2D-HELS MS Seq: Een algemene LC-MS-gebaseerde methode voor directe en de novo sequencing van RNA-mengsels met verschillende nucleotidemodificaties
10 juli 2020
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een LC-MS-gebaseerde sequencingmethode die kan worden gebruikt als een directe methode om kort RNA (<35 nt per run) te sequencen zonder een cDNA-tussenproduct, en als een algemene methode om verschillende nucleotidemodificaties te sequencen in een enkele studie met precisie op één base.
Dit protocol omvat alle essentiële stappen die nodig zijn bij het gebruik van de nieuwe methode die is ontwikkeld om RNA direct te sequencen, ongeacht of de RNA-monster enkelstrengs, gemengd of gemodificeerd is. De methode wordt niet beïnvloed door enzymatische fouten of basencomplementariteit. Het biedt een directe workflow en een algemene oplossing die het mogelijk maakt om verschillende RNA-modificaties gelijktijdig te sequencen in plaats van één specifieke modificatie per keer.
Deze technologie kan worden ontwikkeld tot een diagnostisch hulpmiddel om kenmerkende RNA-segmenten te bepalen om deze te relateren aan menselijke ziekten en een nauwkeurig hulpmiddel om RNA-modificaties op het epitranscriptomische niveau te bestuderen. De methode is niet afhankelijk van een eerdere sequencingmethode. In plaats daarvan is het een volledig nieuwe aanpak, en we streven ernaar om het de standaardmethode te maken voor het sequencen van elke gemodificeerde RNA.
Sommige delen van dit protocol bevatten kritieke aspecten die nauwkeuriger kunnen worden overgebracht door visuele demonstratie, zoals het labelen van het 3'-uiteinde van RNA LC-MS data-acquisitie en de data-analyse door de MassHunter-software. Ik zal deze procedure demonstreren en de LC-MS instellen en onze RNA-monsters meten. Om een eenstaps-labelingreactie uit te voeren, combineer je 2 microliters van 150 micromolair AppCp-biotine, 3 microliters van 10x ligaseractiebuffer, 1,5 microliters van 100 micromolair RNA-monster, 3 microliters van watervrij DMSO, 10 eenheden T4 RNA-ligase en 19,5 microliters DEPC-behandeld water voor een totaal volume van 30 microliters.
Incubeer de reactie een nacht bij 16 graden Celsius, voer vervolgens kolomzuivering uit volgens de manuscriptrichtlijnen. Na het verdelen van het RNA in drie aliquots en het toevoegen van een gelijk volume formisch zuur, incubeer de reacties bij 40 graden Celsius. Zodra elke reactie is voltooid, bevriest u het monster onmiddellijk op droog ijs om de zuurdegradatie te stoppen.
Gebruik een centrifugale vacuümconcentrator om het monster gedurende ongeveer 30 minuten te drogen. Resuspendeer de gedroogde monsters in 20 microliters DEPC-behandeld water en combineer ze. Bewaar de monsters bij 20 graden Celsius tot LC-MS-meting.
Breng het RNA-monster over naar de LC-MS-monstervial na het bereiden van de mobiele fasen. Elke injectie moet 100 tot 400 picomol RNA en 20 microliters bevatten. Na het verkrijgen van de gegevens, gebruikt u de moleculaire functie-extractieworkflow om informatie over verbindingen te extraheren, inclusief massa, retentietijd, volume en kwaliteitsscore.
Gebruik het centroidgegevensformaat in kleine molecuulinstellingen. Stel de piekhoogte in op minimaal 100, maar minder dan 1.000, en de kwaliteitsscore op minimaal 50. Exporteer ten slotte de gegevens als een Excel-bestand.
De scheiding van de 3'ladder van de 5'ladder en andere ongewenste fragmenten wordt hier getoond op een 2D massaretentietijdplot. Het is ook mogelijk om gemengde monsters te sequencen die twee RNA-strengen van verschillende lengtes bevatten met een 5'biotinelabel bij elk RNA. Om uridine te onderscheiden van een pseudouridine, werd het RNA behandeld met CMC, dat een pseudouridine omzet in een CMC-pseudouridine-additief.
