Gestroomlijnde bemonstering en teelt van de Pelagische Kosmopolitische Larvacean, Oikopleura dioica

Dit protocol laat visueel zien hoe je een betrouwbaar cultuursysteem op lange termijn opzetten voor de mariene pelagische tunicate Oikopleura dioica. Oikopleura cultuursysteem biedt de basismiddelen om een breed scala van biologische gebieden met betrekking tot ecologie, ontwikkeling, genomics en evolutie te onderzoeken. Deze soort heeft een korte levenscyclus, hoge fecundity, en het kan gemakkelijk worden verzameld vanaf de kust, waardoor het een uitstekend model organisme.

Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor O.dioica, hopen we dat het kan worden toegepast op andere planktonische organismen. Om te beginnen, initiëren algen voedsel om Oikopleura cultuur te ondersteunen, te beginnen met autoclaving gefilterd zeewater. Om een voorraadcultuur van Chaetoceros calcitrans te initiëren, werd 60 mils autoclaved zeewater aangevuld met de volgende:30 microliter vitaminen, 30 microliter van oplossing A, 15 microliter natriumsilicaat en 60 microliterten van streptomycine.

Ten slotte werden 30 microliters van C.calcitrans uit een vorige voorraadcultuur toegevoegd als entmateriaal. Raadpleeg tabel twee in het manuscript over supplement- en inentingsvolumes voor de andere algensoorten en cultuursoorten. Na inenting worden de voorraad en subculturen gehandhaafd in een couveuse op 17 graden Celsius met continue verlichting.

Na ongeveer 10 dagen wordt de algengroei bevestigd doordat de kolven gekleurd worden. Wanneer dit gebeurt, verplaats de voorraad culturen op lange termijn opslag op vier graden Celsius voor maximaal een maand met behoud van de subcultuur in dezelfde incubator. Om een werkcultuur te creëren, voeg je de nodige supplementen toe aan 400 mils autogevlaveerd zeewater en inentuleren met 100 mils van de vorige subcultuur.

Sluit de kolf af met een rubberen dop, steek een wegwerppipet van een miljoen in en verplaats ze naar een algenstation en bewaar ze op kamertemperatuur met een acht uur durende fotoperiode en constante beluier. Draai twee maal per dag met de hand algenculturen om aggregatie aan de onderkant van de kolf te voorkomen. Zodra de algenculturen zijn vastgesteld, verzamel veldmonsters op een lokale site.

Giet een plankton net, en laat de kabeljauw einde te zinken een tot twee meter onder het oppervlak. Sleep het net met een snelheid van ongeveer 5 tot 1 meter per seconde. Blijf twee tot vijf minuten heen en weer slepen.

De trektijd moet worden aangepast aan de overvloed ter plaatse. Na de sleep, voorzichtig til het net en langzaam de inhoud van de kabeljauw einde over te brengen naar een 500-mil, glazen fles. Vul de fles aan de rand om luchtbellen te voorkomen die stress kunnen veroorzaken aan de dieren tijdens het transport.

In dit stadium kan de aanwezigheid van Oikopleura worden bevestigd door de monsterflessen tegen een donkere achtergrond te bekijken. Microscopische observatie is echter vereist voor identificatie op soortenniveau. Herhaal dit proces tot drie flessen van 500 mil zijn verzameld.

Verzamel oppervlaktezeewater om zoutgehalte, temperatuur en chlorofylconcentratie vast te leggen met een CTD-profiler. Verzamel bovendien 10 tot 15 liter zeewater ter plaatse om de dieren te helpen acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden. Om de dieren te acclimatiseren, bereidt u een één-op-één verhouding van oppervlaktezeewater van de monstersite voor en gefilterd zeewater dat in het lab wordt onderhouden.

Afhankelijk van de concentratie van het planktonmonster moet het uiteindelijke volume worden aangepast tot vijf tot 10 liter. Voeg het monster van 500 mil voorzichtig toe aan het bereide bekerglas. Met behulp van een peddel bevestigd aan een synchrone motor draaien op 15 RPM, houd het plankton in schorsing 's nachts.

De volgende ochtend, controleer op de aanwezigheid van Oikopleura door het oog. Breng de dieren naar een petrischaaltje en observeer onder een donkere veldmicroscoop die 20 tot 40 keer tussen de vergroting ligt voor een positieve identificatie. Oikopleura worden gekenmerkt als kikkervisvormige dieren die hun staarten golven in een doorschijnend huis.

Om O.dioica te bevestigen, zoek naar volledig volwassen mannetjes met gele geslachtskoeten of vrouwtjes met eieren. Als de dieren onvolwassen zijn, kijk dan voor de aanwezigheid van twee subchorale cellen op de distale helft van de staart. Deze zijn aanwezig in zowel volwassen als onvolwassen dieren.

Zodra de soort is bevestigd, breng ze naar een nieuwe petrischaal. Herhaal dit proces tot 10 tot 20 individuen zijn bevestigd op soortenniveau. Als er geen O.dioica worden gevonden, houd de beker roeren voor een extra dag of twee.

Kleine O.dioica die aanvankelijk niet waarneembaar waren, zullen blijven groeien en gemakkelijker te zien worden. Als er na een week geen verschijnt, verwijdert u het monster en probeert u opnieuw monsters te nemen. Om een monocultuur te vestigen, isoleer 120 O.dioica van een veldmonster in vijf liter gefilterd zeewater.

