Name: Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: Leer het kweken van embryonale ratten-sympathische neuronen uit de ganglion cervicale superius voor morfologische en proteomische analyse. Deze methode omvat dissectie, enzymatische digestie en immunocytochemische kleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Faculty Development Fund en Summer Research Program subsidie aan Saint Mary's College of California. De auteurs willen ook dr. Pamela Lein aan de Universiteit van Californië in Davis en Dr. Anthony Iavarone aan de UC Berkeley Mass spectrometrie faciliteit bedanken voor hun advies tijdens de ontwikkeling van deze protocollen. De auteurs willen haley Nelson ook bedanken in het Office of College Communications aan het Saint Mary's College of California voor haar hulp bij videoproductie en -bewerking.

Alle procedures uitgevoerd in studies met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) op Saint Mary's College of California. De richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van het Saint Mary's College zijn ontwikkeld op basis van de richtlijnen van het Office of Laboratory Animal Welfare van het National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf en https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Voorbereiding van cultuurmedia (ook wel bestrijdingsmedium genoemd)
<ol><li>Voeg in onderstaande volgorde de volgende ingrediënten toe aan een steriele kolf van 500 mL: 190 mL 1x low-glucose DMEM, 10 mL van 20 mg/mL vetzuurvrij runderserum albumine (FAF-BSA) in DMEM, 2,8 mL van 200 mM L-glutamine, 4 mL van 100x insuline-selenium-transferrine mengsel, 0,4 mL van 125 μg/mL zenuwgroeifactor (in 0,2% inert eiwitstabilisator in DMEM), en 200 mL van Ham's F-12 medium.</li>
	<li>Zorg ervoor dat u de pipet bedekt met het medium dat FAF-BSA bevat voordat eiwithoudende oplossingen zoals insuline-selenium-transferrine en NGF worden gebruikt om het plakken van eiwitten aan de pipet te voorkomen.</li>
	<li>Draai de kolf om de ingrediënten te mengen na elke toevoeging. Meng grondig met een 25 mL pipet na toevoeging van F-12.</li>
	<li>Aliquot de cultuurmedia in 10 mL aliquots en opslag bij -80 °C. De aliquots kunnen gedurende zes maanden worden bewaard zonder verlies van activiteit.</li>
</ol>2. Bereiding van platen voor het kweken van neuronen
<ol><li>Verdun een 1 mg/mL-voorraad poly-D-lysine (gemaakt in 0,5 M Tris-buffer, pH 8) tot 100 μg/mL met steriel gedestilleerd water.</li>
	<li>Voor proteomische of genomische analyse, een tot twee dagen voor de dissectie, jas 6-well platen met ongeveer 2 mL steriele 100 g/mL van poly-D-lysine (PDL). Dit is nodig om te zorgen voor celhechting aan de put. Wikkel de platen met plakfolie en bewaar de platen 's nachts op 4 °C.</li>
	<li>Voor morfologische analyse en microscopie plaatst u 12 mm2 voorbehandelde Duitse glazen covers (die met behulp van salpeterzuurbehandeling zoals eerder beschreven18 of gekocht) in elk van de putten van een 24-putplaat kunnen worden gereinigd.<ol>
<li>Bekleed de coverslips met 0,3 mL steriele 100 g/mL poly-D-lysine (PDL). Bewaar de platen 's nachts op 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op de dag van de dissectie, vóór het begin van de dissectie, verwijder de poly-D-lysineoplossing uit de putten en spoel de putten vijf keer af met steriel gedestilleerd water, gevolgd door één keer met een lage glucose DMEM.</li>
	<li>Tijdens de enzymatische vertering van de ganglia (ongeveer een uur voor het platbeteren van de cellen), de DMEM uit de platen aanzuigen en vervangen door 0,3 mL controlemedia. Bewaar de platen op 35,5 °C onder 5% CO2 in een bevochtigde kamer.</li>
</ol>3. Ontledingsopstelling
<ol><li>Voorbereiding van 200 mL media voor dissectie (aangeduid als Dissectie media)<ol>
<li>Voeg 8 mL van 20 mg/mL vetzuurvrij runderserum albumine (FAF-BSA) toe aan low glucose DMEM (met 1 mg/mL glucose) en 2 mL van 100x penicilline-streptomycine tot 193 mL steriele Leibovitz's L-15 medium (of een luchtbufferd medium)</li>
	</ol>
</li>
	<li>In de motorkap, het opzetten van de volgende items voor dissectie: vier 50 mL steriele kegelvormige buizen met ongeveer 20 mL van dissectie media in elke buis, vier steriele 35 mm gerechten met 1,5 mL dissectie media, een steriele 50 mL kegelvormige buis met 20 mL dissectie media voor centrifugatie, een steriele 15 mL conische buis voor centrifing de ganglia , en een steriele buis van 10 mL voor het verzamelen van de gescheiden cellen.</li>
	<li>Gebruik een droge kraal sterilisator om een paar fijne tangen (nr.4 of nr. 5 tang) gedurende ten minste één minuut te steriliseren.</li>
</ol>4. Isolatie van de superieure cervicale ganglia van embryonale rattenpups
<ol><li>Verwijdering van E21 embryo's van de drachtige rat OPMERKING: Verwijdering van de baarmoederhoorn kan buiten de kap worden uitgevoerd als de omgeving grondig wordt gesteriliseerd.<ol>
<li>Euthanaseer de zwangere2 rat met CO 2-inademing. Schuif de vacht uit de buikstreek en veeg de huid in het gebied af met 70% alcohol om het te steriliseren.</li>
		<li>Met behulp van een verse set steriele scharen en tangen, snijd door de huid en vervolgens de spierlaag om de baarmoeder hoorns met de embryo's bloot te stellen. Verwijder de baarmoederhoorns met de embryo's met behulp van een nieuwe set schaar en tangen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de darmen daarbij niet worden beschadigd.</li>
		<li>Breng de baarmoederhoorns met de embryo's in een 150 mm2 steriele petrischaal en breng ze in de kap.</li>
		<li>Verwijder met behulp van een nieuwe set tangen en scharen de embryo's uit de baarmoederhoorn en scheid de embryo's van de vruchtwatermembranen en de placenta.</li>
		<li>Om de embryo's te euthanaseren, snijd het ruggenmerg van de embryo's langs de middellijn onder de rechterarm. Dit zal ook het bloeden van de halsslagader tijdens het verwijderen van de SCG verminderen.</li>
		<li>Breng deze embryo's over in de bereide conische buizen van 50 mL met dissectiemedia. Zorg ervoor dat de embryo's in de media worden ondergedompeld. Elke buis kan maximaal 3 embryo's bevatten.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolatie van het superieure cervicale ganglion van het embryo<ol>
<li>Breng één pup van de dissectiemedia over op een steriele 150 mm2 Petri schotel half gevuld met massief substraat (paraffinewas of siliconenpolymeer), met zijn dorsale oppervlak op het substraat. Met behulp van drie steriele 23 G naalden, pin de pup aan de schotel met een naald onder elke arm en een derde naald door de mond om zorgvuldig hyperextend de nek.</li>
		<li>Snijd door de huid in het nekgebied met behulp van steriele fijne tangen (nr. 4 of nr. 5 tangen) om de speekselklieren eronder bloot te leggen. Verwijder deze klieren met behulp van fijne tangen.</li>
		<li>Zoek de sternocleidomastoïde en omohyoïde spieren in de buurt van het sleutelbeen en luchtpijp, respectievelijk. Snijd eerst de dwarse sternocleidomastoïde spieren en snijd vervolgens zorgvuldig de dunne omohyoïde spier met fijne tangen. Zodra deze spieren zijn verwijderd, zal de splitsing in de halsslagader aan het voorste uiteinde zichtbaar zijn aan weerszijden van de luchtpijp, met de SCG onder deze vork in de halsslagader.</li>
		<li>Til met gesloten tangen voorzichtig de halsslagader op om de SCG te visualiseren. Met behulp van een tang aan weerszijden van de SCG, trek de halsslagader en breng het naar de bereide steriele 35 mm2 gerechten. Dit weefsel zal waarschijnlijk bevatten de SCG met de halsslagader, de nervus vagus met de nodose ganglia evenals andere segmenten van spier of vet in het gebied.</li>
