Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen
13 juni 2020
Hier methoden worden gepresenteerd om te begrijpen anti-kanker effecten van Lactobacillus celvrije supernatant (LCFS). Colorectale kankercellijnen tonen celsterfte bij behandeling met LCFS in 3D-culturen. Het proces van het genereren van sferoïden kan worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de steiger en de gepresenteerde analysemethoden zijn nuttig voor het evalueren van de betrokken signaleringsroutes.
Dit protocol is geoptimaliseerd om het onderzoek naar het antikankereffect van de cell-free supernatant van Lactobacillus bij meerdere typen colonkankercelsferoïden gemakkelijker te maken. Deze techniek is de eerste benadering die de antikankereffecten van LCFS op colonkankersferoïden onder in vivo-imitatieomgevingen onderzoekt. Begin door een autoclaaf gesteriliseerde MRS-agarplaat in een 37 graden Celsius waterstofanaerobe kamer met 20 delen per miljoen zuurstof te plaatsen en de plaat te inoculeren met vers ontdooid Lactobacillus-bacteriestok.
Voeg twee tot drie milliliter MRS-bouillon, aangevuld met l-cysteïne, toe aan de buis en sluit de buis af met de butylrubber stop en buiskoppeling. Gebruik vervolgens een loop om een enkele kolonie te verzamelen en plaats de kolonie in een 1,5 milliliter kweekbuis met 500 microliter PBS. Resuspendeer de kolonie homogeen in de zoutoplossing en laad de volledige bacteriesuspensie in een een milliliter spuit.
Steek de naald in het midden van het deksel van de kweekbuis en breng de kolonie in het medium. Plaats de kweek in een schudende incubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 200 omwentelingen per minuut. Na twee dagen meet u de OD620 van de kweek op een spectrofotometer.
Wanneer de OD620 gelijk is aan twee, sedimenteer de bacteriën door centrifugatie en was de bacteriepellet met PBS. Na de tweede centrifugatie, resuspendeer de bacteriën in vier milliliter RPMI 1640, aangevuld met 10% foetaal bovien serum zonder antibiotica en plaats de bacteriën in de schudde incubatie voor vier uur bij 100 omwentelingen per minuut. Aan het einde van de incubatie, pellet de bacteriën door centrifugatie en steriel filter de teruggewonnen supernatant door een 0,22 micron zeef voor opslag bij min 80 graden Celsius.
Om colorectale kankercellijnen voor sferoïdvorming voor te bereiden, kweek de cellen van belang als monolagen in 100 millimeter petrischalen in de celkweekincubator. Wanneer de cellen een 70 tot 80% confluentie bereiken, was de culturen twee keer met vier milliliter PBS per wasbeurt voordat u de cellen losmaakt met één milliliter 0,25% trypsin-EDTA per schaal. Controleer na twee minuten de dissociatie onder een lichtmicroscoop.
Als de cellen los zijn, neutraliseer de enzymatische reactie met vijf milliliter groeimedium. Verzamel de cellen door centrifugatie in één 15 milliliter conische buis per celkweek en resuspendeer de pellets voorzichtig met drie milliliter groeimedium per buis. Tel vervolgens het aantal levensvatbare cellen door trypaanblauw exclusie.
Na het tellen, verdun de cellen tot een concentratie van één tot twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in vers medium en voeg methylcellulose toe aan de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 0,6%. Breng de cellen over naar een steriele reservoir en gebruik een multikanaals pipet om 200 microliter cellen in elke put van een ultra laag aanhechting 96-puts ronde bodem microplaat te doseren. Plaats vervolgens de plaat in de celkweekincubator gedurende 24 tot 36 uur voordat u controleert op de vorming van sferoïd door lichtmicroscopie.
Voor LCFS-behandeling, verdun de bereide ontdooid LCFS-stokoplossing serieel in vers groeimedium tot 25, 12,5 en 6% concentraties en gebruik een 200 microliter pipet om voorzichtig zoveel mogelijk supernatant uit elke put van de geplaatste colorectale kankercellijncultuur te verwijderen. Voeg vervolgens voorzichtig 200 microliter LCFS aangevuld groeimedium in drievoud toe aan elke set kankercellen en plaats de plaat terug in de incubatie voor een extra 24 tot 48 uur. Een methylcelluloseconcentratie van 0,6% transformeert de geteste kankercellijncellen in compacte sferoïd, wat aangeeft dat sferoïd kunnen worden gegenereerd uit verschillende typen colorectale kanker met behulp van dit protocol.
Sferoïd die gekweekt zijn met 25% LCFS vertonen verstoorde oppervlakken en een verminderde celviabiliteit op een dosisafhankelijke manier. Inderdaad, LCFS co-gekweekte cellen vertonen hogere niveaus van propidiumjodide expressie in vergelijking met levensvatbare controlecellen. Reverse transcriptase PCR-analyse, Western blotting en flow cytometrische annexine V/7-AAD-analyse kunnen ook worden uitgevoerd om de effecten van LCFS op kankercel apoptose te beoordelen.
Zorg ervoor dat u de sferoïd voorzichtig behandelt bij het verwijderen van het groeimedium, omdat de sferoïd gemakkelijk kunnen breken, waardoor het onmogelijk wordt om het effect van LCFS-behandeling waar te nemen. Na deze procedure kunnen celviabiliteitsassays, kwantitatieve real-time PCR, Western blotting en FACS-analyse worden uitgevoerd om het antikankereffect van LCFS in meer detail te karakteriseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het onderzoeken van de antikankereffecten van celvrij supernatant van Lactobacillus (LCFS) op colonkankersferoïden. De studie optimaliseert de generatie van sferoïden en evalueert de signaleringspaden die betrokken zijn bij celdood.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Lactobacillus staat bekend om de potentiële gezondheidsvoordelen.
