Name: Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer hoe je HAT-remmers valideert met HAT-assays, immunoblotting en ChIP-qPCR voor epigenetisch kankeronderzoek. Deze methoden geven inzicht in globale en regionale histonacetylering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van James en Esther King Biomedical Research Program (6JK03 en 20K07), en Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 en 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, en UF Health Cancer Center. Daarnaast willen we Dr. Zachary Osking en Dr. Andrea Lin bedanken voor hun steun tijdens het publicatieproces.

De auteurs hebben geen belangenconflicten of onthullingen te maken.

Lysine acetyltransferases (KATs) acetylaat verschillende lysine residuen op histon staarten en transcriptie factoren om gen transcriptie te reguleren2,3. Uit onderzoek in de afgelopen twee decennia is gebleken dat KAT's, zoals CBP/p300, PCAF en GCN5, interageren met oncogene transcriptiefactoren en tumorgroei stimuleren in verschillende vaste tumortypen4,5,9,<...

Lysine acetyltransferases (KAT's) katalyseren de acetylatie van lysineresiduen op zowel histon- als niet-histoneiwitten1,2,3,4. Recent onderzoek toont aan dat DE's en hun acetyltransferase functie kan bevorderen vaste tumorgroei4,5,6,7,8,9. Creb-bindend eiwit (CBP)/p300 zijn bijvoorbeeld twee paralogeuze KAT's die talrijke signaleringstrajecten bij kanker2,3reguleren . CBP/p300 hebben een goed gekarakteriseerde histon acetyltransferase (HAT) functie en katalyseren Histone 3 Lysine 27 acetylatie (H3K27ac)2,4,5,10,11, een belangrijke marker voor actieve versterkers, promotor regio's en actieve gen transcriptie12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische co-activators voor pro-groeisignaleringstrajecten in vaste tumoren door transcriptie van oncogenen te activeren door acetylatie van histonen en andere transcriptiefactoren4,9,15,16,17,18.9 Vanwege hun rol in tumorprogressie worden CBP/p300 en andere KAT's onderzocht op de ontwikkeling van nieuwe remmers die hun oncogene functie4,5,6,7,,8,9,18,19,20blokkeren . A-485 en GNE-049 vertegenwoordigen twee succesvolle pogingen om krachtige en specifieke remmers te ontwikkelen voor CBP/p3004,9. Aanvullende remmers worden momenteel onderzocht voor CBP/p300 en andere KAT's.
De kwaliteit van eerder beschreven KAT-remmers (KATi) wordt in twijfel getrokken, waarbij veel remmers met doeleffecten en slechte karakterisering21pronken. Daarom is rigoureuze karakterisering en validatie van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen essentieel voor de ontwikkeling van hoogwaardige chemische sondes. Hier beschreven zijn drie protocollen die een pijplijn vormen voor screening en rigoureus valideren van de potentie en specificiteit van nieuwe KATi, met een specifieke focus op het remmen van de HAT-functie (HATi) van KATs. CBP/p300 en hun remmers worden gebruikt als voorbeelden, maar deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere KAT's die een HAT-functiehebben 7.
Het eerste protocol is een in vitro histon acetyltransferase (HAT) test die gezuiverde recombinant p300 en histonen gebruikt in een gecontroleerde reageerbuisreactie. Deze test is eenvoudig uit te voeren, is kosteneffectief, kan worden gebruikt om verbindingen te screenen in een lage doorvoerinstelling en vereist geen radioactieve materialen. In dit protocol wordt recombinant p300 lysineacetylatie op histonstaarten tijdens een korte incubatieperiode en de niveaus van histonacetylatie gemeten met behulp van standaard immunoblottingsprocedures. De enzymatische reactie kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van CBP/p300-remmers om te screenen op verbindingen die histonacetylatie verminderen. Bovendien kan de HAT-test worden gebruikt om na te gaan of nieuwe verbindingen selectief zijn voor cbp/p300 door hun activiteit te beoordelen op andere gezuiverde KAT's, zoals PCAF. De HAT-test is een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van nieuwe remmers vanwege de eenvoud, lage kosten en de mogelijkheid om de potentie/selectiviteit van een remmer te bepalen. Inderdaad, dit protocol wordt vaak gebruikt in de literatuur als een in vitro scherm5,10. Echter, remmers geïdentificeerd in de HAT-test zijn niet altijd effectief in de celcultuur, omdat een reageerbuis reactie is veel eenvoudiger dan een levend celsysteem. Daarom is het essentieel om remmers verder te karakteriseren in celkweekexperimenten22,23.
