Name: Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van celviabiliteit onafhankelijk van mitochondriale functie. Deze methode maakt snelle high-throughput screening van geneesmiddelen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NVK, een CPRIT geleerde in Cancer Research, dankt het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) voor hun genereuze steun, CPRIT subsidie RR150044. Dit werk werd ook ondersteund door de Welch Foundation Research Grant C-1930, en door de National Institutes of Health R35 GM129294 toegekend aan NVK. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

1. Cytotoxiciteitstest: Setup
<ol><li>Bereid oplossingen voor van verbindingen van belang bij gewenste concentraties in de juiste media (serumvrij of 1, 2,5 of 5% FBS RPMI-1640).<ol>
<li>Om cytotoxiciteit van een enkele verbinding te meten (bijvoorbeeld om effectieve doses te bepalen), bereid verbindingen voor bij 2x eindconcentratie.</li>
		<li>Om cytotoxiciteit van samengestelde combinaties te meten, bereid verbindingen voor bij 4x uiteindelijke concentratie.</li>
		<li>Bereid alleen-oplosmiddelbesturingselementen voor door dezelfde hoeveelheid oplosmiddel met het juiste medium te mengen. Als bijvoorbeeld testverbindingen opgelost zijn in DMSO en methanol, moet oplosmiddel-only controle voor elk oplosmiddel worden uitgevoerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamel cellen uit kweekschotel of kolf in een 15 mL conische buis.</li>
	<li>Breng 10 μL celsuspensie over in een microcentrifugebuis en vlek met 10 μL 0,4% trypanblauw. Gebruik een hemocytometer om levensvatbare en niet-levensvatbare cellen te tellen voor elke celbron.</li>
	<li>Pelletcellen op 200 g gedurende 5 minuten. Aanzuigen of decanteren supernatant.</li>
	<li>Resuspend cell pellet in test-geschikte media (serum-vrij of 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) bij een celdichtheid van 3 * 105 cellen / mL. OPMERKING 1: De celdichtheid van 3*105 cellen/mL biedt een zaaidichtheid van 15.000 cellen/put. Zaaidichtheid is een belangrijke parameter en idealiter moet vooraf worden gedefinieerd voorafgaand aan het experiment. Zaaidichtheid moet rekening houden met 1) celgrootte – meestal grotere cellen worden gezaaid op een lagere dichtheid; 2) behandeling duur – cellen zijn meestal gezaaid op een lagere dichtheid voor experimenten die langer zal duren; en 3) celdeling tarief – cellen met een hoger percentage van de verdeling worden gezaaid op een lagere dichtheid. Specifieke voorbeelden van geoptimaliseerde zaaien dichtheden: K562 cellen, groter, 24 uur duur – 10.000 cellen / goed; MOLM-13 cellen, matige grootte, 24 uur behandeling – 15.000/well; MOLM-13 cellen, 48 uur behandeling – 8.000/well; kleine gezonde perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's), 24 uur behandeling – 50.000/well; primaire AML cellen, 24 uur behandeling – 15.000-20.000/well. OPMERKING 2: De aanwezigheid van FBS in de media kan de activiteit van de verbindingen beïnvloeden. Het verminderen van de concentratie van FBS kan testresultaten eenvoudiger te interpreteren maken, maar het vermindert ook de fysiologische nauwkeurigheid.</li>
	<li>Zaad 50 μL celsuspensie van stap 1.5 in elke put van een 96-put plaat met behulp van een meerkanaals pipet.</li>
	<li>Voeg verbindingen als volgt toe:<ol>
<li>Voeg voor enkele samengestelde tests 50 μL 2x samengestelde oplossing toe in elke put. Voeg voor oplosmiddelbeheersingsputten 50 μL testmedia toe die het oplosmiddel bij de 2x-concentratie bevatten.</li>
		<li>Voor combinatietesten voegt u 25 μL van elk van de verbinding (4x-oplossingen) toe aan elke put. Voeg voor enkele samengestelde putten 25 μL 4L samengestelde oplossing en 25 μL testmedium toe. Voeg voor oplosmiddelbeheersingsputten 50 μL testmedium of testmedium toe dat het oplosmiddel bevat. OPMERKING 1: De uiteindelijke concentratie van DMSO mag niet meer dan 0,5% bedragen. OPMERKING 2: Het wordt aanbevolen om de media met de verbindingen toe te voegen met de pipet die de wand van elke put aanraakt vanwege een laag volume.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tik voorzichtig op de plaat om de inhoud van de putten te mengen.</li>
	<li>Incubeerplaten bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-atmosfeer gedurende een passende tijd, bijvoorbeeld 24 uur.</li>
</ol>2. Cytotoxiciteitstest: vlekken met Hoechst 33342 en propidium Iodide
<ol><li>Bereid 10x kleuring oplossing. Deze oplossing moet worden bereid vers voor elk experiment, kan het niet worden opgeslagen. De uiteindelijke kleurstofconcentraties moeten voorafgaand aan het experiment worden bepaald.<ol>
<li>Voor leukemiecellijnen en primaire leukemiecellen bevat 1 mL 10x kleuringsbuffer 10 μL van 20 mM Hoechst 33342 en 50 μL van 1 mg/mL propidium jodide in steriele PBS (eindconcentraties: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).</li>
		<li>Voor gezonde PBMCs bevat 1 mL 10x kleuringsbuffer 10 μL van 20 mM Hoechst 33342 en 10 μL van 1 mg/mL propidium iodide in steriele PBS (eindconcentraties: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL). OPMERKING: De uiteindelijke concentratie propidiumjodide moet voorafgaand aan de experimenten worden bepaald. Cellen moeten worden getest met behulp van een reeks PI-concentraties (1, 2,5, 5 μg/mL) en vervolgens moet de levensvatbaarheid met Hoechst/PI worden vergeleken met de levensvatbaarheid die via trypanblauw wordt gemeten. De pi concentraties hierboven werden gekozen op basis van doelcel levensvatbaarheid in media-control putten (boven ~ 90% voor leukemie cellijnen, boven ~ 70% voor gezonde PBMCs). LET OP: Hoechst 33342 en propidium jodide zijn potentiële kankerverwekkende stoffen. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren ervan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik na incubatie een multichannel pipet om 10 μL 10x kleuringsbuffer aan elke put toe te voegen. OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de pipettetips de media niet raken.</li>