Het additief heeft een andere massa in een uridine en kan worden onderscheiden in de 2D-HELS MS Seq. Het HPLC-profiel van het ruwe product van de reactie die pseudouridine omzet in zijn CMC-additief werd gebruikt om de percentageconversie te berekenen, die 42% was. Een mengsel van vijf verschillende RNA-strengen werd gesequenced met de 2D-HELS MS Seq-aanpak met 3'eindlabeling en genormaliseerd voor betere visualisatie van meerdere RNA-sequenties. Zonder de normalisatie zouden de lettercodes voor de sequenties van de vijf RNA's elkaar overlappen.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure, stelt u de labelreactie zorgvuldig in om een hoge opbrengst van gelabelde RNA-monsters te verkrijgen. Controleer ook zorgvuldig de degradatietijd om betrouwbare massaladders te creëren en verzamel de maximale hoeveelheid gedroogde monsters met 20 microliters water. Een vraag die kan worden gesteld na het uitvoeren van dit protocol is hoe de breedtelengte en doorvoer van de sequencingmethode kunnen worden verhoogd.
Een betere algoritme en een meer geavanceerd instrument met hogere resolutie en gevoeligheid kunnen helpen. Na de ontwikkeling van dit protocol werd het mogelijk om direct een breder bereik van RNA-monsters te sequencen die zowel canonieke als gemodificeerde nucleotiden bevatten zonder enige fout gerelateerd aan CDA-gebaseerde RNA-sequencing.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe LC-MS-gebaseerde sequentiemethode voor kort RNA die de noodzaak van een cDNA-tussenproduct elimineert. Het protocol maakt gelijktijdige sequenering van diverse RNA-modificaties mogelijk met precisie op enkelvoudig basisniveau.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- RNA-sequencing
- Epitranscriptomics
- Biotechnologie
Achtergrond
- Huidige RNA-sequencingmethoden vertrouwen vaak op cDNA-tussenproducten.
- Enzymatische fouten kunnen de nauwkeurigheid van de sequencing beïnvloeden.
- Gelijktijdige sequencing van RNA-modificaties is uitdagend.
- Het begrijpen van RNA-modificaties is cruciaal voor het bestuderen van menselijke ziekten.
Doel van de studie
- Om een methode voor directe sequencing van RNA te introduceren.
- Om de studie van meerdere RNA-modificaties in één analyse mogelijk te maken.
- Om een betrouwbaar instrument voor epitranscriptomisch onderzoek te bieden.
Gebruikte Methoden
- Op LC-MS gebaseerde sequencingtechniek.
- Directe sequencing van enkelstrengs, gemengd of gemodificeerd RNA.
- Eliminatie van de cDNA-synthestap.
- Workflow ontworpen voor hoge precisie en nauwkeurigheid.
Belangrijkste resultaten
- De methode sequenceert succesvol kort RNA (<35 nt) zonder cDNA.
- Gelijktijdige detectie van diverse RNA-modificaties is bereikt.
- De techniek bleek resistent tegen enzymatische fouten.
- Potentiële toepassingen in de diagnostiek van menselijke ziekten zijn geïdentificeerd.
Conclusies
- Deze nieuwe sequentiemethode zou een standaard kunnen worden voor de analyse van gemodificeerd RNA.
- Het biedt een uitgebreide benadering voor het bestuderen van RNA-modificaties.
- Het protocol heeft implicaties voor toekomstig onderzoek in de RNA-biologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie
Deze op LC-MS gebaseerde RNA-sequenceringsmethode maakt directe, de novo sequenering van gemodificeerde RNA-mengsels mogelijk zonder cDNA-synthese, waarmee een belangrijke bottleneck in de validatie van epitranscriptomische targets wordt weggenomen. Door kwantitatieve, op modificaties gerichte sequeneringsgegevens te verschaffen, ondersteunt het de vroege ontdekking van RNA-gebaseerde biomarkers en het mechanistisch minimaliseren van risico's bij therapeutische oligonucleotiden. De benadering vergroot het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door sequentie-bevestigde, modificatie-specifieke resultaten te leveren die direct toepasbaar zijn in workflows voor screening en assay-ontwikkeling.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door RNA-modificaties zoals pseudouridine en 5-methylcytosine direct te sequensen in hun natuurlijke context.