		<li>Herhaal het dissectieproces aan de andere kant. Verwijder SGT's uit alle embryo's voordat u verdergaat met de resterende dissectiestappen die hieronder worden beschreven. Verdeel de geïsoleerde weefsels over twee van de 35 mm2 gerechten om de verwerking van de weefselmonsters te vergemakkelijken.</li>
	</ol></li>
	<li>Nabewerking van SCG<ol>
<li>Om de SCG te scheiden van het ontleed weefsel, eerst gebruik maken van fijne tangen om eventuele vreemde weefsels te verwijderen, zoals vet of spieren, het verzorgen van het gebied in de buurt van de halsslagader te voorkomen.</li>
		<li>Zodra deze weefsels zijn verwijderd, zijn twee ganglia zichtbaar. De nodose ganglion is kleiner en cirkelvormig, terwijl de SCG amandelvormig is. Trek voorzichtig aan de nervus vagus om de nervus vagus en nodose ganglia van de halsslagader te scheiden en vervolgens de SCG te scheiden van de halsslagader.</li>
		<li>Gebruik fijne tangen om de capsule die de SCG omringt te verwijderen. Breng de SCG over op een nieuw 35 mm cultuurgerecht. Herhaal het proces met alle ontleed weefselmonsters.</li>
		<li>Bedek een gesteriliseerde, katoenen aangesloten glazen pipet met ontledingsmedia om te voorkomen dat het weefsel zich aan de pipetwanden vastkleven. Gebruik de pipet om de dissectiemedia te vervangen door steriele 2 mL collagenase type II (1 mg/mL)/dispase type II (5 mg/mL) in calcium- en magnesiumvrije HBSS, en incubeer gedurende 50 min bij 37 °C om de weefsels te helpen afbreken. OPMERKING: De incubatietijd kan nodig zijn om te worden geoptimaliseerd met verschillende partijen Collagenase / Dispase en varieert meestal van 40 min tot een uur.</li>
		<li>Tijdens de incubatie, aspirate de DMEM van de platen en vervang het door 0,3 mL van de controle media. Bewaar de platen op 35,5 °C onder 5% CO2 in een bevochtigde kamer.</li>
		<li>Breng na de incubatie de SGT's in collagenase/dispase over naar een steriele conische buis van 15 mL. Gebruik de dissectiemedia om de platen te spoelen en de oplossing over te brengen naar de buis. Voeg voldoende dissectiemedia toe om het volume tot ongeveer 10 mL te brengen.</li>
		<li>Centrifuge bij 200 x g (1000 - 1200 rpm) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het monster te pelleteren. Aspirate de supernatant, het verzorgen van niet verjagen van de pellet. Resuspend de pellet met 10 mL van dissectie media. Herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Vervangen door 1 - 2 mL cultuurmedium. Met behulp van een smal-bore, gebogen-tip steriele pasteur pipet (voorgecoat met cultuurmedium), mechanisch scheiden van de klonten door zachtjes triturating 5-6 keer. Laat de grotere klonten genoegen nemen met ongeveer een minuut. Breng de supernatant celsuspensie over naar een nieuwe 10 mL buis.</li>
		<li>Herhaal dit proces nog 3 keer, met toenemende kracht van trituratie elke keer om te zorgen voor bijna volledige dissociatie van de SCGs. Breng de supernatant na elke ronde van trituratie naar een 10 mL buis met de supernatant van de eerste trituratie.</li>
		<li>Voeg voldoende cultuurmedia toe om het volume op te brengen tot 8 - 10 mL. Meng voorzichtig de celsuspensie en kwantificeer de celdichtheid met een hemocytometer.</li>
		<li>Verdeel de celsuspensie in de putten bij de aangewezen celdichtheid voor de experimenten. Meng de celsuspensie voortdurend tijdens het beplatingsproces om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen. OPMERKING: Voor morfologische analyse, plaat de cellen rond 8.000 cellen / goed in een 24 put platen en voor genomische en proteomische protocollen, plaat de cellen zo hoog als 30.000 cellen / goed.</li>
		<li>Breng de platen over op een glazen desiccator met steriel water aan de onderkant om een bevochtigde kamer te creëren. Injecteer voldoende CO2 (ongeveer 120 mL) om een 5% CO2-omgeving in de desiccator te verkrijgen, voorafgaand aan het afdichten. Houd de platen op 35,5 °C. Dit wordt in het protocol dag 0 genoemd. LET OP: Deze platen kunnen ook worden onderhouden in een reguliere 5% CO2 incubator. De hierboven beschreven methode minimaliseert temperatuur- en pH-veranderingen en helpt ook kruisbesmetting te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Onderhoud van de gekweekte SCG neuronen en behandelingen
<ol><li>Verwijder op dag 1 (24 uur na het beplating) voorzichtig de helft van de kweekmedia en vervang deze door 2 μM Ara-C (cytosine β-D-arabinofuranoside, een anti-mitotisch middel). Laat de behandeling 48 uur op de cellen staan. Meestal is deze duur van de behandeling voldoende om niet-neuronale cellen in de cultuur te elimineren.</li>
	<li>Op dag 3, zachtjes aspirate de helft van het medium en vervangen door controlemedium.</li>
	<li>Op dag 4 zijn de cellen klaar voor experimentele behandelingen. Voer culturen om de andere dag met het juiste medium, voorzichtig ter vervanging van de helft van het medium in de put met vers medium.</li>
	<li>Gekweekte SCG-neuronen in serumvrij medium breiden alleen axonen uit. Als experimenten de aanwezigheid van dendrieten vereisen, behandel cellen dan met 10% foetaal kalfsserum, 75-100 μg/mL keldermembraanmatenextract of 50 ng/mL botmorfogenetisch eiwit-7. Dendritische groei wordt waargenomen binnen 48 uur na de behandeling met uitgebreide dendritische prieel waargenomen binnen een week na de behandeling.</li>
</ol>6. Immunostaining gekweekte SCG neuronen
<ol><li>Vervang geleidelijk het celkweekmedium in de put door 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7.2 in een rookkap.<ol>
<li>Verwijder de helft van de cultuurmedia in de put en vervang deze voorzichtig door 4% paraformaldehyde. Herhaal het proces vervolgens nog minstens twee keer, verwijder telkens twee derde van de media in de put en vervangt het met 4% paraformaldehyde. Aan het einde van dit proces, de kleur van de media in de put moet zijn veranderd van roze naar kleurloos.</li>
		<li>Zodra al het medium is vervangen door 4% paraformaldehyde, incubeer de putten voor 15 - 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met een vergelijkbaar proces zoals hierboven beschreven, geleidelijk vervangen van de 4% paraformaldehyde oplossing met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.2. Laat 5 minuten staan. Spoel de putten nog twee keer gedurende 5 minuten met PBS.<ol>
<li>Zodra de 4% paraformaldehyde is verwijderd, verplaats de platen naar het bankje voor verdere verwerking. Deze stap is een goed stoppunt waar platen 's nachts bij 4 °C kunnen worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder alle PBS. Voeg voldoende volume van 0,1% Triton X-100 in PBS toe om de cellen te bedekken. Laat het op de culturen voor 5 minuten om de neuronen permeabiliseren. De timing van deze stap is van cruciaal belang om een goede kleuring te garanderen met behoud van de integriteit van de cellen.</li>
	<li>Verwijder de Triton X-100-oplossing voorzichtig en spoel de putten telkens 5 minuten af met PBS. Verwijder de PBS-oplossing.</li>
	<li>Voeg voldoende 5% BSA in PBS toe om de cellen te bedekken en 20 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden om niet-specifieke antilichaambinding te verminderen.</li>
