijne gellaadpunt en bevestig deze aan de microinjector (zie stap 5).</li>
	<li>Injecteer de faagcocktail in het kanaal van Cuvier van de embryo's die eerder met bacteriën werden geïnjecteerd.</li>
	<li>Breng de microinjected embryo's in twee schone petrischaaltjes met vers E3-medium + PTU en broed ze uit op 28 °C.</li>
</ol>7. Evaluatie van de bacteriële last van embryo's geïnjecteerd met PAO1 en fagen
<ol><li>Met 8 pk, pipet 15 verdoofde embryo's van de Petri schotel tot een 1,5 mL centrifuge buis.</li>
	<li>Vervang de verdovingsoplossing door 300 μL van 1% Triton X-100 in PBS (PBSTritonX) en homogeniseer de embryo's door ze minstens 15x door een insulinespuit met een steriele 27-G naald te laten passeren.</li>
	<li>Bereid seriële verdunningen van homogenaten in steriele PBS door 100 μL van het verdunde homogenaat over te brengen in 900 μL steriele PBS.</li>
	<li>Om te kiezen voor de natuurlijk resistente PAO1-stam, plaat 100 μL van de verdunningen op LB agar toegevoegd met ampicilline (100 μg/mL), en incubeer bij 37 °C 's nachts.</li>
	<li>De dag erna, tel het aantal kolonies, vermenigvuldig met de verdunningsfactor om het totale aantal CFU te bepalen, en deel door het aantal embryo's gehomogeniseerd om het gemiddelde aantal CFU / geïnfecteerde embryo te verkrijgen.</li>
</ol>8. Evaluatie van de dodelijkheid van embryo's geïnjecteerd met PAO1 en fagen
<ol><li>Om de dodelijkheid van de PAO1-infectie te evalueren, scoort u de geïnjecteerde embryo's op 20 hpi onder een stereomicroscoop en telt u voor de dode embryo's (wit/niet transparant).</li>
	<li>Bereken de half-maximale dodelijke concentratie 50 (LD50) dosis PAO1 die de dood van 50% van de geïnjecteerde embryo's bij 20 hpf bepaalt.</li>
</ol>9. Embryovoorbereiding voor stereomicroscoop time-lapse beeldvorming van GFP+ PAO1 infectie
<ol><li>Bereid de mal voor live-embryo beeldvorming door het oplossen van 1,5% laag smelten agarose in 100 mL van E3 oplossing.</li>
	<li>Voeg 1% Tricaine (zie tabel 1)toe om de embryo's te verdoven.</li>
	<li>Bij 4 hpi breng je een embryo met een plastic pipet in een glazen bodemschaal en voeg je de warme laag-smeltpuntagarose-oplossing toe.</li>
	<li>Plaats de glazen bodemschaal onder een stereomicroscoop en plaats het embryo met een tip in de gewenste richting. Gebruik een plastic pipet om voorzichtig een druppel agarose op het embryo toe te voegen.</li>
	<li>Laat de agarose 5-10 minuten afkoelen en vul de glazen bodemschaal voorzichtig met E3 met de verdovingsoplossing om het embryo vochtig te houden.</li>
	<li>Plaats de glazen bodemschotel met het embryo onder de fluorescerende stereomicroscoop met een fluorescerend filter (kanaal 488 nm) voor GFP+ bacteriën. Verwijder de petrischaal pas bij verdere aanwinsten met dezelfde parameters op 9, 14 en 18 hpi.</li>
</ol>10. Expressie-analyses van pro-inflammatoire cytokinen
<ol><li>Verdoof de embryo's met 20 hpi met tricaine 1x-oplossing en breng ze van de Petri schotel naar een 1,5 mL centrifugebuis.</li>
	<li>Verwijder onder een rookkap de verdovingsoplossing en vervang deze door 200 μL guanidiumhydrochloridereagens.</li>
	<li>Homogeniseer embryo's door ze eerst herhaaldelijk door een pipet van 200 μL te pipetten en vervolgens minstens 15x met een insulinespuit met een steriele 27 G naald.</li>
	<li>Haal het totale RNA uit gehomogeniseerde zebravisembryo's met behulp van een commercieel verkrijgbaar guanidiumhydrchloridereagentia volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Behandel 1 μg van elk monster RNA met 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-vrij), volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Gebruik 1 μg DNase I behandeld RNA voor reverse-transcriptie reactie (RT) met behulp van commercieel beschikbare kit (zie Tabel van Materialen), in een totaal volume van 20 μL volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Voer RT qPCR-reactie uit in een totaal volume van 10 μL met 1x SYBR Green mastermix met behulp van 1,5 μL van een 1:6 verdunning van rt-reactie. Gebruik voor normalisatiedoeleinden de primers voor de huishoudgenen rpl8 en voor pro-inflammatoire cytokinen primers voor TNF-α en IL-1β (zie tabel 2). qPCR protocol was: cyclus 1 stap 1: 95 °C, 2 min, herhaal een keer; cyclus 2: stap 1 95 °C, 10 s, stap 2 55 °C, 30 s, herhaal 40x; cyclus 3: stap 1 72 °C, 15 min.</li>
</ol>