	<li>Tik voorzichtig op de plaat om te mengen en te wissen bubbels. Vlek bij 37 °C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Centrifugeren de plaat op 200 g gedurende 4 min om alle cellen naar de bodem van de plaat te brengen. Veeg voorzichtig de onderkant van de plaat met een vochtige kimwipe om vezels en / of vuil dat zal interfereren met de beeldvorming te verwijderen. OPMERKING 1: Centrifugatie van de plaat zorgt ervoor dat alle cellen in het beeld worden vastgelegd. Vaak dode cellen zal losmaken en zweven, het verstrekken van misleidende waarden van cytotoxiciteit. Centrifugatie vermindert dit effect. OPMERKING 2: De plaat moet zo snel mogelijk na centrifugatie worden afgebeeld, idealiter binnen 15 min. Centrifugatie kan de selectiviteit van PI-kleuring verminderen en cellen in staat stellen om langzaam propidiumjodide op te bouwen. De verbetering van de nauwkeurigheid opgedaan door het visualiseren van de dode cellen opweegt tegen de lichte toename van PI kleuring. Het wordt aanbevolen om de beeldvorming binnen 1 uur van centrifugatie af te ronden.</li>
</ol>3. Cytotoxiciteitstest: gegevensverwerving
<ol><li>Stel de software voor de geautomatiseerde microscoop/plaatbeeldbeistel in om fluorescentie te detecteren voor zowel Hoechst 33342 (excitatie maximaal 350 nm, emissie maximaal 461 nm) als PI (excitatie maximum 493 nm, emissie maximaal 636 nm). Het verwerven van beelden voor elke put in beide kanalen.</li>
	<li>Met behulp van de software (zoals CellProfiler, een gratis beeldanalyse studio op basis van MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ, of propriëtaire software zoals Gen5) tellen de cellen in elk goed in elk kanaal. OPMERKING: Aangezien elke cel moet worden gekleurd met Hoechst 33342, en dode cellen moeten worden gekleurd met PI, de verhouding van dood tot alle vertegenwoordigt de fractie van de cellen die dood zijn. Als het geautomatiseerde aantal in onbehandeld monster bijvoorbeeld 467 cellen toont met PI (dode cellen) en 2335 cellen met Hoechst 33342 (totale cellen), is de breuk 0,2 of 20%. Deze waarde wordt vervolgens vergeleken met een identiek behandeld monster waar de behandeling werd gebruikt.</li>
	<li>Gedetailleerde beschrijving van Hoechst/PI-gegevensverwerving met Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader en Gen5 v. 3.00-software:<ol>
<li>Stel de Cytation5 multimode plaatlezer/imager in op beeldcellen in platte bodem, 96-well, generieke zwarte plastic platen.</li>
		<li>Stel een beeldvormingsprotocol in om de standaard DAPI- en Texas Red-filtersets te gebruiken. Maak foto's in het putcentrum met behulp van een 4x vergrotingsdoelstelling. Gebruik geen offset (X/Y of Z). Gebruik de volgende beeldinstellingen: DAPI – LED - 10, integratietijd - 99, gain - 0; Texas Red - LED - 8, integratietijd - 950, gain - 18. Autofocus uitvoeren met het DAPI-signaal; er mag geen compensatie worden gemaakt bij het scherpstellen tussen kanalen.</li>
		<li>Beeldanalyse uitvoeren met Gen5-software v 3.00. Definieer cellen in de software-instellingen als vormen tussen 5 en 25 μm in hun grootte. Sluit primaire randobjecten uit en splits aanraakobjecten door de speciale optie 'Objecten splitsen' in te schakelen.  Verwerk vervolgens de afbeelding om de achtergrond te verwijderen (donkere achtergrondaftrekken), pas een kernmasker toe (drempelwaarde DAPI >= 6000 AU) en tel objecten. Voer een subpopulatieanalyse uit op basis van PI-kleuring (drempelwaarde Texas Red >= 5000 AU) en tel objecten. De levensvatbaarheid van de cel wordt gedefinieerd als (1 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61295/61295eq1.jpg"> .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+assessment%3A+toward+content-rich+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li>
<li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Functional+Characteristic+of+Senescent+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells.</a> Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).</li>
<li>Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Castro-Vega, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescent+microenvironment+promotes+the+emergence+of+heterogeneous+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells.</a> Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).</li>
<li>Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid+tumors+by+a+single+multinucleated+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell.</a> Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).</li>
<li>Osisami, M., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Metastatic+Tumor+Dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy.</a> Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cancer+stem-like+cells+through+the+formation+of+polyploid+giant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells.</a> Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Mittal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multinucleated+polyploidy+drives+resistance+to+Docetaxel+chemotherapy+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).</li>
<li>McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine-induced+apoptosis+and+hydrogen+peroxide-induced+necrosis+in+two+human+breast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines.</a> British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).</li>