	<li>Verwijder de blokkerende oplossing en vervang deze door een monoklonal antilichaam van de muis tegen MAP-2-eiwit verdund in 5% BSA in PBS. Laat het primaire antilichaam 's nachts op de cellen bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder en bewaar het primaire antilichaam voor hergebruik. Het primaire antilichaam kan ten minste tweemaal worden hergebruikt zonder verlies van detectieintensiteit.</li>
	<li>Spoel drie keer met voldoende PBS om de cellen te bedekken. Laat PBS 10 minuten per spoeling op de cellen staan.</li>
	<li>Verwijder de PBS-oplossing en vervang deze door fluorescerende tag-conjugated Goat anti-Mouse IgG secundaire antilichaam bij 1:1000 verdunning in 5% BSA in PBS. Incubeer gedurende 2 uur in het donker bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder het secundaire antilichaam en vervang het door PBS. Spoel de putten drie keer af met PBS gedurende 10 minuten per spoeling. Spoel de putten een keer met water om zouten te verwijderen.</li>
	<li>Monteer de coverslips op glazen platen met een druppel waterige mountant die geschikt is voor fluorescerende monsters. Bewaar de dia's op 4 °C, in een diamap tot ze klaar zijn voor beeldvorming.</li>
</ol>7. Monstervoorbereiding voor analyse van het proteoom met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met massaspectrometrie
<ol><li>Lysis van gekweekte neuronen<ol>
<li>Verwijder voorzichtig alle cultuurmedia in de putten. Vervang het door koud, steriel calcium en magnesiumvrije fosfaatvrije zoutoplossing (PBS), pH 7.4. Verwijder snel en vervang met PBS en laat het zitten voor 5 min. Deze stap wordt gedaan om alle eiwitten aanwezig in de cultuur media te verwijderen.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig alle PBS uit alle putten voor een bepaalde behandeling. Herhaal het proces nog een keer. Onderhoud platen boven ijs bij het lysing van de cellen om neuronale schade en proteolyse te minimaliseren.</li>
		<li>Voeg 100 - 150 μL van 50 mM ammoniumbicarbonaat, pH 7.5 (NH4HCO3) toe aan een van de putten en schraapcellen met behulp van een steriele celschraper. Breng met behulp van een micropipet de vloeistof over en herhaal het schraapproces met alle putten voor een bepaalde behandeling. Bestudeer de putten onder de microscoop na het schrapen om ervoor te zorgen dat de meeste cellen zijn verwijderd.<ol>
<li>Met het lage aantal neuronen, gebruik een beperkt volume om de cellen lyse om te zorgen voor een hoog genoeg concentratie voor proteomische analyse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bevries de oplossing 's nachts bij -80 °C om te helpen met cellyse. De lysates kunnen in dit stadium worden opgeslagen tot klaar voor verdere verwerking.</li>
		<li>Eenmaal ontdooid spuit u de monsters door een spuit met een naald van 26 G of 28 G om de cellen mechanisch te lyse.</li>
		<li>Sonicate de monsters in een sonicating water bad twee keer gedurende 10 minuten. Voeg ijs toe aan het waterbad om oververhitting en denaturatie van eiwitten te voorkomen. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 12.000 x g.</li>
		<li>Meet de eiwitconcentratie. Typische eiwitconcentraties variëren van 0,4 - 1 μg/μL</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monstervoorbereiding en trypsinevertering voor proteomeanalyse<ol>
<li>Breng maximaal 60 μL van het lysaat of 50 μg eiwit over in een DNase-, RNase- en protease-vrije 1,5 mL buis. Als het volume van het lysaat minder dan 60 μL is, voeg dan voldoende ammoniumbicarbonaat van 50 mM toe om het volume te vormen.</li>
		<li>Voeg 25 μL van 0,2% zuur labile oppervlakteactieve en vortex toe. Incubeer de buis in een blokverwarming bij 80 °C gedurende 15 minuten. Centrifuge de buis op 12.000 x g voor 30 s.</li>
		<li>Voeg 2,5 μL van 100 mM dithiothreitol en vortex toe. Dit maakt het eiwit toegankelijker voor alkylation en spijsvertering. Broed de buis 30 minuten in een blokverwarming in een blokverwarming. Koel af tot kamertemperatuur en centrifuge.</li>
		<li>Voeg 2,5 μL van 300 mM iodoacetamide toe aan het monster en de vortex. Deze stap helpt om de cysteines te alkylaat en voorkomt dat ze de disulfide obligaties hervormen. Broed de buizen 30 minuten in het donker op kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg massaspectrometrie kwaliteit trypsine (0,5 μg/μL) aan de buis bij een trypsine: eiwit verhouding van 1:10. Verteren de monsters op 37 °C 's nachts.</li>
		<li>Voeg 10 μL trifluoroacetisch zuur (TFA) en vortex toe. Incubeer de monsters 90 minuten bij 37 °C. Deze stap is nodig om de zure labiele oppervlakteactieve stof hydrolyseren om interferentie tijdens massaspectrometrie te voorkomen.</li>
		<li>Centrifugeren de monsters op 12.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten en breng supernatant over naar een chromatografie gecertificeerd helder glas flacon met voorgesneden Teflon/Siliconen septumdoppen. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voorafgaand aan massaspectrometrieanalyse.</li>
		<li>Onderwerp de monsterfolken aan vloeibare chromatografie in combinatie met high definition massaspectrometrie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li>
<li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li>
<li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li>
<li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li>
<li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li>
<li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li>
<li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li>
<li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li>
<li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li>
<li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).</li>
<li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li>
<li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatera-Naranjo%2C+O+%22RNA+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">RNA (New York, N.Y.)</a>. 16 (8), 1516-1529 (2010).</li>
<li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+%CE%B2-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li>
<li>Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li>
<li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+version+11%3A+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways%2C+and+data+analysis+tool+enhancements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li>
<li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li>
<li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li>
<li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture%3A+Autonomic+and+Enteric+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%2C+EMBS%22%5BJournal%5D)">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+31st+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%3A+Engineering+the+Future+of+Biomedicine%2C+EMBC+2009%22%5BJournal%5D)">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li>
<li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+Primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).</li>
<li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clujul+Medical%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).</li>
<li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft de protocollen voor het kweken van sympathische neuronen van superieure cervicale ganglia van embryonale rattenpups. De voordelen van het gebruik van dit model systeem zijn dat het mogelijk is om een homogene populatie van neuronen die een vergelijkbare reactie op groeifactoren te verkrijgen, en aangezien de groeifactor eisen voor deze neuronen is goed gekarakteriseerd, is het mogelijk om deze neuronen groeien in vitro in gedefinieerde media, onder serum-vrije omstandigheden10</su...