<ol><li>Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment%3A+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+phage+therapy+in+cystic+fibrosis%3A+Essential+human-bacterial-phage+interactions+and+delivery+considerations+for+use+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).</li>
<li>Pacios, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+combat+multidrug-resistant+and+persistent+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases.</a> Antibiotics. 9 (2), 65(2020).</li>
<li>Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplication+of+bacteriophage+in+vivo+and+its+protective+effect+against+an+experimental+infection+with+shigella+dysenteriae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae.</a> Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).</li>
<li>Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+therapeutically+administered+bacteriophages+in+Pseudomonas+aeruginosa+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients.</a> Burns. 32 (5), 644-656 (2006).</li>
<li>Heo, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+efficacy+of+phages+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+mice+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646(2009).</li>
<li>McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+a+mouse+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028(2007).</li>
<li>Forti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+broad-range+bacteriophage+cocktail+that+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+treats+acute+infections+in+two+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573(2018).</li>
<li>Jault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+a+cocktail+of+bacteriophages+to+treat+burn+wounds+infected+by+Pseudomonas+aeruginosa+%28PhagoBurn%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial.</a> Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).</li>
<li>Clatworthy, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+of+zebrafish+involves+both+host+and+pathogen+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants.</a> Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).</li>
<li>Bernut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Protects+against+Mycobacterium+abscessus+Infection+by+Fine-Tuning+Host+Oxidative+Defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses.</a> Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).</li>
<li>Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+phage+therapy+efficacy+in+Burkholderia+cepacia+complex+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388(2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Doring, G., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+innate+immunity%3A+how+chloride+channel+mutations+provoke+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease.</a> Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).</li>
<li>Navis, A., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cftr+function+leads+to+pancreatic+destruction+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish.</a> Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).</li>
<li>Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cftr+controls+lumen+expansion+and+function+of+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 140, 1703-1712 (2013).</li>
<li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979(2015).</li>
<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit manuscript beschreven we het protocol om P. aeruginosa (PAO1) infectie uit te voeren in zebravisembryo's en hoe faagtherapie toe te passen met een cocktail van fagen die eerder was geïdentificeerd als in staat om PAO1 te infecteren om het op te lossen. Het gebruik van bacteriofagen als alternatief voor antibioticabehandelingen is de laatste jaren steeds meer in het oog. Dit is voornamelijk te wijten aan de verspreiding van multiresistente (MDR) bacteriële infecties, die een ernstig probleem vormen voor de...