- Celvrije supernatanten kunnen bioactieve verbindingen bevatten.
- Colorectaal carcinoom blijft een aanzienlijke uitdaging voor de volksgezondheid.
- 3D-celculturen bootsen in vivo-condities beter na.
Doel van de studie
- Het onderzoeken van de antikankereffecten van LCFS op colonkankersferoïden.
- Het optimaliseren van technieken voor de generatie van sferoïden.
- Het analyseren van de signaalpaden die betrokken zijn bij de waargenomen effecten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van MRS-agarplaten in een anaerobe kamer.
- Inoculatie van platen met Lactobacillus-bacteriestammen.
- Kweek van bacteriën in MRS-bouillon aangevuld met l-cysteïne.
- Verzamelen en resuspenderen van bacteriële kolonies voor behandeling.
Belangrijkste resultaten
- Colorectale kankercellijnen vertoonden celdood na behandeling met LCFS.
- Geoptimaliseerde methoden voor de generatie van sferoïden verbeterden de experimentele resultaten.
- Signaalpaden die betrokken zijn bij celdood werden effectief geanalyseerd.
- De studie biedt een nieuwe benadering voor onderzoek naar kankerbehandelingen.
Conclusies
- LCFS is veelbelovend als potentieel antikankermiddel.
- 3D-kweektechnieken zijn essentieel voor een nauwkeurige modellering.
- Verder onderzoek is nodig om de betrokken mechanismen volledig te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol stelt biopharma R&D-teams in staat om probiotica-afgeleide supernatanten te evalueren op antikankeractiviteit in fysiologisch relevante 3D-colorectale kankermodellen. Door Lactobacillus fermentum celvrij supernatant (LCFS) te gebruiken in stabiele sferoïdeculturen, ondersteunt deze methode de mechanistische risicoreductie van natuurproductkandidaten en verbetert het het voorspellend vertrouwen bij inspanningen voor targetvalidatie. De aanpak slaat een brug tussen screening in de ontdekkingsfase en translationele relevantie door interacties in de darmmicro-omgeving te modelleren die de levensvatbaarheid van kankercellen beïnvloeden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen met betrekking tot microbiële metabolieten en hun impact op celdoodpaden van colorectale kankercellen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via dosisafhankelijke levensvatbaarheidsmetingen in 3D-sferoïde-modellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door LCFS-geïnduceerde apoptose te koppelen aan meetbare moleculaire markers via qRT-PCR, Western blot en FACS.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarstaan van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door middel van reproduceerbare sferoïdvorming in platen met ultra-lage hechting.
- Kwantitatieve output: Genereert dosis-responsgegevens (25%, 12,5%, 6% LCFS), wat IC50-schattingen en modellering van structuur-activiteitsrelaties mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van een 96-well formaat dat compatibel is met geautomatiseerde vloeistofbehandeling en high-throughput viabiliteitsscreening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert de pathofysiologie van colorectaal carcinoom met behulp van sferoïden van patiëntafgeleide of gevestigde cellijnen die de in vivo tumorarchitectuur weerspiegelen.
- Translationele continuïteit: Verbindt bevindingen uit het discovery-onderzoek met preklinische validatie door consistente 3D-kweekcondities te handhaven over de verschillende assayfasen.
- Risico-gecorrigeerde besluitvorming: Faciliteert go/no-go-criteria op basis van apoptose-inductie en levensvatbaarheidsdrempels waargenomen in sferoïde co-culturen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows na de target-identificatie en voorafgaand aan de lead-optimalisatie, waardoor een ziekterelevant systeem ontstaat voor het evalueren van bioactieve supernatanten uit microbiële bronnen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van microbiële anticancer-mechanismen en pathway-verduidelijking in 3D-modellen die in vivo responsen beter voorspellen.
- Screening: Zorgt voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor sferoïdvorming en LCFS-behandeling.
- Analytics: Maakt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk (viabiliteit, apoptosemarkers) die statistische vergelijking tussen behandelcondities en cellijnen ondersteunen.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft continuïteit van sferoïde-gebaseerde screening naar preklinische validatie door de getrouwheid van de 3D-cultuur te behouden.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van probiotische supernatanten, extracten van gefermenteerd voedsel of therapeutica afgeleid van het microbioom over meerdere kankertypes heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door vals-positieven uit 2D-modellen te verminderen en micro-omgevingsafhankelijke effecten vast te leggen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de workflows voor de generatie en behandeling van sferoïden, wat de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties verbetert en de variabiliteit van assays vermindert.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicobeperking van interventies gericht op het microbioom mogelijk te maken vóór kostbare in vivo-studies.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van leads van natuurproducten op basis van apoptose-inductie en dosis-respons in klinisch relevante modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in anaerobe bacteriële kweek, de hantering van 3D-sferoïden en apoptose-assaytechnieken (qPCR, WB, FACS).
- Afhankelijk van instrumentarium waaronder anaerobe kamers, schudincubators, spectrofotometers en flowcytometers.
- Vereist cross-team standaardisatie tussen microbiologie- en kankerbiologieteams voor een consistente preparatie van LCFS en kwaliteitscontrole van sferoïden.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij uitbreiding naar andere bacteriële stammen of kankertypes buiten colorectale modellen.
- Beperkt door de fragiliteit van sferoïden tijdens mediumwissel, waardoor voorzichtige hantering noodzakelijk is om de structurele integriteit te behouden voor nauwkeurige resultaten.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