- Operationele waarde: Biedt een algemene oplossing voor de gelijktijdige detectie van canonieke en gemodificeerde nucleotiden, waardoor de noodzaak voor opeenvolgende modificatie-specifieke assays wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets via directe correlatie tussen massa en retentietijd van gemodificeerde nucleobasen, wat nauwkeurige site-specifieke modificatie-mapping faciliteert.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve output voor massa en retentietijd, waardoor betrouwbare discriminatie van RNA-sequenties in mengsels van maximaal 12 verschillende oligonucleotiden mogelijk is.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, normalisatie-klare gegevens die compatibel zijn met standaard high-resolution LC-MS-systemen, wat bijdraagt aan de standaardisatie van assays voor korte RNA-panels.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de preparatie van gevalideerde biologische systemen voor downstream screening door het opleveren van sequentieverifieerde RNA-standaarden met gedefinieerde modificatiepatronen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Ondersteunt de sequentieverificatie van gemodificeerde therapeutische RNA-oligonucleotiden, waarbij modificaties uit de ontdekkingsfase worden gekoppeld aan de evaluatie van preklinische kandidaten.
- Mechanistische Risicoreductie: Maakt detectie van modificatie-geïnduceerde massaverschuivingen mogelijk (bijv. CMC-pseudouridine-adducten) om echt signaal te onderscheiden van degradatie-artefacten in complexe monsters.
- Risico-geoptimaliseerde Voortgang: Biedt sequentiebevestiging zonder enzymatische bias, waardoor het aantal fout-negatieven bij modificatiescreening wordt verminderd en de betrouwbaarheid van go/no-go-beslissingen wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows als een front-end sequencing-tool voor hypothese-gestuurde RNA-analyse, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-moleculen door de sequentie en modificatiestatus van synthetische of endogene RNA-doelen te bevestigen voorafgaand aan functionele screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door direct bewijs te leveren van het gelijktijdig voorkomen van RNA-sequenties en modificaties in natuurlijke of synthetische mengsels.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door het genereren van massaretentietijd-ladders die dienen als kwantitatieve referenties voor door verbindingen geïnduceerde RNA-modificaties of degradatieprofielen.
- Analytics: Produceert centroid-gebaseerde moleculaire kenmerkgegevens (massa, retentietijd, volume, kwaliteitsscore) die naar Excel kunnen worden geëxporteerd, wat vergelijking tussen condities en statistische evaluatie van de stabiliteit van modificaties mogelijk maakt.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door sequentieverifieerde gemodificeerde RNA-standaarden te leveren die geschikt zijn voor biomarker-afstemming en functionele validatie in ziekterelevante systemen.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare LC-MS-gebaseerde capaciteit voor snelle sequencing van korte RNA-varianten (<35 nt), waardoor de afhankelijkheid van uitbesteerde sequencing wordt verminderd en interne screeningscycli voor modificaties worden versneld.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door cDNA-gemedieerde fouten te elimineren en directe observatie van modificatie-specifieke massesignaturen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde labeling, zuur-quenching en normalisatiestappen die de inter-run variabiliteit in complexe RNA-mengsels minimaliseren.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door interne sequencing van gemodificeerd RNA mogelijk te maken, waardoor de afhankelijkheid van externe leveranciers afneemt en iteratiecycli bij leadoptimalisatie worden versneld.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door eenduidige sequentie- en modificatiedata te leveren, wat de uitval in een laat stadium door ongedetecteerde RNA-heterogeniteit of onjuiste annotatie vermindert.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in RNA-behandeling, LC-MS-bediening en moleculaire kenmerkextractie via MassHunter voor een nauwkeurige interpretatie van de gegevens.
- Is afhankelijk van toegang tot hoge-resolutie LC-MS-systemen die in staat zijn tot centroid-gegevensverwerving met gedefinieerde drempelwaarden voor piekhoogte (100–1000) en kwaliteitsscore (≥50).
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft labelingsrendement, degradatietiming en normalisatieprotocollen om een consistente generatie van massaladders over verschillende gebruikers en platforms te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding buiten kort RNA (<35 nt) of naar complexe biologische monsters, afhankelijk van toekomstige verbeteringen aan algoritmen en instrumenten.
- Omvat praktische beperkingen, waaronder huidige beperkingen in de doorvoer en de afhankelijkheid van handmatige optimalisatie van labelingsreacties (bijv. AppCp-biotine, T4-ligase, DMSO) om de opbrengst en ladderresolutie te maximaliseren.