Faagtherapie, het gebruik van de natuurlijke vijanden van bacteriën om bacteriële infecties te bestrijden, is garnering hernieuwde belangstelling als bacteriële resistentie tegen antibiotica wordt wijdverbreid1,2. Deze therapie, die al tientallen jaren in Oost-Europa wordt gebruikt, kan worden beschouwd als een aanvullende behandeling van antibiotica bij het genezen van longinfecties bij patiënten met CF en een mogelijk therapeutisch alternatief voor patiënten die besmet zijn met bacteriën die resistent zijn tegen alle antibiotica die momenteel in gebruik zijn2,3. Voordelen van antibioticatherapie zijn dat bacteriofagen zich vermenigvuldigen op de besmettingsplaats, terwijl antibiotica worden gemetaboliseerd en uit het lichaam worden geëlimineerd4,5. De toediening van cocktails van virulente fagen die geïsoleerd zijn in verschillende laboratoria heeft bewezen effectief te zijn bij de behandeling van Pseudomonas aeruginosa-infecties in diermodellen zo verschillend als insecten en zoogdieren6,7,8. Faagtherapie bleek ook in staat te zijn om de bacteriële belasting in brandwonden besmet met P. aeruginosa en Escherichia coli te verminderen in een gerandomiseerde klinische studie9.
Zebravis (Danio rerio) is onlangs naar voren gekomen als een waardevol model om infecties met verschillende ziekteverwekkers te bestuderen, waaronder P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus en Burkolderia cepacia12,13. Door bacteriën rechtstreeks in de embryobloedcirculatie14 te microinjecteren is het gemakkelijk om een systemische infectie op te zetten die wordt tegengegaan door het aangeboren immuunsysteem van zebravissen, dat evolutionair wordt geconserveerd met neutrofielen en macrofaaggeneratie vergelijkbaar met de menselijke tegenhanger. Bovendien, tijdens de eerste maand van het leven, zebravis embryo's missen de adaptieve immuunrespons, waardoor ze ideale modellen voor het bestuderen van de aangeboren immuniteit, dat is de kritische afweermechanisme bij menselijke longinfecties15. Zebravissen ontpopten zich onlangs als een krachtig genetisch modelsysteem om het cf-begin beter te begrijpen en nieuwe farmacologische behandelingen te ontwikkelen10,16,17. Het CF zebrafish model van cftr knock-down gegenereerd met morpholino injectie in zebravissen presenteerde een gedempte ademhalingsuitbarsting respons en verminderde neutrofiele migratie10, terwijl de cftr knock-out leidt tot verminderde interne orgaanpositie en de vernietiging van de exocrine alvleesklier, een fenotype dat de menselijke ziekteweerspiegelt 16,17. Van het grootste belang was de bevinding dat de P. aeruginosa bacteriële last aanzienlijk hoger was in cftr-loss-of-function embryo's dan in controles op 8 uur na infectie (hpi), die parallel loopt met de resultaten verkregen met muizen en menselijke bronchiale epitheliale cellen2,18. cftr
In dit werk tonen we aan dat faagtherapie effectief is tegen P. aeruginosa infecties in zebravis embryo's.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phospate buffered saline PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>common name tricaine</td></tr><tr><td>Femtojet Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/brown P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection needles</td><td>Harvard apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea >=98%</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Morpholino</td><td>Gene Tools</td><td></td><td>designed by the researcher</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride ACS reagent, &ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Microinjection</td><td>Word Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

faagtherapie toepassing om pseudomonas aeruginosa infectie tegen te gaan in cystic fibrosis zebrafish embryo's

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Antimicrobiële resistentie, een belangrijk gevolg van diagnostische onzekerheid en antimicrobiële overprescriptie, is een steeds meer erkende oorzaak van ernstige infecties, complicaties en sterfte wereldwijd met een enorme impact op onze samenleving en op het gezondheidssysteem. In het bijzonder worden patiënten met een gecompromitteerd immuunsysteem of reeds bestaande en chronische pathologieën, zoals cystische fibrose (CF), onderworpen aan frequente antibioticabehandelingen om de infecties te beheersen met het verschijnen en verspreiden van multiresistente isolaten. Daarom is er een dringende noodzaak om alternatieve therapieën aan te pakken om bacteriële infecties tegen te gaan. Het gebruik van bacteriofagen, de natuurlijke vijanden van bacteriën, kan een mogelijke oplossing zijn. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, beschrijft de toepassing van faagtherapie tegen Pseudomonas aeruginosa-infectie in CF-zebravisembryo's. Zebravis embryo's werden besmet met P. aeruginosa om aan te tonen dat faagtherapie effectief is tegen P. aeruginosa infecties als het vermindert letaliteit, bacteriële last en pro-inflammatoire immuunrespons in CF embryo's.