<li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+lactate+dehydrogenase+release+assay+for+screening+of+drug+candidates+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).</li>
<li>Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+necrosis+by+release+of+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).</li>
<li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Counting+and+Viability+Assessment+of+2D+and+3D+Cell+Cultures%3A+Expected+Reliability+of+the+Trypan+Blue+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay.</a> Biological Procedures Online. 19, 8(2017).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+spectral+signatures+of+the+nucleic+acid+dye+acridine+orange+can+distinguish+cell+death+by+apoptosis+and+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis.</a> Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).</li>
<li>Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+stages+in+single+apoptotic+and+necrotic+cells+monitored+by+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy.</a> Scientific Reports. 4, 4698(2014).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+increased+sensitivity+of+acute+myeloid+leukemia+to+mitotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs.</a> Cell Death & Disease. 10 (8), 617(2019).</li>
<li>Caro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+signatures+uncover+distinct+targets+in+molecular+subsets+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma.</a> Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Senft, D., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+mitochondrial+dynamics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulators of mitochondrial dynamics in cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).</li>
<li>Vazquez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC1%CE%B1+expression+defines+a+subset+of+human+melanoma+tumors+with+increased+mitochondrial+capacity+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress.</a> Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).</li>
<li>Caino, M. C., Altieri, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+exploit+adaptive+mitochondrial+dynamics+to+increase+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion.</a> Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).</li>
<li>Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+of+cancer+revisited%3A+%22mitochondrial+malignancy%22+and+ROS-induced+oncogenic+transformation+-+why+mitochondria+are+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).</li>
<li>Kreitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Plasticity+of+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Sriskanthadevan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+cells+have+low+spare+reserve+capacity+in+their+respiratory+chain+that+renders+them+susceptible+to+oxidative+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress.</a> Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).</li>
<li>Guerra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction%3A+A+Novel+Potential+Driver+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer.</a> Frontiers in Oncology. 7, 295(2017).</li>
<li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).</li>
<li>Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mitocans%2C+anti-cancer+drugs+acting+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria.</a> Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).</li>
<li>Ubah, O. C., Wallace, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy%3A+Targeting+mitochondria+and+other+sub-cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elimination+of+cancer+cells+by+deoxyglucose-ABT-263%2F737+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy.</a> PLoS One. 6 (9), 24102(2011).</li>
<li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anti-cancer+drugs%2C+mitocans%2C+to+enhance+the+immune+responses+against+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).</li>
<li>Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Synergistic+Potential+of+Mitochondria-Targeting+Drugs+for+Leukemia+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 435(2020).</li>
<li>Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults%3A+recommendations+from+an+international+expert+panel%2C+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465(2017).</li>
<li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis%3A+Implications+in+Tumor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li>
<li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+effects+of+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+on+the+differentiation+potential+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells.</a> Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).</li>
<li>Tunçer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+dimethyl+sulfoxide+driven+gross+molecular+changes+have+the+potential+to+interfere+with+various+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14828(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel het protocol voor Hoechst/PI cytotoxiciteitstest robuust is en relatief weinig hands-on tijd vereist, zijn er verschillende experimentele details die erg belangrijk zijn om nauwkeurige resultaten te garanderen. Ten eerste is het essentieel om ervoor te zorgen dat de concentratie van DMSO onder 0,5% (v/v) blijft. Over het algemeen is men het erover eens dat blootstelling aan zelfs lage doses DMSO de morfologie en gehechtheid van cellen aanzienlijk kan veranderen en de progressie van de celcyclus aanzienlijk kan ver...

