Name: Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer micro-injectie van rhodamine-geconjugeerd actine in Drosophila-embryo's om intranucleaire actinstaven onder warmtestress te visualiseren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar actinedynamica en stressreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen dankbaar het werk van Liuliu Zheng en Zenghui Xue, die deze techniek hielpen pionieren in het Sokac-lab, evenals Hasan Seede die hielp met de analyse. Het werk voor deze studie wordt gefinancierd door een subsidie van NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).</li>
<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten aangegeven.

Het belang van deze methode is dat het gebruik maakt van het gevestigde protocol van micro-injectie in Drosophila embryo's21,22,23,24,25,26,27 om nieuw onderzoek met betrekking tot de ASR en de bijbehorende actin staaf assemblage mogelijk te maken. Een groot voordeel van het injecte...

Dit protocol beschrijft hoe G-actineRood te injecteren om de assemblage van intranucleaire actine staven in hitte-gestresste embryo's die een induceerbare Actin Stress Response (ASR)ondergaan visualiseren 1. We ontwikkelden dit protocol ter ondersteuning van studies van de ASR, die in embryo's leidt tot verstoorde morfogenese en verminderde levensvatbaarheid, en bij volwassen menselijke celtypen wordt geassocieerd met pathologieën zoals nierfalen2, spier myopathieën3, en Alzheimer en De Ziekte van Huntington4,5,6,7,8. Deze ASR wordt veroorzaakt door talrijke cellulaire spanningen, waaronder hitteschok9,10,11,oxidatieve stress4,6, verminderde ATP-synthese12, en abnormale Huntingtine of β-amyloïde oligomerisatie4,5,6,7,9,13,14,15,16. Een kenmerk van de ASR is de assemblage van afwijkende actinestaven in het cytoplasma of de kern van aangetaste cellen, die wordt aangedreven door stress-geïnduceerde hyperactivatie van een actine interacterend eiwit, Cofilin1,5,6,10. Helaas blijven er belangrijke kennislacunes bestaan met betrekking tot de ASR. De functie van de actinestaven is bijvoorbeeld niet bekend. We begrijpen niet waarom staven zich vormen in het cytoplasma van sommige celtypen, maar de kern van anderen. Het is ook niet duidelijk of de ASR beschermend of onaantastelijk is voor cellen of embryo's die stress ervaren. Tot slot kennen we nog steeds niet de gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan Cofilin hyperactivatie of actine staafassemblage. Dit protocol biedt dus een snelle en veelzijdige test om de ASR te onderzoeken door actine staafvorming en dynamiek in het zeer tracteerbare experimentele systeem van het levende fruitvliegembryo te visualiseren.
Het protocol om G-actineRed te micro-injecteren in levende Drosophila-embryo's werd aanvankelijk ontwikkeld om de dynamiek van normale cytoplasmatische actinestructuren17 te bestuderen tijdens weefselopbouwgebeurtenissen. In die studies ontdekten we dat G-actineRode injectie geen negatieve invloed had op vroege ontwikkelingsprocessen in het embryo, waaronder cytokinese of gastrulatie17,18. Vervolgens hebben we het protocol gewijzigd, waarbij we de embryobehandeling en G-actineRed-injectie hebben aangepast om beeldvorming van actinestaven in hittebelaste embryo's die de ASR1ondergaan mogelijk te maken. Andere methoden naast G-actineRode injectie kunnen worden gebruikt om actine in embryo's te visualiseren. Deze methoden zijn gebaseerd op het uitdrukken van fluorescerende eiwitten (FPs) die zijn getagd op actine of op domeinen van actinebindende eiwitten, zoals Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP en Moesin-GFP (herzien in19). Het gebruik van deze FP-sondes vereist echter voorzichtigheid, omdat ze sommige actinestructuren kunnen stabiliseren of verstoren, niet alle actinestructuren gelijk labelen20, en in het geval van actin-GFP, zeer overexpressie hebben – problematisch voor de analyse van staafassemblage die niet alleen stressafhankelijk is, maar ook actineconcentratieafhankelijk1. Zo is G-actinRed de voorkeursonde voor staafstudies in vliegenembryo's, en de grote omvang van het embryo maakt de eenvoudige injectie mogelijk.
