Name: X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer X-ray kristallografie om de oligomere toestandsovergang van TmPep1050 te bestuderen. Deze methode onthult de structuur van dimere en dodecamere aminopeptidasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Martine Roovers voor het nalezen van deze krant en het geven van constructieve opmerkingen. Toegang tot Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) viel binnen Block Allocation Groups 20151139.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hierin beschreven maakt het mogelijk inzicht in de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050 op structureel niveau. De methodologie werd eerder ervaren voor het bepalen van de structuur van beide TmPep1050 oligomers11. De meest uitdagende stap was het vinden van voorwaarden ter bevordering van de dissociatie van dodecamers in stabiele dimers. Dergelijke omstandigheden moesten mild genoeg zijn om de koppeling van dimers in dodecamers mogelijk te maken toen de metaal-ionencofactor werd toe...

Oligomerisatie is een overheersend proces dat de biologische functies van veel eiwitten dicteert. In Escherichia coliwordt geschat dat slechts 35% van de eiwitten monomeerbaar is1. Sommige eiwitten, genaamd morpheeins, kunnen zelfs verschillende oligomerische toestanden aannemen met subeenheden met een duidelijke structuur in elke oligomerische toestand2. De overgang tussen hun oligomerische toestanden is vaak een gemiddelde om eiwitactiviteit te reguleren, omdat elke oligomerische toestand een andere specifieke activiteit of functie kan hebben. Verschillende voorbeelden van morpheeins zijn goed gedocumenteerd in de literatuur, met name de porphobilinogen synthase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase7, pyruvate kinase8, citraat synthase9, en ribonuclease A10. Onlangs hebben we beschreven de M42 aminopeptidase TmPep1050, een ander voorbeeld van enzym met morphein-achtig gedrag, waarvan de activiteit afhankelijk is van zijn oligomerieke toestanden11. De overgang tussen de oligomerische toestanden wordt bemiddeld door zijn metaalcofactoren die verschillende structurele wijzigingen van de subeenheden veroorzaken.
De M42 aminopeptidase familie behoort tot de MH clan12,13, en wordt op grote schaal verspreid onder Bacteriën en Archaea14. De M42 aminopeptidases zijn echte dinucleaire enzymen die peptiden tot 35 aminozuurresten in lengte15degraderen. Ze nemen een eigenaardige tetraëdervormige structuur aan die bestaat uit 12 subeenheden met hun actieve locaties gericht op een innerlijke holte. Een dergelijke regeling wordt vaak beschreven als een nano-compartimentering van de activiteit om ongecontroleerde proteolyse te voorkomen. De fysiologische functie van de M42 aminopeptidases kan worden geassocieerd met het proteasoom, hydrolyserende peptiden als gevolg van eiwitafbraak16,17. Pyrococcus horikoshii bezit vier M42 aminopeptidases, die elk verschillende maar complementaire specificiteiten18,19,20,21presenteren . Bijzonder, heterocomplexen gemaakt van twee verschillende soorten subeenheden zijn beschreven in P. horikoshii, wat wijst op het bestaan van peptidasome complexen22,23.
Verschillende structuren van M42 aminopeptidases zijn beschreven in de literatuur11,16,18,19,20,24,25,26. De subunit bestaat uit twee verschillende domeinen, een katalytisch domein en een dimerisatiedomein. De katalytische domein neemt een gemeenschappelijke α / β vouw bewaard in de hele MH-clan, de archetypische katalytische domein wordt de aminopeptidase Ap1 van Vibrio proteolyticus27. De dimerization domein neemt een PDZ-achtige vouw16 en kan, naast zijn rol in de oligomerisatie, een rol hebben bij het regelen van substraattoegang en binding in de binnenholte11. Aangezien de basisbouwsteen een dimer is, wordt de dodecamer vaak omschreven als de associatie van zes dimers, waarbij elke dimer aan elke rand van de tetraëder16wordt geplaatst. De oligomerisatie van de M42 aminopeptidases is afhankelijk van de beschikbaarheid van zijn metaalcofactoren. Divalent metaalionen, vaak Zn2+ en Co2+, zijn katalytisch betrokken bij de peptide binding en hydrolyse. Ze zijn te vinden in twee verschillende bindende sites, namelijk M1 en M2 sites. De twee metalen ionen rijden ook en stemmen de oligomerisatie zoals aangetoond voor PhTET2, PhTET3, PfTET3 en TmPep105011,24,28,29. Wanneer de metaalcofactoren uitgeput zijn, demonteert de dodecamer in dimers, zoals in PhTET2, PhTET3 en TmPep105011,16,28of zelfs monomeren, zoals in PhTET2 en PfTET324,29.
Hier gepresenteerd is een protocol dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de structuren van TmPep1050 oligomers. Dit protocol is een reeks gemeenschappelijke methoden, waaronder eiwitzuivering, proteolytische activiteitscreening, kristallisatie, röntgendiffractie en moleculaire vervanging. Subtiliteiten die inherent zijn aan het omgaan met metalloenzymen, eiwit oligomerisatie, eiwit kristallisatie en moleculaire vervanging worden benadrukt. Er wordt ook een studiegeval gepresenteerd om aan te tonen of TmPep1050 dodecamers zich verder kunnen distantiëren in monomeren of niet. Om deze vraag te beantwoorden, een TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, is onderzocht waarvan de metalen binding sites worden aangetast door het muteren van His-60 (M2 site) en His-307 (M1 site) naar Ala residuen. Dit protocol kan worden ondergebracht om andere M42 aminopeptidases of metaalloenzymen met morpheein-achtig gedrag te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantroline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Merck Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>N/A</td><td></td><td>bezoek http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr><tr><td>cOmplete EDTA-free</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>N/A</td><td></td><td>bezoek https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr><tr><td>Crystal Screen I</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen II</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal 15-well tool</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli PPY strain</td><td>N/A</td><td></td><td>zie referentie 31</td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 blue strain</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtration Standard</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Index</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td><td>Molecular Dimensions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-leucine-p-nitroanilide</td><td>Bachem AG</td><td>40010720025</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Neggia plugin</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>bezoek https://www.dectris.com/</td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>N/A</td><td></td><td>bezoek https://www.phenix-online.org/</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Source 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>Source 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 prep grade</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>DNASU Plasmid Repository</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XDS</td><td>N/A</td><td></td><td>bezoek http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr><tr><td>xdsme</td><td>N/A</td><td></td><td>bezoek https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