De eerste stap naar het identificeren van effectieve behandelingen van kanker is de selectie van een robuuste, onpartijdige cytotoxiciteitstest die kan worden gebruikt om het effect van de behandeling te onderzoeken. Een gemeenschappelijke keuze voor low-throughput experimenten is de uitsluiting van trypan blauwe kleurstof uit levende cellen. Deze methode is favoriet omdat het een relatief onbevooroordeelde methode voor het kwantificeren van celoverleving mogelijk maakt. trypan blauw verspreidt zich passief in cellen waarvan de membranen zijn aangetast, maar het is effectief geblokkeerd van het invoeren van gezonde cellen1. Het quotiënt van de levende cellen en de totale cellen vertegenwoordigt het percentage levensvatbaarheid, wat de werkzaamheid van de behandeling aangeeft. Het belangrijkste nadeel van de trypan blauwe test is dat het slecht geschikt is voor high-throughput methodologieën. Het heeft een relatief lage signaal-ruisverhouding en langdurige vlekken kunnen resulteren in artefacten als gevolg van de kleuring van levensvatbare cellen. Bijgevolg, trypan blauwe uitsluiting is meestal, maar niet altijd2, gedegradeerd tot handmatig tellen. Dit maakt het te traag en introduceert de sterke mogelijkheid van bias als gevolg van subjectief oordeel van de onderzoeker (tenzij verblindende of onafhankelijke tellingen worden gebruikt, die verder verminderen laboratoriumdoorvoer). In het algemeen is de doorvoer van deze test onvoldoende voor moderne drugsontdekking.
De levensvatbaarheidstesten, die over het algemeen een veel hogere doorvoer hebben, stellen onderzoekers in staat om deze beperking te omzeilen, maar komen met aanzienlijke kanttekeningen (zie tabel 1). Deze methoden vallen over het algemeen in twee groepen. Een groep bestaat uit colorimetrische tests die gebaseerd zijn op de functie van cellulaire redox enzymen. Kleurloze of niet-fluorescerende substraten worden omgezet in levendige producten die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer. Klassieke voorbeelden zijn tetrazoliumzouten (MTT, WST-1, XTT, enz.) en resazurin. Deze categorie omvat ook luminescente testen die luciferin gebruiken om ATP-niveau te evalueren. Tests van dit type hebben de onderliggende beperking dat ze cellulaire metabolisme meten, dat is niet cellulair levensvatbaarheid per se. Het is heel gebruikelijk dat cellen rustig worden onder ongunstige omstandigheden, maar toch de mogelijkheid behoudenom3,4,5te verdelen . Kankercellen zijn bijvoorbeeld vaak relatief metabolisch rustige6,7,8,9, en zijn waarschijnlijk moeilijk te testen met behulp van deze technieken. Effectiviteit van behandelingen die mitochondriale functie beschadigen, zoals de meeste mitocanen, is ook waarschijnlijk aanzienlijk worden overschat.
Een alternatieve methodologie maakt gebruik van de chemische eigenschappen van verschillende stoffen die hen in staat stellen om biologische membranen al dan niet kruisen. Een voorbeeld zijn nucleaire vlekken zoals SYTOX of propidium jodide (PI). Deze categorie omvat ook tests die qua concept vergelijkbaar zijn, maar verschillend van functie zijn, zoals de lactaatdehydrogenase (LDH), die het vrijkomen van LDH in de extracellulaire milieumaatregelen meet als een indicator van cellulaire necrose(figuur 1, tabel 1). Deze testen zijn beter in staat om onderscheid te maken tussen metabolisch inactieve en dode cellen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Test/kleurstof</td>
			<td>Type(s) van de ontdekte celdood</td>
			<td>Noodzakelijke apparatuur</td>
			<td>Belangrijkste kenmerken</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin)</td>
			<td>Apoptose/Necrose</td>
			<td>Spectrofotometer</td>
			<td>Goedkoop, snel; eindpunttest; afhankelijk van de activiteit van enzymen (uitsluitend mitochondriaal in geval van MTT) en maakt geen onderscheid tussen de wijzen van celdood1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDH-release</td>
			<td>Necrose</td>
			<td>Spectrofotometer</td>
			<td>Snel, onafhankelijk van de activiteit van mitochondriale enzymen; duur voor tests met een hoge doorvoer; detecteert necrotische cellen met gecompromiseerd plasmamembraan11,12
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypan Blauw (TB)</td>
			<td>Apoptose/Necrose</td>
			<td>Microscoop</td>
			<td>Cel-ondoordringbaar; maakt geen onderscheid tussen vormen van celdood; moeizaam en niet geschikt voor screening met hoge doorvoer; moeilijker te gebruiken met aanhangende cellen; gevoelig voor subjectief oordeel van de gebruiker, maar wordt beschouwd als de standaard cel levensvatbaarheid meting methode13
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Acridine oranje (AO)</td>
			<td>Apoptose/Necrose/</td>
			<td rowspan="2">Fluorescentiemicroscoop</td>
			<td rowspan="2">Een nucleïnezuurkleurstof met unieke spectrale eigenschappen, kan onderscheid maken tussen apoptose en necrose/necroptose14
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Necroptosis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342, DAPI</td>
			<td>Apoptosis</td>
			<td>Fluorescentie microscoop of flow cytometer</td>
			<td>Cel-doorlaatbaar; ongepast op zijn eigen om celdood te controleren; nuttig voor co-kleuring; kan worden gebruikt om chromatinecondensatie en kernfragmentatie in vroege apoptose te beoordelen; kan worden gecombineerd met propidiumjodide om apoptose te onderscheiden van necrose15,16
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Late apoptose/Necrose</td>
			<td>Fluorescentie microscoop of flow cytometer</td>
			<td>Cel-ondoordringbaar intercalator; detecteert zowel late apoptose als necrosemodi van celdood17. Giftig en doorlaatbaar na lange incubatietijden18
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Lijst van cytotoxiciteitstesten. Cytotoxiciteit testen, waarvan sommige werden gebruikt in deze studie, vermeld samen met de korte beschrijving van hun belangrijkste kenmerken.