De workflow van dit protocol is vergelijkbaar met andere gevestigde micro-injectietechnieken die zijn gebruikt voor het injecteren van eiwitten, nucleïnezuren, geneesmiddelen en fluorescerende indicatoren in Drosophila-embryo 's21,22,23,24,25,26,27. Echter, na de micro-injectie van G-actineRood hier, embryo's worden blootgesteld aan milde hitte stress om de ASR en intranucleaire actine staaf assemblage te induceren. Voor laboratoria met toegang tot vliegen en een injectieplatform moet deze methode gemakkelijk uitvoerbaar en aanpasbaar zijn voor specifieke studielijnen met betrekking tot de ASR, met inbegrip van de inductie ervan door verschillende spanningen of modulatie in verschillende genetische achtergronden.

```html
<table><tbody><tr><td>Adenosine trifosfaat (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Component van G-buffer</td></tr><tr><td>Appelsap, Mott's, 64 fl oz</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>Component van appelsapplaten</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Component van appelsapplaten</td></tr><tr><td>Bleach, PureBright Germicidal, 6,0% natriumhypochloriet</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>Voor het ontdopnen van embryo's</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Component van G-buffer</td></tr><tr><td>Celzevener, 70 &micro;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Voor het verzamelen van ontdopte embryo's</td></tr><tr><td>Confocale microscoop, LSM 880 34-kanaals met Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Voor het beeldvormen van intranucleaire actinestaven</td></tr><tr><td>Droogmiddel</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>Voor het drogen van embryo's</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop, Stemi 508 Stereoscope met 8:1 zoom</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig</td></tr><tr><td>Dissectie-naald, 5 inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Component van G-buffer</td></tr><tr><td>Dubbelzijdig plakband, Scotch Permanent, 0,5 inch x 250 inch</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Voor het maken van embryolijm</td></tr><tr><td>Embryocollectiekooi</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Voor het huisvesten van volwassen vliegen en het verzamelen van embryo's</td></tr><tr><td>Fijne pincet, Dumont Pincet, Stijl 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>Voor het rangschikken van embryo's op een agarwig</td></tr><tr><td>Glascapillairen, Borosilicaatglas, dun 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Voor micronaalden</td></tr><tr><td>Halocarbon olie 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Voor de hydratatie van embryo's</td></tr><tr><td>Verwarmde stageschome</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Voor confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>Labdoekjes, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Labdoekjes</td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscoop, gereviseerd</td><td>Zeiss</td><td>Niet meer verkrijgbaar</td><td>Injectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoaat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Component van appelsapplaten</td></tr><tr><td>Microinjector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Voor het laden van micronaalden</td></tr><tr><td>Micromanipulator en injectiestandaard met x,y,z-draaiknoppen voor naaldinstelling</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Aangepast</td><td>Voor het uitvoeren van microinjecties</td></tr><tr><td>Micropipet aantrekker, Model P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Voor het trekken van capillaire buisjes om micronaalden te maken</td></tr><tr><td>Microscoopglaasje 24x50-1,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Voor het monteren van embryo's</td></tr><tr><td>Microscoopglazen, Lilac Colorfrost, Voorgereinigd, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Voor het monteren van embryo's voor injectie</td></tr><tr><td>n-Heptaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Component van embryolijm</td></tr><tr><td>Objectief, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Niet meer verkrijgbaar</td><td>10x objectief voor injectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Objectief, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x waterobjectief voor confocale</td></tr><tr><td>Objectief, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 voor olie, water, siliconenolië of glycerine drenken (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm bij D=0,17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x gemengd drenkobjectief voor confocale</td></tr><tr><td>Objectief, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Olie DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x oliëobjectief voor confocale</td></tr><tr><td>Verfkwast, Robert Simmons Expression E85 Puntige Ronde maat 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Voor het overbrengen van embryo's</td></tr><tr><td>Papierhanddoeken, Kleenex C-vouw papierhanddoeken, wit</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>Voor het afdrogen van de celzevener</td></tr><tr><td>Pasteurpijp, 5 3/4 inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Voor het bedekken van embryo's