Toepassing van een drie-dimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide stamcellen induceren

Verschillende mechanische belastingparameters kunnen pees-afgeleide STAMcellen veroorzaken die in verschillende cellen worden onderscheiden. We introduceren een gedetailleerd proces van de toepassing van deze driedimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide STAM cellen induceren. Tendinopathie is een van de meest voorkomende sportblessures in de orthopedische afdeling.

De aanwezigheid van achilles tendinopathie komt het meest voor met maximaal 29% voor midden-en lange afstand lopers, terwijl de aanwezigheid van patella tendinopathie is ook hoog in atleten van volleybal, basketbal, atletiek, handbal, en voetbal. Echter, als gevolg van de beperkte zelfhelende vermogen van pees en het gebrek aan effectieve behandeling, tendinopathie heeft nog steeds een aanzienlijk negatief effect op de kwaliteit van leven van patiënten. Pees afgeleide STAM cellen, bekend als TSCs als de belangrijke voorloper cellen van pezen cellen, spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van tendinopathie, evenals hun functionele en structurele restauratie na tendinopathie.

Anders dan mechanische belastingparameters, zoals belastingsstress, laadfrequentie, laadtype en laadperiode, kunnen TDSC's zich in verschillende cellen onderscheiden. Dus, een effectieve en geldige mechanische belasting regime is zeer belangrijk voor pees genesis. Er zijn zeven stadia van het huidige protocol, met inbegrip van isolatie van muizen TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen TSCs, voorbereiding van stimulatie cultuur medium voor cel bladvorming, cel bladvorming door culturing in stimulatie medium, voorbereiding van 3D pees STAMcel constructie, assemblage van de uniaxiale cellen stretching mechanische stimulatie complex, en evaluatie van de mechanische gestimuleerd in vitro pees-achtig weefsel.

Isolatie van muizen TDC's. Gebruikt bij muizen die zes tot acht weken oude muizen door cervicale dislocatie. Oogst patellapezen en achillespezen.

Verteren pees met zes milliliter Type 1 collagenase gedurende drie uur. Verzamel de cellen en cultuur het in volledige alfa-MEM met 10% van FBS en 1% van streptomycine en penicilline mengsel gedurende zeven dagen. TSCs identificeren met fluorescentie geactiveerde celsorling op stroomcytometrie, expressie van celoppervlakmarkeringen, waaronder CD44, CD90 en Sca-1.

Gebrek aan de uitdrukking van CD34 en CD45. Doorgang en vriescellen. Doorgangscellen zullen worden gebruikt voor verdere stappen.

Cultuur en uitbreiding van muizen TDC's. Neem de opgewarmde muizen pees STAM cellen. Voeg langzaam extra vier tot vijf milliliter van volledige alfa MEM.

Breng het mengsel in een 15 milliliter centrifuge buis door een pipet. Herhoog met medium tot een totaal van acht milliliter door een pipet. Plaats de buis in centrifuge een goed evenwicht.

Centrifugecellen op 347 g gedurende vijf minuten. Haal een buis uit de centrifuge. Controleer de pellet aan de onderkant.

Decanteer het vrije medium. Opnieuw cellen voorzichtig opschorten in een tot twee milliliter compleet medium. Vermijd het maken van te veel bubbels.

Breng opnieuw opgehangen cellen over naar een T75-kolf door een pipet. Gebruik een pipet om volledig alfa-MEM-medium aan de kolf toe te voegen om een totaal volume van 10 milliliter te bereiken met de uiteindelijke concentratie van 13.000 cellen per vierkante centimeter. Plaats de kolf in de couveuse en kweek deze op 37 graden met 5% kooldioxide.

Verander het medium om de drie dagen. Observeer en monitor de cellen onder een microscoop bij het veranderen van het medium totdat cellen werden gekweekt tot 100% samenvloeiing. Voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming.

Giet 15 milliliter complete alfa MEM medium in een 15 milliliter steriele buis. Voeg zes microliter ascorbinezuur in 15 milliliter medium aan de uiteindelijke concentratie van 4,4 microgram per milliliter. Meng zachtjes door op en neer te keren.

Celbladvorming door te kweken in stimulatiemedium. Gooi niet-normaal volledig alfamemmedium voorzichtig weg. Raak de cellen aan de onderkant van de kolf niet aan.

Voeg 10 milliliter stimulatie medium langzaam. Vermijd verstoring van de volledig samenvloeiende cellen. Kweek de cellen in stimulatiemedium gedurende negen dagen en verander het medium om de drie dagen om voldoende celblad te genereren bij 37 graden met 5% kooldioxide.

Voorbereiding van 3D pees STAMcelconstructie. Haal de kolf uit de couveuse. Gooi het stimulatiemedium volledig weg.

Was de monolaag celplaat met PBS door de kolf te wervelen. Gooi de PBS volledig weg. Gebruik een pipet om een milliliter, 0,25% trypsine toe te voegen aan de hoek van de kolf.