Sympathische neuronen afgeleid van embryonale superieure cervicale ganglia (SCG) zijn op grote schaal gebruikt als een primaire neuronale cultuur systeem voor het bestuderen van vele aspecten van de neuronale ontwikkeling, waaronder groeifactor afhankelijkheid, neuron-target interacties, neurotransmitter signalering, axonale groei, dendriet ontwikkeling en plasticiteit, synaptogenese en signalering mechanismen die ten grondslag liggen aan nerve-target / neuron-glia interacties1,2,3,,4,5,6,7,8,9. Ondanks hun kleine omvang (ongeveer 10000 neuronen / ganglia), zijn er drie belangrijke redenen voor de ontwikkeling en uitgebreid gebruik van dit cultuursysteem zijn i) zijn de eerste ganglia in de sympathieke keten, ze zijn groter, en dus gemakkelijker te isoleren, dan de rest van de sympathieke ganglia10; ii) in tegenstelling tot centrale neuronen, de neuronen in de SCG zijn vrij homogeen met alle neuronen worden afgeleid van de neurale kam, met een vergelijkbare grootte, afhankelijkheid van zenuwgroei factor en wordt noch-adrenerge. Dit maakt ze een waardevol model voor morfologische en genomische studies10,11 en iii) deze neuronen kunnen worden gehandhaafd in een gedefinieerd serum-vrij medium met zenuwgroeifactor voor meer dan een maand10,12. Perinatale SCG neuronen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de initiatie en het onderhoud van dendrieten2. Dit komt vooral omdat, hoewel SCG neuronen hebben een uitgebreide dendritische prieel in vivo, ze niet uit te breiden denndrites in vitro in de afwezigheid van serum, maar kan worden geïnduceerd om denndrites groeien in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren zoals bot morfogenetische eiwitten2,12,13.
Dit artikel beschrijft het protocol voor het isoleren en kweken van embryonale rat SCG neuronen. In de afgelopen 50 jaar zijn primaire neuronale culturen van de SCG voornamelijk gebruikt voor morfologische studies met een beperkt aantal studies die de grootschalige genomische of proteomische veranderingen onderzoeken. Dit is voornamelijk te wijten aan kleine weefselgrootte resulterend in de isolatie van lage hoeveelheden DNA of eiwit, waardoor het moeilijk is om genomische en proteomische analyses uit te voeren op deze neuronen. In de afgelopen jaren heeft de toegenomen detectiegevoeligheid echter de ontwikkeling van methoden mogelijk gemaakt om het genoom, miRNome en proteoom in de SCG-neuronen te onderzoeken tijdens de dendritische groeiontwikkeling14,15,16,17. Dit document zal ook de methode beschrijven voor morfologische analyse van deze neuronen met behulp van immunocytochemie en een protocol om neuronale eiwitextracten te verkrijgen voor massaspectrometrische analyse.