De hier gepresenteerde resultaten en cijfers worden verwezen naar CF-embryo's die worden gegenereerd door de injectie van cftr-morfoos zoals eerder beschreven10 en in stap 5. Om het CF-fenotype te valideren, werd de verminderde positie van inwendige organen zoals hart, lever en alvleesklier in aanmerking genomen zoals eerder beschreven17 (figuur 1). Soortgelijke resultaten werden verkregen in het geval van de WT embryo's zoals gerappor...

Hier gepresenteerd is een protocol voor Pseudomonas aeruginosa infectie en faagtherapie toepassing in cystische fibrose (CF) zebravis embryo's.

Faagtherapie toepassing om pseudomonas aeruginosa infectie tegen te gaan in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryo's

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Dit protocol vergemakkelijkt de bereiding en toediening van een virale en faagcocktail tegen pseudomonas aeruginosa in zebravisembryo's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een in vivo beoordeling van de faag werkzaamheid in het tegengaan van de bacteriële infectie mogelijk maakt. De faagcocktail is efficiënt in zowel wilde type als cystische fibrose zebravis modellen.Het openen van de mogelijkheid om de faagtherapie toe te passen op bacteriële infecties bij patiënten met cystische fibrose. Faagtherapie kan ook worden toegepast om specifieke bacteriële infecties in andere modelsystemen tegen te gaan. Om een faagvoorraad voor het experiment voor te bereiden.Voeg 1,25 keer 10 aan de zevende fagen toe aan een OD 600 van 0,05 P.aeruginosa-cultuur aan een veelheid van infectie van één keer 10 tot de negatieve drie en broed de cultuur gedurende drie tot vier uur uit met schudden tot de OD 600 daalt tot 0,1 tot 0,3. Aan het einde van de incubatie incubeer het lysaat met een microgram per milliliter DNAse en RNAse gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. En pellet de cellen door centrifugatie.Aan het einde van de centrifugatie filter de supernatant door een 0,8 micro meter porie diameter en voeg 58 gram per liter natriumchloride en 105 gram per liter PEG 6000. Broed de oplossing 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, neerslaan de faag door centrifugatie.Verwijder aan het einde van de centrofugatie de supernatant en los de faagpellet voorzichtig op in 15 milliliter tris natriumchloridebuffer. Om de fagen te zuiveren door cesiumchloride dichtheid gradiënt, eerst stratificeren twee milliliter van vier verschillende cesiumchloride oplossingen in polyallomer ultracentrifuge buizen voor een SW 41 Rotor en voeg 3,5 milliliter van de faag suspensie aan elke buis. Cesiumchloride is giftig.Neem altijd de juiste veiligheidsprocedures bij het hanteren en weggooien van deze verbinding. Wanneer alle buizen zijn geladen, plaats de buizen in de rotor en zorg ervoor dat de buizen in balans zijn. En centrifugeren de monsters voor twee uur op 100, 000 keer g en vier graden Celsius.Gebruik aan het einde van de centrifugatie een spuit met een naald van 19 meter om de witte laag tussen de D op te halen gelijk aan 1,5 en de D is gelijk aan 1,4 dichtheidsgebieden. En breng de suspensies over in nieuwe SW 60 size polyallomer buizen. Centrifugeren de schorsingen gedurende ten minste 16 uur bij 150, 000 keer g en vier graden Celsius.En breng de zichtbare banden over in dialysebuizen met een 6.000 Dalton cutoff. Dan dialyseren de verzamelde monsters twee keer tegen 500 milliliter water gedurende 20 minuten per dialyse en 's nachts tegen 500 milliliter tris natriumchloride buffer. De volgende ochtend, filter de resulterende faag voorraad met een 0,22 micro meter porie filter en bewaar de voorraad op vier graden Celsius.Op de dag van de micro-injectie verdunnen twee een micromolar morpholinos voorraad oplossingen in steriel water tot een uiteindelijke concentratie van 0,25 picomolar per embryo om een vijf microliter morpholino injectie oplossing te verkrijgen. En voeg 0,5 microliter fenolrood toe aan elke oplossing. Gebruik vervolgens een 20 microliter micropipet met een fijne gel laadtip om een micro-injectienaald te laden met het volledige volume van morpholino gemengde oplossing en zet de naald vast aan een micro manipulator aangesloten op een standaard onder een stereomicroscoop.Vervolgens met een of twee cellen, zebra vis embryo's gerangschikt op een glazen glijbaan geplaatst in een 96 millimeter diameter petrischaal, dringen de chorion en de dooier met de micro-injectie naald tip en injecteren twee nanoliters van de morphlino mengsel in het embryo. Laad na 26 uur bevruchting een micro-injectienaald met ongeveer vijf microliters P.aeruginosa-inoculum en steek de naald