x-ray kristallografie om de oligomerische staat overgang van de thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050 studie

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

De M42 aminopeptidases vormen functioneel actieve complexen gemaakt van 12 subeenheden. Hun assemblageproces lijkt te worden gereguleerd door hun metalen ionen cofactoren triggering een dimer-dodecamer overgang. Bij metaalionbinding vinden verschillende structurele wijzigingen plaats in de actieve site en op de interactie-interface, waardoor dimers worden gevormd om de zelfassemblage te bevorderen. Om dergelijke wijzigingen waar te nemen, moeten stabiele oligomeren vóór de structurele studie worden geïsoleerd. Hier gemeld is een methode die het mogelijk maakt de zuivering van stabiele dodecamers en dimers van TmPep1050, een M42 aminopeptidase van T. maritima, en hun structuur bepaling door X-ray kristallografie. Dimers werden bereid van dodecamers door het verwijderen van metalen ionen met een chelaatvormer. Zonder hun cofactor werden dodecamers minder stabiel en werden ze volledig gescheiden bij verwarming. De oligomeric structuren werden opgelost door de ongecompliceerde moleculaire vervangingsbenadering. Ter illustratie van de methodologie wordt de structuur van een TmPep1050-variant, volledig aangetast in metaalionbinding, gepresenteerd waaruit blijkt dat er geen verdere uitsplitsing van dimers op monomeren wordt weergegeven.

Om een mogelijke dodecamer dissociatie in monomeren in TmPep1050 te bestuderen, werden de His-60 en His-307 codons vervangen door alanine codon met behulp van een synthetisch gen. Dit gen werd vervolgens gekloond in pBAD vector voor expressie en zuivering van de overeenkomstige TmPep1050 variant vervolgens genaamd TmPep1050H60A H307A. Grootte uitsluiting chromatografie (Figuur 3B) toonde aan dat het gezuiverde eiwit had een schijnbare moleculaire gewicht van 56 kDa (moleculair gew...

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Dit protocol vergemakkelijkt de studie van aminopeptidases met verschillende oligomeric toestanden en oligomerisatie-afhankelijke activiteiten die in evenwicht zijn tussen inactieve dimers en actieve dodecamers. Deze conventionele techniek kan eenvoudig worden uitgevoerd in elk lab. En afgezien van het vereisen van toegang tot een beamline of x-ray kristallografie faciliteit, vereist geen speciale apparaten.Met enige aanpassing kan deze methode worden toegepast op elk ander eiwit met een activiteit of functie die afhankelijk is van de mate van oligomerisatie. Om de röntgengegevens te verwerken, moeten gebruikers een minimaal begrip van kristallografie hebben. We nodigen gebruikers uit om trainingen te volgen, om XDS Wiki te bezoeken en phenix tutorials te bekijken.Om een activiteitstest uit te voeren, voeg 25 microliters van 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide toe aan 965 microliters van 50 millimolar MOPS, 250 micromolar kobalt twee chloride en 10%methanol Pre incubeer het reactiemengsel in een 75 graden Celsius droog bad, alvorens het enzym te verdunnen tot een micromolar eindconcentratie met extra 50 millimalar MOPS. Voeg vervolgens 10 microliter van één micromolarenzym toe aan het

x-ray-crystallography-to-study-oligomeric-state-transition-thermotoga

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

In dit artikel beschrijven we de protocollen van eiwit expressie, zuivering, kristallisatie en structuur vastberadenheid van het domein van de N-terminal van de ryanodine receptor van de koolmot (Plutella xylostella).

Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Hier beschrijven we hoe we de geautomatiseerde macromoleculaire kristallografiepijplijnen kunnen gebruiken voor eiwit-naar-structuur, snelle ligand-eiwitcomplexanalyse en grootschalige fragmentscreening op basis van de CrystalDirect-technologie in het HTX-laboratorium in EMBL Grenoble.

De geautomatiseerde kristallografiepijpleidingen in de EMBL HTX-faciliteit in Grenoble

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Leer X-ray kristallografie om de oligomere toestandsovergang van TmPep1050 te bestuderen. Deze methode onthult de structuur van dimere en dodecamere aminopeptidasen.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

Meer video's verkennen