<table><tbody><tr><td>2D nanoACQUITY</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>354-BP</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Alumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning</td><td>CLS-3010</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200, 140675, 142475</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine- &beta;- D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Fatty Acid Free BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126609</td><td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td></tr><tr><td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td><td>Ted Pella Inc</td><td>5621, 5622</td><td></td></tr><tr><td>Forceps and Scissors for Dissection</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1328, 1329, 5002</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverlips - 12mm</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media for glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931, P36934</td><td></td></tr><tr><td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td><td>BioLegend</td><td>SMI 52</td><td></td></tr><tr><td>Nerve growth factor</td><td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td><td>BT5017</td><td>Stock 125 &mu;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td></tr><tr><td>Paraformaldehye</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Prionex</td><td>Millipore</td><td>529600</td><td>10% solution, 100 mL</td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters Corporation</td><td>186001861</td><td>5 X 1 mg</td></tr><tr><td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>10 X 1 mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega or NEB</td><td>V511A, P8101S</td><td>100 &mu;g or 5 X 20 mg</td></tr><tr><td>Waters Total recovery vials</td><td>Waters Corporation</td><td>186000385c</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing rat sympathische neuronen van embryonale superior cervicale ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathische neuronen van de embryonale rat superieure cervicale ganglia (SCG) zijn gebruikt als een in vitro model systeem voor perifere neuronen om axonale groei, axonale handel, synaptogenese, dendritische groei, dendritische plasticiteit en zenuw-doel interacties in co-cultuur systemen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van neuronen van de superieure cervicale ganglia van E21 rat embryo's, gevolgd door de voorbereiding en het onderhoud van zuivere neuronale culturen in serum-vrij medium. Aangezien neuronen zich niet houden aan ongecoat plastic, neuronen zullen worden gekweekt op 12 mm glazen coverslips of 6-well platen bekleed met poly-D-lysine. Na behandeling met een antimitotisch middel (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), genereert dit protocol gezonde neuronale culturen met minder dan 5% niet-neuronale cellen, die meer dan een maand in vitro kunnen worden gehandhaafd. Hoewel embryonale rat SCG neuronen multipolair zijn met 5-8 dendrieten in vivo; onder serumvrije omstandigheden breiden deze neuronen slechts één axon in de cultuur uit en blijven unipolair voor de duur van de cultuur. Echter, deze neuronen kunnen worden geïnduceerd om dendrieten uit te breiden in de aanwezigheid van kelder membraan extract, bot morfogenetische eiwitten (BMPs), of 10% foetale kalf serum. Deze homogene neuronale culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische kleuring en voor biochemische studies. Dit artikel beschrijft ook geoptimaliseerd protocol voor immunocytochemische kleuring voor microtubuli geassocieerde eiwit-2 (MAP-2) in deze neuronen en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrie.