dorsaal in bij het startpunt van het kanaal van Cuvier waarbij het kanaal zich over de dooierzak begint te verspreiden. Injecteer een tot drie nanoliter van het PAO1-entmateriaal in het embryo om ervoor te zorgen dat het volume zich direct in het kanaal uitbreidt en in het verkeer komt.Na de injectie breng het embryo in een van de twee nieuwe petrischaaltjes met verse E3-medium aangevuld met fenylthiourea voor een 30 minuten of drie uur incubatie bij 28 graden Celsius. Laad vervolgens een micro-injectienaald met ongeveer vijf microliter van de faagcocktail en bevestig de naald aan de micro-injector. Injecteer vervolgens een tot drie nanoliter faagcocktail in het kanaal van Cuvier van elk embryo dat eerder met bacteriën werd geïnjecteerd en plaats de embryo's in een van de twee nieuwe petrischaaltjes met verse E3-medium aangevuld met fenylthiourea bij 28 graden Celsius.Gebruik na vier uur na infectie een plastic pipet om een verdoofd embryo over te brengen in een glazen bodemschaal. En vul de schotel met warme lage smeltpunt agarose oplossing. Wanneer de agarose koud is, vul de schotel voorzichtig met E3 medium aangevuld met verdovingsoplossing.Plaats de schotel onder de stereomicroscoop en gebruik een pipettip om het embryo in de gewenste richting te plaatsen. Plaats vervolgens de schotel onder een fluorescerende stereomicroscoop met een fluorescerend filter voor GFP-positieve bacteriën voor maximaal 18 uur na infectie en beeld het embryo voor de progressie van GFP-expressie op negen, 14 en 18 uur na infectie. Om de bacteriële last te bepalen op acht uur na infectie, breng 15 verdoofde micro-geïnjecteerde embryo's over in een 1,5 milliliter centrifugebuis en vervang de verdovingsoplossing door 300 microliter van 1%Triton X-100 in PBS.Geef de naalden minstens 15 keer door de steriele 27-meter naald van een insulinespuit om de embryo's te homogeniseren. En bereid seriële verdunningen van het homogenaat door 100 microliter van het resulterende mengsel over te brengen in 900 microliter van steriele PBS per verdunning. Om te selecteren voor de natuurlijk ampicillineresistente P.aeruginosa-stam, plaat 10 microliter van de verdunningen op LB agar aangevuld met ampicilline en ze 's nachts incubeer bij 37 graden Celsius.De volgende dag tellen het aantal kolonies. Om de berekening mogelijk te maken van het totale aantal kolonievormende eenheden en het gemiddelde aantal kolonievormende eenheden per besmet embryo. Om de dodelijkheid van de P.aeruginosa-infectiescore te evalueren, scoren de geïnjecteerde embryo's na 20 uur na infectie onder een stereomicroscoop door het aantal dode witte ondoorzichtige embryo's te tellen.Bereken vervolgens de half maximale dodelijke concentratie 50 dosis P.aeruginosa die resulteerde in de dood van 50% van de geïnjecteerde embryo's na 20 uur na infectie. Om het cystische fibrose fenotype te valideren kan de verminderde positie van inwendige organen zoals de hartlever en alvleesklier worden geëvalueerd. De bacteriële belasting wordt verminderd door faagtherapie bij cystische fibrose embryo's besmet met P.Aeruginosa.In 48 uur na de bevruchting cystic fibrosis embryo's besmet met GFP positieve P.Aeroginosa bacteriën een 30 kolonie vormen eenheden per embryo dosis toont een 50%letaliteit op 20 uur na infectie. Faagtherapie is even effectief bij 20 uur na infectie wanneer geleverd 30 minuten of zeven uur na bacteriële injectie. Hier wordt een cystische fibrose en GFP-positieve P.Aeruginosa geïnjecteerd embryo op vier, negen, 14 en 18 uur na infectie.In tegenstelling tot de cystische fibrose plus P.Aeruginosa plus faag geïnjecteerd embryo toont een verminderde fluorescentie als gevolg van de faag actie tegen de bacteriën. De ontstekingsreactie die wordt gegenereerd door P.aeruginosa-infectie bij cystische fibrose embryo's wordt aanzienlijk verhoogd, zoals blijkt uit de expressie van de pro-inflammatoirecytokines, TNF alfa en interleukine 1 beta na P.aeruginosa-injectie in vergelijking met de controle geïnjecteerde zebravissen. De expressie van beide inflammatoire cytokinen wordt echter verminderd in faagcocktail co-geïnjecteerde dieren.De fagen moeten zorgvuldig worden gezuiverd om het besmettings-endotoxine te verwijderen dat tijdens het preparaat kan worden bewaard. De faagpreparaten kunnen worden geanalyseerd door elektronenmicroscopie om de virionmorfologie te beoordelen. Het zou interessant zijn om te testen of de infectie bij menselijke patiënten door andere bacteriën dan pseudomonas aeruginosa kan worden genezen met faagtherapie in het cystische fibrose zebravismodel.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