Recente studies hebben aangetoond dat het mitochondriale metabolisme bij sommige vormen van kanker19, 20,21,22,23,24,25wordt gewijzigd . Bijvoorbeeld, acute myeloïde leukemie (AML) is aangetoond dat hun mitochondriale massa, mtDNA-gehalte en mitochondriale ademhaling te upreguleren om te voldoen aan hun energiebehoeften19,26,27. Aan de andere kant worden sommige vaste tumoren gekenmerkt door mitochondriale disfunctie, of liever "metabole herprogrammering", zoals downregulatie van mitochondriale eiwitten die betrokken zijn bij OXPHOS of verminderde mtDNA-inhoud, die is geassocieerd met tumor invasieve, gemetastaseerde potentieel en resistentie tegen apoptose-inducerende geneesmiddelen28,29. Bovendien, onlangs, is er een verhoogde interesse in het gebruik van mechanistisch diverse verbindingen die mitochondriale functie beïnvloeden (over het algemeen mitocans30genoemd), als potentiële therapieën voor bepaalde vormen van kanker. Deze geneesmiddelen richten zich op ATP-synthese, mitochondriaal DNA, OXPHOS en ROS-productie, evenals pro-apoptotische en anti-apoptotische eiwitten geassocieerd met mitochondriën30,31. Verschillende studies hebben aangetoond dat deze aanpak een belangrijke belofteheeft 19,32,33,34. Echter, deze metabole afwijkingen in kankercelbiologie of mitochondriën-targeting behandelingen kunnen aanzienlijke invloed hebben op conventionele levensvatbaarheid tests die zijn gebaseerd op mitochondriale functionaliteit.
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol voor een differentiële nucleaire kleuringstest beschreven. Het protocol maakt een snelle en nauwkeurige bepaling van cytotoxiciteit van mitocans of hun combinaties met andere verbindingen. Hoechst 33342 is een cel-permeant nucleaire kleurstof die gemakkelijk celmembranen kruist om DNA te bevlekken, waardoor het totale aantal cellen kan worden verkregen. Door co-kleuring met PI, die alleen in de kernen van dode cellen, het aandeel van het leven (Hoechst alleen) en dode (gekleurd met beide) cellen nauwkeurig kan worden bepaald. Dit protocol verfijnt de gepubliceerde test35 door het toevoegen van een stap voor de optimalisatie van de kleurstof concentratie (door cross-referencing resultaten met orthogonale trypan blauwe methode) en centrifugatie van de plaat voorafgaand aan beeldvorming. Aangezien veel cellijnen semi-aanhangend of opgeschort zijn, verhoogt centrifugatie het aandeel cellen dat in beeld is en verbetert de nauwkeurigheid sterk. De test heeft verschillende voordelen, waaronder dat vlekken geen verwijdering van media of wassen vereisen. De kleurstof mengsel is ook goedkoop, gemakkelijk te bereiden, en compatibel met multichannel / robot pipetting systemen.
Nadat cellen zijn gekleurd, worden ze afgebeeld met een geautomatiseerde microscoop. Dit heeft het extra voordeel van het creëren van een permanente record van de beelden die later opnieuw kunnen worden geanalyseerd en de effecten van bepaalde verbindingen kunnen opnieuw worden geëvalueerd door visuele inspectie van vastgelegde beelden. Zodra afbeeldingen zijn verkregen, kunnen cellen handmatig worden geteld of met behulp van een van de verschillende softwarepakketten, waaronder zowel gratis (bijvoorbeeld ImageJ, CellProfiler, enz.) als commerciële software (bijvoorbeeld Metamorph, Gen5, enz.). Geautomatiseerde cel tellen is over het algemeen de voorkeur, omdat goed ontwikkeld geautomatiseerde cel tellen pijpleidingen zijn nauwkeuriger en minder bevooroordeeld dan handmatige telt. Ze negeren ook effectiever celpuin of onoplosbare complexen. De ontwikkeling van deze pijpleidingen is over het algemeen eenvoudig en wordt vereenvoudigd door de efficiëntie van de gebruikte vlekken. De uitvoer is kwantitatief omdat het werkelijke aantal dode cellen automatisch wordt berekend met betrekking tot het totale celaantal en verschillende drempelwaarden kunnen worden toegepast om de stringentie van detectie35te verhogen of te verlagen. Voor het gemak zijn geoptimaliseerde parameters voor het tellen van cellen met Gen5 v. 3.00-compatibele Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inbegrepen.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td><td>Chem-Impex</td><td>50-519-067</td><td></td></tr><tr><td>3-bromo-pyruvate</td><td>Alfa Aesar</td><td>1113-59-3</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Zwarte of doorzichtige 96-well platen met platte bodem </td></tr><tr><td>Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50101</td><td></td></tr><tr><td>Countess II geautomatiseerde celteller</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>20 mM oplossing; uiteindelijke concentratie 1:1.000 </td></tr><tr><td>HyClone foetaal runderserum</td><td>GE Healthcare</td><td>#25-514</td><td></td></tr><tr><td>m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>PBS-tabletten</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2944100</td><td>1 tablet + 200 mL steriel water = 1x PBS-oplossing </td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-Glutamine (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LDH-testkit</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-103-5952</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-596-072</td><td>Droge poeder; stock 1 mg/mL in PBS; uiteindelijke concentratie 5 &micro;g/mL (leukemiecellen), 1 &micro;g/mL (normale PBMC's) </td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Ark Pharm</td><td>AK115691</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium Met L-glutamine en natriumbicarbonaat, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celcultuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td><td>ACROS Organics</td><td>AC158990010</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauwe kleurstof (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>CML-cellijn </td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML-cellijn </td></tr><tr><td>MOLT-4</td><td>ATCC</td><td>CRL-1582</td><td>ALL-cellijn </td></tr><tr><td>OCI-AML2</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML-cellijn </td></tr></tbody></table>