Het tweede protocol in de pijplijn is de Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test. Deze cel gebaseerde test maakt gebruik van histone deacetylase remmers (HDACi) als een instrument om histonen hyperacetylate in chromatine voor co-incubatie met een HATi24. Basale histonacetylatie kan laag zijn in de celcultuur, waardoor het moeilijk is om via immunoblotting te sonde zonder de toevoeging van een HDACi om acetylatie te verhogen. Het doel van de ChHAI-test is het identificeren van nieuwe HATi die de toename van histonacetylatie veroorzaakt door HDAC-remming kan verzachten. De voordelen van deze test zijn de lage kosten, relatieve gemak uit te voeren, en het gebruik van cellen in de cultuur, die meer fysiologische relevantie dan de reageerbuis HAT test biedt. Net als bij de HAT-test maakt dit protocol gebruik van standaard immunoblotting voor het verzamelen van gegevens.
De HAT en ChHAI testen geven gegevens over de potentie van nieuwe verbindingen voor het remmen van wereldwijde histonacetylatie, maar geven geen inzicht in hoe deze verbindingen wijzigingen in specifieke genomische regio's beïnvloeden. Daarom is het uiteindelijke protocol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) een celkweekexperiment dat DNA-eiwitinteracties onderzoekt in specifieke gebieden van het genoom. In het ChIP-protocol wordt chromatine gekoppeld om DNA-eiwitinteracties te behouden. De chromatine wordt vervolgens uit cellen geëxtraheerd en het DNA-eiwitcomplex ondergaat selectieve immunoprecipitatie voor het eiwit van belang (bijvoorbeeld met behulp van een antilichaam specifiek voor H3K27ac). Het DNA wordt vervolgens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van qPCR. ChIP-qPCR kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen of een nieuwe HATi histonacetylatie downreguleert bij individuele oncogenen, zoals Cyclin D125. Hoewel ChIP-qPCR een veelgebruikte techniek is die in het veld wordt gebruikt, kan het moeilijk zijn om4,10,,26te optimaliseren . Dit protocol biedt tips voor het vermijden van mogelijke valkuilen die kunnen optreden tijdens het uitvoeren van de ChIP-qPCR-procedure en bevat kwaliteitscontroles die op de gegevens moeten worden uitgevoerd.
Wanneer ze samen worden gebruikt, maken deze drie protocollen het mogelijk om nieuwe HATi rigoureus te karakteriseren en valideren. Bovendien bieden deze methoden veel voordelen omdat ze gemakkelijk uit te voeren zijn, relatief goedkoop en gegevens te verstrekken over zowel wereldwijde als regionale histonacetylatie.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Voor alle methoden</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>83.3902</td><td>Voor celcultuur van MCF-7 cellen</td></tr><tr><td>10 ul tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>Voor alle methoden</td></tr><tr><td>1000 ul tips</td><td>Corning</td><td>4846</td><td>Voor alle methoden</td></tr><tr><td>10X Glycine buffer</td><td></td><td></td><td>Voor methode 3. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>10X Running Buffer</td><td></td><td></td><td>Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>10X TBST</td><td></td><td></td><td>Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>Voor methode 2</td></tr><tr><td>15 cm dish</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>83.3903</td><td>Voor methode 3</td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200249</td><td>Voor methoden 2 en 3</td></tr><tr><td>1X TBST met 5% melk en 0.02% Sodium Azide</td><td></td><td></td><td>Voor methoden 1 en 2. Kan worden gebruikt om primaire antilichamen te verdunnen die meer dan één keer zullen worden gebruikt. Maakt kortetermijnopslag van primaire antilichaamverdunningen mogelijk. Niet gebruiken voor secundaire antilichaamdilutie. LET OP: Sodium Azide is giftig.</td></tr><tr><td>1X TBST met 5% melk</td><td></td><td></td><td>Voor methoden 1 en 2. Gebruikt om PVDF-membraan te blokkeren en voor antilichaamverdunningen. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>200 ul tips</td><td>Corning</td><td>4844</td><td>Voor alle methoden</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>voor SDS-monsterbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>4-20% polyacrylamide gel</td><td>Thermo Fisher: Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td>Voor methoden 1 en 2</td></tr><tr><td>5X Assay buffer</td><td></td><td></td><td>Voor methode 1. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>5X Passive lysis buffer</td><td></td><td></td><td>Voor methode 2. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td></td><td></td><td>Voor methoden 1 en 2. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>A-485</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-107455</td><td>CBP/p300-remmer voor gebruik in methoden 2 en 3. Opgelost in DMSO.</td></tr><tr><td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4771</td><td>Voor methode 1</td></tr><tr><td>Acetyl-CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td>voor gebruik in methode 1</td></tr><tr><td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antilichaam (H3K27ac)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 8173</td><td>antilichamen voor H3K27ac voor immunoblots en ChIP</td></tr><tr><td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antilichaam (H3K18ac)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 9675</td><td>antilichamen voor H3K18ac voor immunoblots en ChIP</td></tr><tr><td>alpha tubulin antilichaam</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5168</td><td>Voor methode 2. Verdun 1:20.000</td></tr><tr><td>Anacardic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>13144</td><td>Voor methode 1</td></tr><tr><td>anti-muis IgG HRP-gekoppeld secundair antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076</td><td>Voor methoden 1 en 2. Verdun 1:10.000</td></tr><tr><td>anti-konijn IgG secundair antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td>Voor methoden 1 en 2. Verdun 1:10.000 tot 1:20.000</td></tr><tr><td>Autoradiografiefilm</td><td>MIDSCI</td><td>BX810</td><td>Voor methoden 1 en 2</td></tr><tr><td>Belly Dancer draaiend platform</td><td>Stovall Life Science Incorporated</td><td>niet beschikbaar</td><td>Voor methoden 1 en 2</td></tr><tr><td>Bovine Calf Serum (BCS)</td><td>HyClone</td><td>SH30072.03</td><td>celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>voor SDS-monsterbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Spectrum Chemical</td><td>125572-95-4</td><td>Voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>celschraper</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3010</td><td>Voor methode 3</td></tr><tr><td>ChIP-dilutiebuffer</td><td></td><td></td><td>Voor methode 3. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>ChIP Elutie Buffer</td><td></td><td></td><td>Voor methode 3. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>Complete DMEM voor MCF-7 cellen</td><td></td><td></td><td>Voor methoden 2 en 3. Zie tabel 1 voor recept.</td></tr><tr><td>Covaris 130 & microl microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Sonicatiebuis voor gebruik met Covaris S220 in methode 3</td></tr><tr><td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>S220</td><td>DNA-sonicator voor gebruik in methode 3</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>voor medicijnverdunning en voertuigcontrolebehandeling</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td>voor SDS-monsterbuffervoorbereiding</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>celcultuurmedium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Voorbeeld overdrachtstank en overdrachtsapparaat</td><td>Bio-rad</td><td>1704070</td><td>Voor methoden 1 en 2</td></tr><tr><td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td><td>Millipore Sigma</td><td>17-10086</td><td>Voor methode 3</td></tr><tr><td>FK228 (Romidepsin)</td><td>Cayman Chemical</td><td>128517-07-7</td><td>HDAC-remmer voor gebruik in methode 2</td></tr><tr><td>Formaldehyde-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>voor celfixatie</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td>Voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td>voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Hoge zoutwasbuffer</td><td></td><td></td><td>Voor methode 3</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td>voor buffer