Het isoleren en onderhouden van neuronale culturen van embryonale SCG-neuronen Gescheiden cellen van de rat embryonale SCG werden verguld in een poly-D-lysine gecoate plaat of coverslip en onderhouden in serum vrije kweekmedia met b-zenuw groeifactor. De gescheiden cellen met een mengsel van neuronen en gliacellen zien er cirkelvormig uit op beplating(figuur 1A). Binnen 24 uur na beplating breiden de neuronen kleine axonale processen uit met gliacellen die afvlakken en fa...

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

In deze video zullen we de culturing van de superieure cervicale ganglia van embryonale ratten demonstreren voor morfologische en proteomische analyse. Bereid de controle- en ontledingsmedia voor voordat u met de dissectie begint. Controlemedium bevat F-12 en lage glucose DMEM aangevuld met een insuline-selenium-transferrine mengsel, glutamine, zenuwgroeifactor, en BSA.Dissectiemedium bevat L-15 aangevuld met pen-strep en BSA. Raadpleeg het manuscript voor gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van de media. Voorbereiding van platen voor het kweken van neuronen.Verdun een milligram per milliliter voorraad poly-D-lysine tot 100 microgram per milliliter met steriel gedestilleerd water. Voor proteomische of genomische analyse, een tot twee dagen voor de dissectie, jas zes-put platen met ongeveer twee milliliter steriele 100 gram per milliliter van poly-D-lysine. Dit is nodig om te zorgen voor celhechting aan de put.Wikkel de platen met plakfolie en bewaar de platen 's nachts op vier graden Celsius. Op de dag van de dissectie, vóór het begin van de dissectie, verwijder de poly-D-lysineoplossing uit de putten en spoel de putten vijf keer af met steriel gedestilleerd water, gevolgd door één keer met een lage glucose DMEM. Tijdens de enzymatische vertering van de ganglia, ongeveer een uur voor het platbeteren van de cellen, de DMEM van de platen aanzuigen en vervangen door 0,3 milliliter controlemedium.Bewaar de platen op 35 graden Celsius onder 5%CO2 in een bevochtigde kamer. In de kap, het opzetten van de volgende items voor dissectie. Vier 50 milliliter steriele conische buizen met ongeveer 20 milliliter dissectiemedia in elke buis.Vier steriele 35 millimeter schotels met 1,5 milliliter dissectiemedia. Een steriele 50 milliliter conische buis met 20 milliliter dissectie media voor centrifugatie. Een 15 milliliter steriele conische buis voor het centrifugeren van de ganglia, een steriele 10 milliliter buis voor het verzamelen van de gescheiden cellen.Gebruik een droge kralen sterilisator om een paar fijne tangen steriliseren voor ten minste een minuut. Alle procedures uitgevoerd in studies met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee op Saint Mary's College of California. De richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van het Saint Mary's College of California zijn ontwikkeld op basis van richtlijnen van het Office of Laboratory Animal Welfare van de National Institutes for Health.Verwijdering van E21 embryo's van de zwangere rat. Merk op dat het verwijderen van de baarmoeder hoorn kan worden uitgevoerd buiten de kap als de omgeving grondig wordt gesteriliseerd. Euthanaseer een zwangere rat met CO2-inademing.Schuif de vacht uit de buikstreek en veeg de huid in het gebied af met 70% alcohol om het te steriliseren. Met behulp van een verse set steriele scharen en tangen, snijd door de huid en vervolgens de spier om de baarmoeder hoorns met de embryo's bloot te stellen. Verwijder de baarmoederhoorn met de embryo's, met behulp van een nieuwe set schaar en tangen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de darmen in het proces niet worden beschadigd.Breng de baarmoederhoorn met de embryo's in 150 millimeter steriele petrischaal en breng ze over in de kap. Verwijder met behulp van een nieuwe set tangen en scharen de embryo's uit de baarmoederhoorn en scheid de embryo's van de vruchtwatermembranen en de placenta. Om de embryo's te euthanaseren, snijd het ruggenmerg van de embryo's langs de middellijn onder de rechterarm.Dit vermindert het bloeden van de halsslagader tijdens het verwijderen van de SCG. Breng deze embryo's over in de bereide 50 milliliter conische buizen met dissectiemedia. Zorg ervoor dat de embryo's in de media worden ondergedompeld.Elke buis kan maximaal drie embryo's bevatten. Isolatie van het superieure cervicale ganglion van het embryo. Breng een pup van de dissectiemedia over op een steriele petrischaal van 150 millimeter half gevuld met massief substraat met zijn dorsale oppervlak op het substraat.Met behulp van drie steriele 23 meter naalden, pin de pub aan de schotel met een naald onder elke arm en een derde naald door de mond om zorgvuldig hyperextend de nek. Snijd door de huid in het nekgebied met behulp van steriele fijne tangen om de speekselklieren eronder bloot te leggen. Verwijder deze klieren met behulp van fijne tangen.Zoek de sternocleidomastoïde en omohyoïde spieren in de buurt van respectievelijk het sleutelbeen en de luchtpijp. Snijd eerst de dwarse sternocleidomastoïde spieren door. En snijd vervolgens voorzichtig de dunne omohyoïde spier met fijne tangen.Zodra deze spieren zijn verwijderd, zal de splitsing in de halsslagader aan het voorste uiteinde zichtbaar zijn aan weerszijden van de luchtpijp met de SCG onder deze vork in de halsslagader. Til met gesloten tangen voorzichtig de halsslagader op om de SCG te visualiseren. Met behulp van een tang aan weerszijden van de SCG, trek de halsslagader en breng het naar de bereide steriele 35 millimeter gerechten.Dit weefsel zal waarschijnlijk bevatten de SCG met de halsslagader, de nervus vagus met de nodose ganglia, evenals andere segmenten van spier of vet in het gebied. Herhaal het dissectieproces aan de andere kant. Verwijder SGT's uit alle embryo's voordat u verdergaat met de resterende beschreven dissectiestappen.Verdeel de geïsoleerde weefsels over twee van de 35 millimeter schotels om de verwerking van de weefselmonsters te vergemakkelijken. Nabewerking van de SCG. Om de SCG te scheiden van het ontleed weefsel, eerst gebruik maken van fijne tangen om eventuele vreemde weefsels te verwijderen, zoals spier of vet, het verzorgen van het gebied in de buurt van de halsslagader te vermijden.Zodra deze weefsels zijn verwijderd, zijn twee ganglia zichtbaar. De nodose ganglion is kleiner en cirkelvormig, terwijl de SCG amandelvormig is. Trek voorzichtig aan de nervus vagus om de nervus vagus en de nodose ganglia van de halsslagader te scheiden en vervolgens de SCG te scheiden van de halsslagader.Gebruik fijne