De volgende ochtend, kijk voor volledig volwassen mannetjes geïdentificeerd door gele geslachtsgenoten en voor vrouwtjes met eieren die verschijnen als glinsterende, gouden bollen. Bereid een paaibeker door voorzichtig 15 mannetjes en 30 vrouwtjes met een vijf-mil, stompe pipet naar een beker met 2,5 liter gefilterd zeewater. Om fysieke stress tijdens de handmatige overdracht te minimaliseren, laat u de dieren langzaam los onder het oppervlak van het nieuwe zeewater.

Laat geïsoleerde volwassenen op natuurlijke wijze paaien. Na het paaien kan succesvolle bevruchting worden bevestigd door vijf tot 10 mils zeewater uit de bodem van het paaibeker en het identificeren van eieren met decolletés onder een microscoop te extraheren. Op de eerste ochtend na het paaien, dag één, moet een nieuwe generatie jonge dieren met opgeblazen huizen in de beker verschijnen.

Gebruik een 500-mil, handheld beker om dieren voorzichtig over te brengen naar een nieuw bekerglas met 7,5 liter vers, gefilterd zeewater. Giet langzaam de inhoud aan de oppervlakte om turbulentie en afschuifkrachten te minimaliseren. Breng op de tweede ochtend na het paaien, dag twee, handmatig 150 dieren over naar een nieuw bekerglas met vijf liter vers, gefilterd zeewater.

Op de derde ochtend na het paaien, dag drie, breng je handmatig 120 dieren over naar een nieuw bekerglas met vijf liter vers, gefilterd zeewater. Tegen de vierde dag moeten seksueel volwassen, volwassen dieren aanwezig zijn. Verzamel 15 mannetjes en 30 vrouwtjes voor een nieuwe paaibeker met 2,5 liter gefilterd zeewater om de volgende generatie te starten.

Dit proces wordt herhaald en gehandhaafd voor het leven van de cultuur. Om een monocultuur van O.dioica in stand te houden, wordt algenvoedsel dagelijks bereid uit werkculturen. De dieren worden drie keer per dag gevoerd.

Bereid dagelijks voedsel door het meten van de absorptie van de werkcultuur met behulp van een spectrofotometer ingesteld op 660 nanometer. Absorptiewaarden, doel O.dioica cultuurvolumes en dierlijke volwassenheid worden in een voorbereide spreadsheet geplaatst op basis van een eerder bepaalde algengroeicurve om het exacte volume algen te berekenen dat nodig is voor het voeden van de dag. Pipette de berekende volumes in 50-mil buizen, en centrifuge op 5,000g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Langzaam giet af supernatant, en voorzichtig pipette op en neer om de pelleted algen resuspend. Vul de buizen aan hun oorspronkelijke volume met vers, gefilterd zeewater. Op basis van de dagelijkse algenvoeddiagram uit de spreadsheet, voer het opgegeven bedrag aan elk bekerglas om 9 uur per .m.

12 p.m. en 17 p.m. Een geautomatiseerde doseerpomp kan worden ingesteld om de dieren te voeden op 5 p.m.

in het weekend zonder de aanwezigheid van het personeel van de culturing. Na elke voeding, handhaven van de bereide algen voedsel op vier graden Celsius tot klaar om te worden gebruikt voor de volgende feed. O.dioica kan worden verzameld uit een haven door het zachte slepen van een gemodificeerd plankton net uitgerust met 100-micron mesh en een niet-filtering kabeljauw einde.

De bemonstering tussen 2015 en 19 toonde seizoensgebonden variatie in de aanwezigheid van O.dioica in de havens van Okinawa. Oppervlakte zeewater temperatuur leek de aanwezigheid van de dieren beïnvloeden. O.dioica domineerde toen de oppervlakte zeewater temperatuur was 28 graden of hoger.

O.dioica naast elkaar bestaan met Oikopleura longicauda bij temperaturen tussen de 24 en 27 graden. O.longicauda domineerde echter bij temperaturen onder de 23 graden. Veranderingen in het zoutgehalte correleerden niet met de overvloed aan O.dioica.

De drie belangrijkste factoren voor het opzetten van stabiele O.dioica cultuursystemen zijn het handhaven van een hoge waterkwaliteit met een multi-step filtratiesysteem, het identificeren van een optimaal voedingsregime, bij voorkeur door het creëren van algen standaard curven, en de voorbereiding van paaibekers met voldoende aantallen mannen en vrouwen. Volgens het meegeleverde protocol is de levenscyclus van O.dioica vier dagen bij 23 graden. We hebben op betrouwbare wijze zes onafhankelijke populaties van O.dioica, die allemaal meer dan 20 generaties duurden.

Tot slot kan het snel en kosteneffectief tot stand brengen van een stabiele cultuur van O.dioica. Met een goede opzet kan binnen een week een stabiele cultuur worden bereikt. In combinatie met zijn kleine genoom en snelle levenscyclus maakt dit O.dioica tot een krachtige chordate modelsoort.

O.dioica kan worden onderhouden in zowel kunstmatig als natuurlijk zeewater. Langdurige opslag van algenvoedsel is mogelijk met behulp van vaste cultuur en cryopreservatie. Bovendien kan O.dioica sperma ook cryopreserved worden en langer dan een jaar levensvatbaar blijven.

O.dioica blijft krachtige inzichten bieden in verschillende biologische gebieden. Een goed begrip van lokale seizoensgebondenheid, een nauwgezet cultuursysteem en een paar toegewijde individuen maken het mogelijk om effectieve cultuur met weinig inspanning tot stand te brengen.