The video demonstrates the phage therapy technique targeting Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis zebrafish embryos. Phage therapy effectively diminishes bacterial load and mitigates proinflammatory immune responses in CF zebrafish embryos infected with bacteria, leading to reduced CF embryo lethality.

A Phage Therapy against Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish Embryos

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

In vivo ruimte-tijdelijke interacties van pathogeen en immuunafweer op het mucosale niveau zijn niet gemakkelijk in beeld te brengen in bestaande gewervelde gastheren. De hier gepresenteerde methode beschrijft een veelzijdig platform om mucosale candidiasis bij levende gewervelden te bestuderen door gebruik te maken van de zwemblaas van de juveniele zebravis als een infectieplaats.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Dit protocol beschrijft het gebruik van sump swabs en slib analyse van zebravis systemen, die tot verhoogde detectie in vergelijking met het exclusieve gebruik van sentinels leidt te detecteren ziekteverwekkers zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en  Pseudocapillaria tomentosa. Een systeem om te controleren van P. tomentosa eieren in quarantaine wordt ook voorgesteld.

Milieu Screening van Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish systemen

Hier beschrijven we een protocol voor de immunisatie van de volwassen zebravissen (Danio rerio) met een op basis van DNA vaccin en de validatie van een succesvolle vaccinatie evenement aan te tonen. Deze methode is geschikt voor de preklinische screening van vaccin kandidaten in verschillende modellen van de infectie.

Immunisatie van volwassen Zebrafish voor de preklinische Screening van DNA-gebaseerde vaccins

Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het genereren en oplossen van problemen met xenotransplantaten voor acute lymfatische leukemie (ALL) bij de mens uit cellijnen en vers patiëntenmateriaal in kortstondig immunosuppressie-zebravisembryo's, samen met richtlijnen voor de beoordeling van de geneesmiddelrespons met behulp van flowcytometrie. De experimentele pijplijn kan ook worden aangepast voor solide tumoren.

Snelle in vivo voorspelling van geneesmiddelrespons met behulp van leukemieceltransplantaten in zebravisembryo's

Er is momenteel een gebrek aan in vivo modellen die geschikt zijn voor screening van geneesmiddelen tegen chronische bacteriële infecties. Hier beschrijven we een protocol voor wondinfectie door een Pseudomonas aeruginosa klinisch isolaat om een persisterende infectie bij zebravislarven te genereren.

Modellering van persistente Pseudomonas aeruginosa-infectie bij gewonde zebravislarven

Leer faagtherapie toepassen tegen Pseudomonas aeruginosa-infectie in cystic fibrosis-zebravisembryo's. Deze methode maakt in vivo-evaluatie van faagefficiëntie mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

Faagtherapie toepassing om pseudomonas aeruginosa infectie tegen te gaan in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryo's

Meer video's verkennen