een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van mitocan cytotoxicity

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

De bijdrage van mitochondriën aan oncogene transformatie is een onderwerp van brede belangstelling en actieve studie. Naarmate het gebied van kankermetabolisme complexer wordt, wordt het doel van het richten van mitochondriën met behulp van verschillende verbindingen die mitochondriale schade toebrengen (zogenaamde mitocans) steeds heel populair. Helaas vereisen veel bestaande cytotoxiciteitstesten, zoals die op basis van tetrazoliumzouten of resazurine functionele mitochondriale enzymen vereisen voor hun prestaties. De schade toegebracht door verbindingen die gericht mitochondriën vaak compromissen de nauwkeurigheid van deze tests. Hier beschrijven we een gewijzigd protocol op basis van differentiële kleuring met twee fluorescerende kleurstoffen, waarvan er een cel-permeant is (Hoechst 33342) en de andere niet (propidium jodide). Het verschil in kleuring maakt het mogelijk levende en dode cellen te worden gediscrimineerd. De test is vatbaar voor geautomatiseerde microscopie en beeldanalyse, die de doorvoer verhoogt en bias vermindert. Dit maakt het ook mogelijk de test te worden gebruikt in high-throughput mode met behulp van 96-well platen, waardoor het een haalbare optie voor drugs ontdekking inspanningen, met name wanneer de drugs in kwestie hebben een bepaald niveau van mitotoxiciteit. Belangrijk is dat de resultaten verkregen door Hoechst / PI kleuring test tonen een verhoogde consistentie, zowel met trypan blauwe uitsluiting resultaten en tussen biologische replica's wanneer de test wordt vergeleken met andere methoden.

Het bovengenoemde protocol is ontwikkeld met behulp van OCI-AML2 cellen, die werden genomen als een representatieve acute myeloïde leukemie cellijn. AML wordt gekenmerkt door abnormale proliferatie van ongedifferentieerde en niet-functionele hematopoietische cellen in het beenmerg26. Ondanks de recente ontwikkelingen in AML gerichte therapie, is de standaard van zorg onveranderd gebleven voor meerdere decennia, en bestaat uit inductietherapie (meestal bestaat uit drie dagen anthracycline, bijvoorb...

Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om cellulaire levensvatbaarheid onafhankelijk van mitochondriale functie te beoordelen. En het is vatbaar voor hoge doorvoer drug screening inspanningen. Deze techniek is snel, nauwkeurig, goedkoop, en maakt de bepaling van verbindingen cytotoxiciteit, met inbegrip van die afbreuk doen aan mitochondriale functie in de meeste soorten cellen.Dit protocol is eenvoudig uit te voeren. Het is belangrijk om aandacht te besteden aan het geneesmiddelvoorbereiding, behandelingsomstandigheden en celdichtheid om experimentele nauwkeurigheid en geldigheid te garanderen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat het verkrijgen van afbeeldingen en beeldanalyse stappen kan moeilijk zijn om te recapituleren, vooral voor onderzoekers met weinig ervaring met Gen5 Software.Begin met het voorbereiden van oplossingen van de verbindingen van belang bij de gewenste concentratie. Zorg er altijd voor om verbindingen te mengen door grondig te vortexen. Om cytotoxiciteit van een enkele verbinding te meten, bereid verbindingen voor bij 2X uiteindelijke concentratie.Als u cytotoxiciteit van samengestelde combinaties meet, bereid ze dan voor op een 4X uiteindelijke concentratie. Bereid alleen oplosmiddelcontroles voor door dezelfde hoeveelheid oplosmiddel met het juiste medium te mengen. Verzamel cellen in een 15 milliliter conische buis en aliquot 10 microliter van de cel suspensie.Voor trypan blauwe vlekken, voeg 10 microliter van 0,4%trypan blauw aan de aliquot en gebruik een hemocytometer of cel teller om levensvatbare en niet-levensvatbare cellen te tellen. Pelletcellen in de buis van 15 milliliter bij 200 keer G gedurende vijf minuten, dan aanzuigen of decamped de supernatant. We schorten de celpellet op in essay geschikte media bij een celdichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter.Gebruik een multi-channel pipet te zaad 50 microliter van cel suspensie in elke put van een 96 put plaat. Voor enkele samengestelde tests, voeg 50 microliter van 2x samengestelde oplossing in elke put. Voeg voor oplosmiddelbeheersingsputten 15 microliter testmedia toe die het oplosmiddel bij 2x-concentratie bevatten.Voor combinatie tests voeg 25 microliter van elk van de 4X verbindingen in elke put. Voor enkele samengestelde controle putten, voeg 25 microliters elk van 4X samengestelde oplossing en testmedium. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van DMSO niet meer dan 0,5% om de reproduceerbaarheid te garanderen, voeg drugs met de pipette tips raken van de zijkant van putten.Voorzichtig zijn om de drugs toe te voegen aan verschillende locaties. Deze steken moeten zeer snel worden uitgevoerd, bij voorkeur niet langer dan 30 minuten per plaat. Tik voorzichtig op de plaat om de inhoud van de putten te mengen en uit te broeden op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.Wanneer klaar om de cellen te bevlekken met Hoechst 33342 en propidium jodide bereiden verse 10X kleuring oplossing en voeg 10 microliters aan elke put. Tik voorzichtig op de plaat en broed het 15 minuten op 37 graden Celsius. Centrifugeren de plaat op 200 keer G gedurende vier minuten om alle cellen naar de bodem van de plaat te brengen.Veeg vervolgens voorzichtig de onderkant van de plaat af met een vochtig laboratoriumdoek om vuil te verwijderen dat de beeldvorming kan verstoren. Beeld de plaat binnen 15 minuten na centrifugatie. Open Gen5 Software en maak een nieuw standaardprotocol, klik op Procedure en kies het type platen dat moet worden gebruikt.Meestal, 96 goed zwarte plastic platen. Stel vervolgens de leesmethode in op afbeelding, klik op Ok en kies DAPI- en Texas Red Filter-sets met een 4X-vergrotingsdoelstelling. Er is geen offset nodig, omdat de putcentra in beeld worden gebeeldt.Stel voor het DAPI-filter LED in op 10, de integratietijd op 99 en verkrijg deze tot nul. Voor Texas Red, set LED op acht, integratie tijd tot 950, en winst op 18. Klik op Opties om ervoor te zorgen dat de automatische focus wordt uitgevoerd op het DAPI-kanaal en er geen verschuiving is in het scherpstellen tussen kanalen.Sla het protocol op door op Ok te klikken. Nu kunnen afbeeldingen worden opgenomen met de knop Nieuw lezen. Zodra afbeeldingen zijn opgenomen, klikt u op Gegevensreductie en kiest u Image Preprocessing.Pas Image Preprocessing toe met donkere achtergrondaftrekken met automatische afvlakkingsgrootte op basis van het DAPI-signaal. Gebruik voor Texas Red dezelfde opties als voor Kanaal 1. Klik op Oke.Ga vervolgens naar het cellulaire analysepaneel en pas een kernmasker toe op basis van het getransformeerde DAPI-signaal met een drempelwaarde van 6.000 eenheden, minimale objectgrootte van vijf micrometer en maximale objectgrootte van 25 micrometer. Analyseer de hele afbeelding, sluit primaire randobjecten op de rand van de afbeelding uit en splits aanraakobjecten. Stel in geavanceerde detectieopties de diameter van de rollende bal in op 30 micrometer en evalueer de achtergrond op basis van 5% van de laagste pixels.Houd alleen het aantal cellen in berekende statistieken. Daarna voert u een subpopulatieanalyse uit op basis van het gemiddelde getransformeerde Texas Red-signaal met een drempelwaarde van 5.000 eenheden om dode cellen te tellen. Tot slot, toegang tot de resulterende cel telt.Representatieve afbeeldingen van cellen bevlekt met Hoechst, propidium jodide worden hier getoond. Het totale aantal cellen is redelijk hoog en groter dan het aantal dode cellen. Wanneer een panel van cytotoxiciteitstesten werd vergeleken met trypan blauwe uitsluiting, bleek dat MTT en de Alamar blauwe test onnauwkeurig cellulaire levensvatbaarheid gemeten.Deze mitochondriale enzym-gebaseerde testen toonden aanzienlijk lagere levensvatbaarheid in vergelijking met trypan blauwe uitsluiting. Dubbele kleuring met Hoechst 33342 en PI had de beste combinatie van robuustheid, gevoeligheid en consistentie met trypan blauwe kleuring en de kleinste mediane afwijking van de trypan blauwe uitsluiting methode na CCP of 2-DG behandeling. De Hoechst PI essay was ook effectief bij het bepalen van cellulaire levensvatbaarheid na behandeling met de mitochondriën gericht moleculen Rotenone en drie bromopyruvate.Het werd verder gevalideerd met een paneel van leukemie cellijnen. Deze cellen varieerden in Rotenone gevoeligheid variërend van zeer gevoelig voor weerstand cellen. Onjuiste prestaties van de test kunnen de nauwkeurigheid ervan in gevaar brengen.Verschillende gecompromitteerde uitkomsten worden hier getoond. Overstaining met PI, het verwaarlozen van de centrifugatie stap, of overbelichting in de Hoechst kanaal, zal leiden tot suboptimale resultaten. Terwijl de timing van dit protocol, vergeet niet om de kleurstof concentratie en kleuring tijd voor elke cellijn te optimaliseren.Centrificatie voor een monsterplaat is ook noodzakelijk om de beeldkwaliteit te waarborgen. Na identificatie van verbindingen van cytotoxiciteit effect op kankercellen, onderzoekers kunnen doorgaan met mechanistische studies om hun relevante doelen te identificeren. Door kleine moleculenybliotheken te screenen met deze techniek parallel aan conventionele MTT-tests, kunnen moleculen die zich richten op mitochondriale functie snel worden geïdentificeerd.

