Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Deze protocollen zijn belangrijk omdat ze gedetailleerde stappen bieden voor validatie van de potentie en selectiviteit van nieuwe HAT-remmers, die belangrijke onderzoeksinstrumenten en potentiële therapieën zijn. De technieken die in deze video worden aangetoond zijn gemakkelijk uit te voeren en geven informatie over de effecten van HAT-remmers op wereldwijde en regionale histonacetylatie. Ze maken het mogelijk om epigenetische regulatie van genexpressie te begrijpen.

Aandacht voor de details is van cruciaal belang. Het is belangrijk om de protocollen stap voor stap te volgen. Begin met het voorbereiden van de enzymatische reactie in een 10 microliter volume in een 0,2 milliliter PCR buis volgens manuscript aanwijzingen.

Vervolgens incubeer het volledige reactiemengsel bij 30 graden Celsius gedurende een uur in een PCR thermische cycler. Voeg ondertussen twee mercaptoethanol toe met een verhouding van één tot 10 aan de 6X SDS-monsterbuffer. Verwijder monsters uit de PCR thermische cycler en voeg twee microliters van de voorbereide SDS monster buffer aan elke reactie mix.

Verwarm de monsters vijf minuten lang op 95 graden Celsius op een hitteblok en koel ze af op ijs. Bewaar de monsters op min 20 of min 80 graden Celsius of ga verder met gelelektroforese en immunoblotting. Zaad 100,000 MCF-7 cellen in een milliliter van celcultuur medium in elke put van een 12-well plaat en laat de cellen groeien tot 80 tot 90%samenvloeiing.

Wanneer de cellen de gewenste samenvloeiing bereiken, het medium celkweek uit putten vier, vijf en zes, en pipet een milliliter van drie micromolar MS275 in medium in elke put. Dan aspirate de cel cultuur medium uit putten een, twee, en drie, en pipet een milliliter verdunde DMSO in elke put. Breng de cellen vier uur terug naar de couveuse om ophoping van geacetyleerde histonen mogelijk te maken in cellen die zijn blootgesteld aan MS275.

Terwijl de cellen uitbroeden, bereiden verdunningen van A-485 in DMSO volgens manuscript richtingen. Wanneer de incubatie is voltooid, aspirate het medium uit de putten en voeg de verdunningen. Breng de cellen terug naar de couveuse en kweek ze gedurende 20 uur, vervolgens het celcultuurmedium uit de putten aan te halen en was de cellen met een milliliter PBS.

Aspirate de PBS en voeg 100 microliters van passieve lyse buffer. Bewaar de plaat op min 80 graden Celsius 's nachts. Pipette 100 microliter van geson soniceerde chromatine uit cellen behandeld met DMSO in twee 1,5 milliliter buizen, dan pipette 400 microliters van ChIP verdunning buffer aan elke buis om het totale volume te brengen tot 500 microliter.

Verwijder vijf microliter van de oplossing uit een van de buizen en bewaar deze bij min 20 graden Celsius als DMSO-ingang. Bereid twee buizen met gesonische chromatine uit cellen behandeld met A-485 op dezelfde manier. Gebruik een pipet om de IgG en H3K27 acetyl antistoffen toe te voegen aan de DMSO en A-485 monsters.

Voeg vervolgens 20 microliter eiwit Een magnetische kralen aan elke buis, ervoor te zorgen dat de kralen goed zijn opgesuspend. Draai de monsters 's nachts op vier graden Celsius. Pellet het eiwit Een magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de supernatant zonder verstoring van de kralen.

Was de kralen met 500 microliter tot een milliliter lage zoutwasbuffer en draai ze vijf minuten op vier graden Celsius. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met een magnetische afscheider en verwijder de supernatant. Herhaal de wasprocedure met een hoge zoutwasbuffer, een wasbuffer voor lithiumchloride en een TE-buffer.

Na de was met TE-buffer, verwijder de input monsters uit de vriezer en zet ze op ijs. Ontdooi een aliquot van proteinase K, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de TE-buffer uit de kralen. Voeg 100 microliters chip elution buffer en een microliter van proteinase K aan elk monster met inbegrip van de input monsters en incubeer ze met schudden op 62 graden Celsius gedurende twee uur met behulp van een thermocycler.

Verwarm na de incubatie de monsters gedurende 10 minuten tot 95 graden Celsius en koel ze af tot kamertemperatuur. Pellet de magnetische kralen met een magnetische afscheider en breng het DNA-bevattende supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Zuiver het DNA met behulp van een standaard PCR cleanup kit en voer qPCR uit.

De in vitro histon acetyltransferase test werd gebruikt om het effect van anacardzuur op p300 HAT activiteit te onderzoeken naar een histon substraat. Een concentratiebereik werd getest en acetyl-CoA werd niet toegevoegd aan de negatieve controlereactie. De immunoblot resultaten werden gekwantificeerd met ImageJ, waaruit een duidelijke vermindering van acetyl H3K18 en acetyl H3K9 op 100 micromolar anacardic zuur in vergelijking met de DMSO controle.

In de chromatine hyper-acetylatie remmingstest, behandeling van MCF-7 cellen met HDACi MS275 sterk upregulated acetylation van histone 3 op verschillende lysine residuen. De basale niveaus van acetyl H3K18 en acetyl H3K27 waren laag, waaruit de voordelen van het toevoegen van een HDACi in de ChHAI test. De toevoeging van A-485 in cellen die zijn voorbehandeld met MS275 verzwakt de verhoogde histonacetylatie bij H3K18 en H3K27, maar niet H3K9.

De immunoblot resultaten werden ook gekwantificeerd met ImageJ. ChIP qPCR werd gebruikt om de effecten van HAT-remmers te onderzoeken op genregulerende elementen die de oncogene expressie controleren. In het DMSO-monster produceerde het DNA dat door het IgG-bestrijdingsantilichaam werd neergeslagen een hogere Ct-waarde dan het acetyl H3K27-antilichaam in de qPCR-reactie voor de cyclische D1-promotor, wat aangeeft dat de niet-specifieke IgG-controle minder DNA-histoncomplexen neerpelde dan het acetyl H3K27-specifieke antilichaam bij de promotor.

Vergeleken met de DMSO controle, A-485 verminderde acetyl H3K27 verrijking bij de cyclische D1 promotor. Belangrijk is dat A-485 is bekend dat aanzienlijk te verminderen acetyl H3K27 in celcultuur. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat de pre-incubatiestappen van de in vitro HAT en ChHAI-tests essentieel zijn en niet mogen worden vergeten.

Het is ook belangrijk om te onthouden om de input monsters op te slaan en om verlies van de kralen tijdens ChIP te voorkomen. Na het uitvoeren van deze procedures is ChIP-seq een aanvullende methode die kan worden uitgevoerd om wereldwijde informatie over histonacetylatie te verkrijgen bij regulerende elementen voor het hele genoom. Deze protocollen zijn nuttig voor wetenschappers om nieuwe HAT-remmers zorgvuldig te valideren en te voorkomen dat er chemische sondes van lage kwaliteit in de literatuur worden gepubliceerd.

De gevalideerde HAT-remmers kunnen zich verder ontwikkelen als potentiële therapieën.