assays voor het valideren van histon acetyltransferase inhibitors

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) katalyseren acetylatie van lysineresiduen op histonen en andere eiwitten om chromatinedynamica en genexpressie te reguleren. KATs, zoals CBP/p300, worden intensief onderzocht als therapeutische doelstellingen toe te schrijven aan hun kritieke rol in tumorigenese van diverse kankers. De ontwikkeling van nieuwe kleine molecuulremmers gericht op de histon acetyltransferase (HAT) functie van KATs is uitdagend en vereist robuuste tests die de specificiteit en potentie van potentiële remmers kunnen valideren.
Dit artikel schetst een pijplijn van drie methoden die rigoureuze in vitro validatie voor nieuwe HAT-remmers (HATi) bieden. Deze methoden omvatten een reageerbuis HAT-test, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test, en Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve PCR (ChIP-qPCR). In de HAT-test worden recombinant HAT's geïncubeerd met histonen in een reageerbuisreactie, waardoor specifieke lysineresiduen op de histonstaarten kunnen worden geaced. Deze reactie kan worden geblokkeerd door een HATi en de relatieve niveaus van site-specifieke histonacetylatie kunnen worden gemeten via immunoblotting. Remmers geïdentificeerd in de HAT-test moeten worden bevestigd in de cellulaire omgeving.
De ChHAI-test gebruikt immunoblotting om te screenen op nieuwe HATi die de robuuste hyperacetylatie van histonen verzwakt, veroorzaakt door een histone deacetylase inhibitor (HDACi). De toevoeging van een HDACi is nuttig omdat basale niveaus van histonacetylatie moeilijk te detecteren zijn via immunoblotting.
De HAT en ChHAI testen meten wereldwijde veranderingen in histon acetylatie, maar geven geen informatie over acetylatie in specifieke genomische regio's. Daarom wordt ChIP-qPCR gebruikt om de effecten van HATi op histonacetylatieniveaus op genregulerende elementen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door selectieve immunoprecipitatie van histon-DNA complexen en analyse van het gezuiverde DNA via qPCR. Samen, deze drie tests zorgen voor de zorgvuldige validatie van de specificiteit, potentie, en werkingsmechanisme van de nieuwe HATi.

De in vitro histon acetyltransferase (HAT) test kan worden gebruikt om te sonde voor verbindingen die p300 HAT activiteit remmen in de richting van een histon substraat. Figuur 1A biedt een experimenteel schema voor de HAT-test. Anacardzuur, een bekende HATi3,38, werd gebruikt in deze test in een concentratiebereik van 12,5-100 μM. Bij 100 μM, anacardzuur downreguleert p300 gekatalyseerd histon acetylatie op Histone 3, Lysines 9 en 1...