tangen om de capsule die SCG omringt te verwijderen. Breng de SCG over op een nieuw 35 millimeter kweekschotel. Herhaal dit proces met alle ontleed weefselmonsters.Bedek een gesteriliseerde, met katoen aangesloten glazen pipet met ontledingsmedia om te voorkomen dat het weefsel zich aan de pipetwanden vastkleven. Gebruik de pipet om de dissectiemedia te vervangen door steriele twee milliliter collagenase type II, dispase type II in calcium- en magnesiumvrije HBSS en 50 minuten uit te broeden bij 37 graden Celsius om de weefsels af te breken. Houd er rekening mee dat de incubatietijden mogelijk moeten worden geoptimaliseerd met verschillende batches collagenase/dispase en meestal varieert van 40 minuten tot een uur.Breng na de incubatie de SGT's en collagenase/dispase over naar een steriele conische buis van 15 milliliter. Gebruik de dissectiemedia om de platen te spoelen en de oplossing over te brengen naar de buis. Voeg voldoende dissectiemedia toe om het volume op ongeveer 10 milliliter te brengen.Centrifuge bij 200 x g, 1.000 tot 1, 200 tpm gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het monster te pelleteren. Aspirate de supernatant, het verzorgen van niet verjagen van de pellet. Resuspend de pellet met 10 milliliter dissectie media, herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant.Vervang door een tot twee milliliter cultuurmedium. Met behulp van een smal-bore, gebogen-tip steriele Pasteur pipet, pre-coat het met cultuur medium, mechanisch scheiden van de klonten door zachtjes triturating vijf tot zes keer. Laat de grotere klonten genoegen nemen met ongeveer een minuut en breng de supernatant celsuspensie over naar een nieuwe 10 milliliter buis.Herhaal dit proces nog drie keer met toenemende kracht van trituratie elke keer om te zorgen voor bijna volledige dissociatie van de SCGs. Breng de supernatant na elke ronde van trituratie naar de 10 milliliter buis met de supernatant van de eerste trituratie. Voeg genoeg cultuurmedia toe om het volume op acht tot 10 milliliter te brengen.Meng voorzichtig een celsuspensie en kwantificeer de celdichtheid met een hemocytometer. Verdeel de celsuspensie in de putten bij de aangewezen celdichtheid voor de experimenten. Meng de celsuspensie voortdurend tijdens het beplatingsproces om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen.Voor morfologische analyse, plaat de cellen rond 8,000 cellen per put in een 24-put plaat. En voor genomische en proteomische protocollen, plaat de cellen zo hoog als 30,000 cellen per put. Breng de platen over op een glazen desiccator met steriel water aan de onderkant om een bevochtigde kamer te creëren.Injecteer voldoende CO2, ongeveer 120 milliliter, om een 5%CO2-omgeving in de desiccator te verkrijgen, voorafgaand aan het afdichten. Houd de platen op 35,5 graden Celsius. Dit wordt in het protocol dag nul genoemd.Deze platen kunnen ook worden onderhouden in een reguliere 5%CO2 incubator. De hierboven beschreven methode minimaliseert temperatuur- en pH-veranderingen en helpt ook kruisbesmetting te voorkomen. Onderhoud van de gekweekte SCG neuronen en behandelingen.Deze foto's tonen de gescheiden superieure cervicale ganglia cellen op dag nul, dag een, en dag vijf. De dag nul beeld toont de cellen bij beplating. De cellen verguld op dag nul bevatten een mengsel van zowel neuronale als niet-neuronale cellen.Op dag een, 24 uur na beplating, voorzichtig verwijderen van de helft van de cultuur media en vervangen door twee micromolar Ara-C, cytosine D-arabinofuranoside, een anti-mitotische agent. Laat de behandeling 48 uur op de cellen staan. Meestal is deze lengte van de behandeling voldoende om niet-neuronale cellen in de cultuur te elimineren.Op dag drie, zachtjes aspirate de helft van het medium en vervangen door controlemedium. Op dag vier zijn de cellen klaar voor experimentele behandelingen. Voer culturen om de andere dag met het juiste medium.Voorzichtig vervangen van de helft van het medium in de put met vers medium. Het beeld op dag vijf laat een grote axonale groei zien zonder dendritische groei. Om dendritische groei te induceren, kunnen neuronen worden gekweekt op Matrigel of worden behandeld met 10% serum of 50 nanogram per milliliter botmorfogenetisch eiwit-7.Figuur twee toont veranderingen in neuronale morfologie van E21 rat SCG neuronen na behandeling met BMP-7. Representatieve fase contrastmicrografen bij 10 X vergroting tonen de cirkelvormige neuronale cel lichaam met axonen in de controle neuronen in paneel A, en neuronen met meerdere korte denddrite-achtige processen wanneer behandeld met BMP-7 aangetoond door de pijlen in paneel B.Gekweekt SCG neuronen na passende behandelingen kunnen worden gebruikt voor morfologische analyse met behulp van immunocytochemische vlekken voor genomische analyse en voor biochemische studies , zoals voor proteomische analyses. Raadpleeg het manuscript voor gedetailleerde protocollen voor immunostaining en monstervoorbereiding voor proteomische analyse.Figuur drie toont immunostaining van MAP-2 eiwit in gekweekte embryonale ratten sympathische neuronen. Panelen A tot en met D tonen gekweekte SCG-neuronen behandeld met controlemedia en panelen E via H tonen neuronen behandeld met BMP-7 met 50 nanogram per milliliter gedurende vijf dagen. Representatieve micrografen die immunocytochemische kleuring van de neuronen met microtubuli geassocieerde eiwit-2 in C en G tonen, een nucleaire vlek in D en H met fase contrast micrografen in B en F, en ontstaan van de drie kanalen in A en D.Immunocytochemische kleuring van microtubuli geassocieerde eiwit-2 is aanwezig in het cellichaam en proximale axoons van de controle neuronen in paneel C.And kleuring van MAP-2 eiwit in het cellichaam , en dendrieten in BMP-7 behandelde neuronen is in paneel G.Hier is een monster run van superieure cervicale ganglia behandeld met controle media, die 1, 100 eiwitten gedetecteerd.Gen ontologie met behulp van de Panther database bleek dat de meeste van de eiwitten waren cytoplasmatisch. Er waren echter membraangebonden eiwitten en eiwitten op cellulaire knooppunten in het monster. Deze analyse toonde ook aan dat eiwitten die betrokken zijn bij een breed scala van neuronale signalering trajecten werden gedetecteerd in het monster.Tot slot, na het bekijken van deze video, moet je in staat zijn om te isoleren en cultuur rat embryonale superieure cervicale ganglion neuronen voor morfologische en proteomische analyse. Dit werk werd gefinancierd door het facultaire ontwikkelingsfonds en het zomeronderzoeksprogramma van Saint Mary's College of California.