Tik op de hoek van de kolf om het monolaagcelvel los te maken totdat de hoek van het celvel de onderkant van de kolf wast. Voeg onmiddellijk negen milliliter complete alpha MEM medium om de reactie van trypsinization te stoppen. Blijf de kolf wervelen om het monolaagcelvel volledig af te pellen.

Giet het totaal om de cel vel hechten in petrischaal met medium. Gebruik een steriele pincet om een hoek van het celblad op te rapen en 15 keer met de klok mee te draaien. Pak een ander uiteinde van het celblad en draai 10 keer tegen de klok in om een peesachtige in vitro constructie te formuleren.

Montage van het uniaxial-stretching mechanische stimulatiecomplex in uniek ontworpen bioreactor. Sluit de haken door de connector, dan aan te passen aan twee centimeter tussen twee haken. Wind de 3D TDC's voorzichtig drie keer op de demohaak aan elke haak.

Zet de haken met celconstructie op de kamer van de bioreactor door de schroeven aan twee uiteinden aan te draaien. Vul de kamer met het complete alfa-MEM-medium. Sluit de versneller via de kabel aan op de kweekkamer.

Snijd de haaks connector door steriele pincet. Schakel de vermogens- en kanaalcontroller in om een mechanische stimulatie te starten. Zet het deksel op de kamer, volg de indicator lichten, en zorg ervoor dat de bioreactor goed kan functioneren.

Zet de bioreactor in de couveuse en onderwerp de 3D-cel constructie aan mechanische stretching. Het laadregime is 6%-stam, 0,25 Hertz-frequentie, acht uur gevolgd door 16 uur rust gedurende zes dagen. Evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitro peesachtig weefsel.

maak de schroeven los door een schroevendraaier en haal de montage voorzichtig uit. Zet de pees-achtige weefsel in 4%PFA voor fixatie gedurende 15 minuten, Plaats de vaste pees-achtige weefsel in een biopsie cassette met biopsie van huisdieren. Proces om een monster te dehydrateren.

En tot slot, evalueren door de ZvH histologische status. Herhaal het hele protocol en extract RNA uit de pees-achtige weefsel voor de evaluatie van de expressie van tenogene markers door qPCR. Vóór mechanische stimulatie zullen TSCs groeien tot 100% samenvloeiing in volledig medium en een ongeorganiseerde uiterlijke structurele morfologie weergeven.

Na zes dagen zag je volgende stretching, mechanische belasting, extra cellulaire matrix, en de cel uitlijningen waren goed georiënteerd. Cellen waren goed bevolkt en goed gehuld in ECM na mechanische belasting. Celmorfologie werd gepresenteerd om te worden gevestigd en was meer vergelijkbaar met normale peescellen in vergelijking met degene met zonder stretching.

Celdichtheid in celconstructie met belasting was hoger dan die zonder belasting. qPCR resultaten toonden aan dat de huidige zaken verhoogde de expressie van tenogene markers, met inbegrip van scleraxis, Mohawk, tenomodulin, en Type 1 collageen in vergelijking met degenen die door de genoemde cultuur. In termen van mechanische stimulatie bioreactor systeem, gescheiden kamer met lineaire motor werd gebruikt in ons huidige protocol.

Omdat het nauwkeurige mechanische belasting kan bieden en het is draagbaar en gemakkelijk aan te passen in vergelijking met de manieren waarop de traditionele 2D-cellen blad en de biaxiale stretch, 3D-cel constructie is meer vergelijkbaar met de echte vorm van pees. En de uniaxiale rek is meer vergelijkbaar met de sterke punten kenmerken van peescellen. Dit biedt een theoretische basis van het gebruik van 3D uniaxiale uitgerekt systeem om de differentiatie van TDC's te stimuleren.

Zo werd 2D-celblad uiteindelijk doorgestuurd naar een 3D-celconstructie en onderging het eenaxiale in het huidige protocol. Volgens ons bioreactorsysteem is ons laadregime 6%-stam, 0,25 Hertz-frequentie, acht uur gevolgd door 16 uur rust gedurende zes dagen. Ten slotte werd de effectiviteit van het protocol aangetoond door morfologie en het expressieniveau van tenogene markers.

Het hele operatieproces is eenvoudig, maar de operator moet aandacht besteden om de omgeving van TDSC te allen tijde gesteriliseerd te houden. Er zijn vele toepassingen van ons protocol. Het proces van het stimuleren van TDC's om differentiatie in vivo na te bootsen is nuttig voor het onderzoek van pathologisch proces van tendinopathie.

Bovendien biedt dit protocol een reproduceerbare methode voor gerichte differentiatie van TDC's in peesachtig weefsel. Dus het kan eenvoudig en effectief worden gebruikt voor potentiële gemanipuleerde peescultuur. Samengevat, het toepassen van een 3D uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar, en een geldige methode om tenogene differentiatie van TSCs induceren.

Ons protocol geeft het hele proces in detail.