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Deze protocollen zijn belangrijk omdat ze gedetailleerde stappen bieden voor validatie van de potentie en selectiviteit van nieuwe HAT-remmers, die belangrijke onderzoeksinstrumenten en potentiële therapieën zijn. De technieken die in deze video worden aangetoond zijn gemakkelijk uit te voeren en geven informatie over de effecten van HAT-remmers op wereldwijde en regionale histonacetylatie. Ze maken het mogelijk om epigenetische regulatie van genexpressie te begrijpen.Aandacht voor de details is van cruciaal belang. Het is belangrijk om de protocollen stap voor stap te volgen. Begin met het voorbereiden van de enzymatische reactie in een 10 microliter volume in een 0,2 milliliter PCR buis volgens manuscript aanwijzingen.Vervolgens incubeer het volledige reactiemengsel bij 30 graden Celsius gedurende een uur in een PCR thermische cycler. Voeg ondertussen twee mercaptoethanol toe met een verhouding van één tot 10 aan de 6X SDS-monsterbuffer. Verwijder monsters uit de PCR thermische cycler en voeg twee microliters van de voorbereide SDS monster buffer aan elke reactie mix.Verwarm de monsters vijf minuten lang op 95 graden Celsius op een hitteblok en koel ze af op ijs. Bewaar de monsters op min 20 of min 80 graden Celsius of ga verder met gelelektroforese en immunoblotting. Zaad 100,000 MCF-7 cellen in een milliliter van celcultuur medium in elke put van een 12-well plaat en laat de cellen groeien tot 80 tot 90%samenvloeiing.Wanneer de cellen de gewenste samenvloeiing bereiken, het medium celkweek uit putten vier, vijf en zes, en pipet een milliliter van drie micromolar MS275 in medium in elke put. Dan aspirate de cel cultuur medium uit putten een, twee, en drie, en pipet een milliliter verdunde DMSO in elke put. Breng de cellen vier uur terug naar de couveuse om ophoping van geacetyleerde histonen mogelijk te maken in cellen die zijn blootgesteld aan MS275.Terwijl de cellen uitbroeden, bereiden verdunningen van A-485 in DMSO volgens manuscript richtingen. Wanneer de incubatie is voltooid, aspirate het medium uit de putten en voeg de verdunningen. Breng de cellen terug naar de couveuse en kweek ze gedurende 20 uur, vervolgens het celcultuurmedium uit de putten aan te halen en was de cellen met een milliliter PBS.Aspirate de PBS en voeg 100 microliters van passieve lyse buffer. Bewaar de plaat op min 80 graden Celsius 's nachts. Pipette 100 microliter van geson soniceerde chromatine uit cellen behandeld met DMSO in twee 1,5 milliliter buizen, dan pipette 400 microliters van ChIP verdunning buffer aan elke buis om het totale volume te brengen tot 500 microliter.Verwijder vijf microliter van de oplossing uit een van de buizen en bewaar deze bij min 20 graden Celsius als DMSO-ingang. Bereid twee buizen met gesonische chromatine uit cellen behandeld met A-485 op dezelfde manier. Gebruik een pipet om de IgG en H3K27 acetyl antistoffen toe te voegen aan de DMSO en A-485 monsters.Voeg vervolgens 20 microliter eiwit Een magnetische kralen aan elke buis, ervoor te zorgen dat de kralen goed zijn opgesuspend. Draai de monsters 's nachts op vier graden Celsius. Pellet het eiwit Een magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de supernatant zonder verstoring van de kralen.Was de kralen met 500 microliter tot een milliliter lage zoutwasbuffer en draai ze vijf minuten op vier graden Celsius. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met een magnetische afscheider en verwijder de supernatant. Herhaal de wasprocedure met een hoge zoutwasbuffer, een wasbuffer voor lithiumchloride en een TE-buffer.Na de was met TE-buffer, verwijder de input monsters uit de vriezer en zet ze op ijs. Ontdooi een aliquot van proteinase K, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de TE-buffer uit de kralen. Voeg 100 microliters chip elution buffer en een microliter van proteinase K aan elk monster met inbegrip van de input monsters en incubeer ze met schudden op 62 graden Celsius gedurende twee uur met behulp van een thermocycler.Verwarm na de incubatie de monsters gedurende 10 minuten tot 95 graden Celsius en koel ze af tot kamertemperatuur. Pellet de magnetische kralen met een magnetische afscheider en breng het DNA-bevattende supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Zuiver het DNA met behulp van een standaard PCR cleanup kit en voer qPCR uit.De in vitro histon acetyltransferase test werd gebruikt om het effect van anacardzuur op p300 HAT activiteit te onderzoeken naar een histon substraat. Een concentratiebereik werd getest en acetyl-CoA werd niet toegevoegd aan de negatieve controlereactie. De immunoblot resultaten werden gekwantificeerd met ImageJ, waaruit een duidelijke vermindering van acetyl H3K18 en acetyl H3K9 op 100 micromolar anacardic zuur in vergelijking met de DMSO controle.In de chromatine hyper-acetylatie remmingstest, behandeling van MCF-7 cellen met HDACi MS275 sterk upregulated acetylation van histone 3 op verschillende lysine residuen. De basale niveaus van acetyl H3K18 en acetyl H3K27 waren laag, waaruit de voordelen van het toevoegen van een HDACi in de ChHAI test. De toevoeging van A-485 in cellen die zijn voorbehandeld met MS275 verzwakt de verhoogde histonacetylatie bij H3K18 en H3K27, maar niet H3K9.De immunoblot resultaten werden ook gekwantificeerd met ImageJ. ChIP qPCR werd gebruikt om de effecten van HAT-remmers te onderzoeken op genregulerende elementen die de oncogene expressie controleren. In het DMSO-monster produceerde het DNA dat door het IgG-bestrijdingsantilichaam werd neergeslagen een hogere Ct-waarde dan het acetyl H3K27-antilichaam in de qPCR-reactie voor de cyclische D1-promotor, wat aangeeft dat de niet-specifieke IgG-controle minder DNA-histoncomplexen neerpelde dan het acetyl H3K27-specifieke antilichaam bij de promotor.Vergeleken met de DMSO controle, A-485 verminderde acetyl H3K27 verrijking bij de cyclische D1 promotor. Belangrijk is dat A-485 is bekend dat aanzienlijk te verminderen acetyl H3K27 in celcultuur. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat de pre-incubatiestappen van de in vitro HAT en ChHAI-tests essentieel zijn en niet mogen worden vergeten.Het is ook belangrijk om te onthouden om de input monsters op te slaan en om verlies van de kralen tijdens ChIP te voorkomen. Na het uitvoeren van deze procedures is ChIP-seq een aanvullende methode die kan worden uitgevoerd om wereldwijde informatie over histonacetylatie te verkrijgen bij regulerende elementen voor het hele genoom. Deze protocollen zijn nuttig voor wetenschappers om nieuwe HAT-remmers zorgvuldig te valideren en te voorkomen dat er chemische sondes van lage kwaliteit in de literatuur worden gepubliceerd.De gevalideerde HAT-remmers kunnen zich verder ontwikkelen als potentiële therapieën.