culturing-rat-sympathetic-neurons-from-embryonic-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit is een protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur primaire sympathische neuronen van een superieure cervicale ganglia (SCG) van pasgeboren ratten pups.

Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

We beschrijven een protocol voor het gebruik van botmorfogenetische eiwit-7 (BMP-7) of Matrigel om selectief te induceren dendritische groei van de primaire sympathische neuronen los worden gezien van de superieure cervicale ganglia (SCG) van perinatale ratten.

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

De belangrijkste bekken ganglia bevatten parasympathische en sympathische neuronen die bekkenorganen innervate. Hier beschrijven we een dissectie methode en bieden schema's voor de identificatie van deze ganglia en hun bijbehorende zenuwen. Deze methoden kunnen worden toegepast op experimentele manipulatie van deze ganglia in vivo of verwijdering post-mortem voor verder onderzoek.

Dissectie van Bekken Autonome Ganglia en bijbehorende zenuwen in mannelijke en vrouwelijke ratten

Pathofysiologische veranderingen in het cardiale autonome zenuwstelsel, vooral in de sympathische tak, dragen bij aan het ontstaan en onderhoud van ventriculaire aritmieën. In dit protocol laten we zien hoe we murine stellate ganglia kunnen karakteriseren om het begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire processen te verbeteren.

Locatie, dissectie en analyse van het Murine Stellate Ganglion

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Het huidige protocol beschrijft een muismodel van de ablatie van adrenerge innervatie door het superieure cervicale ganglion te identificeren en te reseceren.

Chirurgische techniek voor superieure cervicale ganglionectomie in een muizenmodel

Leer het kweken van embryonale ratten-sympathische neuronen uit de ganglion cervicale superius voor morfologische en proteomische analyse. Deze methode omvat dissectie, enzymatische digestie en immunocytochemische kleuring.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Meer video's verkennen