met olie</td></tr><tr><td>Petrischaal, glas, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Voor vochtige incubatiekamer</td></tr><tr><td>Petrischaal, kunststof, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Voor appelsapplaten</td></tr><tr><td>Pipet, Eppendorf Referentie 0,5-10 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Voor het laden van de micronaald</td></tr><tr><td>Pipettip, xTIP4 250 &micro;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>Voor het toevoegen van embryolijm aan de dekplaat</td></tr><tr><td>Scheermesje</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>Voor het snijden van agarwig, plakband, pipettips</td></tr><tr><td>Rhodamine-geconjugeerd globulair actine, menselijke bloedplaatjes (niet-spier; 4x10 &micro;g)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-

beeldvorming intranucleaire actin staven in live heat stressed drosophila embryo's

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Het doel van dit protocol is om intranucleaire actinestaven te visualiseren die zich verzamelen in levende Drosophila melanogaster embryo's na hittestress. Actin staven zijn een kenmerk van een geconserveerde, induceerbare Actin Stress Response (ASR) die gepaard gaat met menselijke pathologieën, waaronder neurodegeneratieve ziekte. Eerder toonden we aan dat de ASR bijdraagt aan morfogenesefalen en verminderde levensvatbaarheid van het ontwikkelen van embryo's. Dit protocol maakt de voortdurende studie mogelijk van mechanismen die ten grondslag liggen aan actine staafassemblage en de ASR in een modelsysteem dat zeer vatbaar is voor beeldvorming, genetica en biochemie. Embryo's worden verzameld en op een afdeklip gemonteerd om ze voor te bereiden op injectie. Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine (G-actineRed) wordt verdund en in een microneedle geladen. Een enkele injectie wordt gemaakt in het midden van elk embryo. Na injectie worden embryo's geïncubeerd bij verhoogde temperatuur en intranucleaire actinestaven worden vervolgens gevisualiseerd door confocale microscopie. Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) experimenten kunnen worden uitgevoerd op de actinestaven; en andere actinerijke structuren in het cytoplasma kunnen ook in beeld worden We vinden dat G-actineRed polymeriseert als endogene G-actine en op zichzelf de normale embryoontwikkeling niet verstoort. Een beperking van dit protocol is dat er tijdens de injectie op moet worden gelet om ernstig letsel aan het embryo te voorkomen. Echter, met de praktijk, het injecteren van G-actineRood in Drosophila embryo's is een snelle en betrouwbare manier om actine staven te visualiseren en kan gemakkelijk worden gebruikt met vliegen van elk genotype of met de introductie van andere cellulaire spanningen, waaronder hypoxie en oxidatieve stress.

Een schematische workflow van embryoverwerking wordt weergegeven in figuur 1en een tijdschema voor een typisch experiment wordt gepresenteerd in tabel 1. Een schatting voor een goed experimenteel resultaat is dat voor elke 10 geïnjecteerde embryo's ten minste de helft van de bekeken embryo's zich in de juiste ontwikkelingsfase bevindt, onbeschadigd, en een robuuste ASR vertoont met hittestress bij 32 °C. Deze ASR zal worden aangetoond door de assemblage van intranucleaire a...

Het doel van dit protocol is om Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine te injecteren in Drosophila embryo's en beeld intranucleaire actine staaf assemblage na hitte stress.

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Ons protocol is belangrijk omdat het de beproefde techniek van micro-injectie in Drosophila-embryo's gebruikt om nieuw onderzoek naar de actinestressreactie en bijbehorende actine-staafsamenstelling mogelijk te maken. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de actinestressreactie kunnen bestuderen onder verschillende contexten, zoals een mutantenscreen of onder verschillende stresscondities. Een persoon die deze techniek nog nooit eerder heeft uitgevoerd, kan worstelen met het hanteren van de embryo's en het uitvoeren van de micro-injectie.We bevelen aan deze stappen te oefenen tot de gebruiker zich comfortabel voelt. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen van embryo-hantering, positionering en montage voor zowel micro-injectie als beeldvorming mogelijk niet duidelijk zijn uit geschreven instructies alleen. Bereid embryo-verzamelbekers en appelsap-agarplaten voor volgens de aanwijzingen in het manuscript.Om het meest genereuze leggen van eieren te bevorderen, zet je twee dagen voor het experiment verzamelbekertjes met vliegen op. Voeg minimaal 100 vrouwelijke en 50 mannelijke vliegen toe aan elke verzamelbeker, bedek het vervolgens met een appelsa

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

Een protocol voor levende beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten of autofluorescerende structuren in...

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Leer micro-injectie van rhodamine-geconjugeerd actine in Drosophila-embryo's om intranucleaire actinstaven onder warmtestress te visualiseren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar actinedynamica en stressreacties.

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

Meer video's verkennen