an-automated-differential-nuclear-staining-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates a nuclear staining method to detect the cytotoxic effect of mitocan on drug-sensitive cancer cells and healthy variants. The double staining with DNA-binding dyes such as propidium iodide and Hoechst dye provides a clear distinction between the dead and live cells, thus helping to assess the cytotoxicity of the drug.

Differential Nuclear Staining Assay: An Assay to Determine Mitocan Cytotoxicity by Propidium Iodide and Hoechst Double Staining

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Werkwijze voor de synthese van lucht-gevoelige titaan en vanadium antikankermiddelen wordt beschreven, samen met de evaluatie van hun cytotoxische activiteit voor humane kankercellijn de MTT assay.

Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.

Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed

T-lymfocyt-mitogenese gaat gepaard met blastogene transformatie, waarna het celvolume groter wordt voordat celdeling plaatsvindt. Hier beschrijven we een methode om blastogenese in T-lymfocyten te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde celteller met de mogelijkheid om celdiameters te meten.

Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs

Ons doel was het ontwikkelen van een praktische protocol om te evalueren van de mitochondriale dysfunctie vermoeidheid bij kankerpatiënten is gekoppeld. Dit innovatieve protocol is geoptimaliseerd voor klinisch gebruik waarbij alleen standaard phlebotomy en basic Labor procedures.

Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

De in-vitro-micronucleustest is een gevestigde methode voor het evalueren van genotoxiciteit en cytotoxiciteit, maar het scoren van de test met behulp van handmatige microscopie is moeizaam en lijdt onder subjectiviteit en variabiliteit tussen de scorer. Dit artikel beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde versie van de test uit te voeren met behulp van multispectrale beeldvormings stroom cytometrie.

Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

De micronucleus (MN) assay is een gevestigde test voor het kwantificeren van DNA-schade. Het scoren van de test met behulp van conventionele technieken zoals handmatige microscopie of op functies gebaseerde beeldanalyse is echter bewerkelijk en uitdagend. Dit artikel beschrijft de methodologie om een kunstmatig intelligentiemodel te ontwikkelen om de MN-test te scoren met behulp van imaging flow cytometriegegevens.

Automatisering van de micronucleustest met behulp van beeldvorming, flowcytometrie en kunstmatige intelligentie

De bio-energetica van CD8 T-cellen kan worden ondervraagd met behulp van de Mito-stresstest. Deze methodologie kan worden gebruikt om acute en chronische metabole programmering te bestuderen. Dit protocol beschrijft benaderingen om de relaties tussen T-celreceptorbiologie en bio-energetische analyse te onderzoeken.

Meten van de mitochondriale functie van naïeve en effector CD8 T-cellen

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Leer een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van celviabiliteit onafhankelijk van mitochondriale functie. Deze methode maakt snelle high-throughput screening van geneesmiddelen mogelijk.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

Meer video's verkennen