assays-for-validating-histone-acetyltransferase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Dit protocol beschrijft de vereiste stappen om in vitro en in vivo deacetyleringsassays uit te voeren om de rol van eiwitten als specifieke deacetyleringssubstraten voor sirtuïnen vast te stellen en verder de rol van omkeerbare - lysine acetylering als een post-translationele modificatie te bestuderen.

Deacetylering Testen om de wisselwerking tussen Sirtuins (SIRT2) en specifiek eiwit-substraten Ontrafel

De huidige methode dient ter identificatie van isovorm-specifieke remmers van Histon deacetylases (HDAC) in HeLa cellen door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. Dit is een antilichaam-vrije methode ontwikkeld om te reflecteren van HDAC1 en HDAC6 activiteit in de levende cel omgeving, in tegenstelling tot één-isovorm cel-gratis testen.

Gelijktijdige meting van HDAC1 en HDAC6 activiteit in HeLa cellen met behulp van UHPLC-MS

Het doel van dit artikel is om een uitgebreide, systematische handleiding voor de efficiënte reiniging van histones H3 en H4 en de kwantificering van residuen geacetyleerd Histon.

Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

Klasse 1 histone deacetylases (HDACs), zoals RpdA hebben opgedaan belang als potentiële doelstellingen voor de behandeling van schimmelinfecties. Hier presenteren we een protocol voor de specifieke verrijking van TAP-Tagged RpdA gecombineerd met een HDAC activiteit assay die het mogelijk maakt in vitro effectiviteit testen van histone deacetylase remmers.

Enkele stap verrijking van een TAP-Tagged histone deacetylase van de gloeiende schimmel Aspergillus nidulans voor enzymatische activiteit assay

Snelle en nauwkeurige chemische tests om te screenen op specifieke remmers zijn een belangrijk hulpmiddel in het arsenaal aan geneesmiddelenontwikkeling. Hier presenteren we een schaalbare acetyl-klikchemietest om de remming van HAT1-acetyleringsactiviteit te meten.

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Hier presenteren we de preklinische screening van antikanker coumarinen met behulp van 3D-cultuur en zebravissen.

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Leer hoe je HAT-remmers valideert met HAT-assays, immunoblotting en ChIP-qPCR voor epigenetisch kankeronderzoek. Deze methoden geven inzicht in globale en regionale histonacetylering.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Meer video's verkennen