Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Dit protocol zal onderzoekers helpen om de native oligomere toestand van membraaneiwitten nauwkeuriger te bepalen door gebruik te maken van het native celmembraan nanodeeltje-systeem in combinatie met elektronenmicroscopie. Het voordeel van deze techniek is dat het nauwkeurige structurele gegevens van membraaneiwitten biedt in een native celmembraanachtige omgeving, en het kan worden gebruikt voor toekomstige hoge-resolutie structuurbepaling. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Kyle Kroeck, een postdoctorale medewerker uit mijn laboratorium.

Om native celmembraan nanodeeltjes te bereiden, hersuspendeer een gram van het membraanpellet van belang in 10 milliliters NCMN Buffer A. Gebruik een glazen Dounce homogenisator om het hersuspendeerde celmembraanmonster te homogeniseren bij 20 graden Celsius en breng het gesuspendeerde monster over naar een 50 milliliter polypropyleen buis. Voeg membraactief polymeer stockoplossing en aanvullende NCMN Buffer A toe aan het monster tot een uiteindelijke concentratie van 2,5% membraactief polymeer en schud de oplossing gedurende twee uur bij 20 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, ultracentrifugeer het monster.

Tijdens de centrifugatie, breng een vijf milliliter nikkel NTA kolom in evenwicht met 25 milliliters NCMN Buffer A. Aan het einde van de centrifugatie, breng de supernatant over op de kolom en gebruik een spuitpomp ingesteld op een stromingssnelheid van 0,5 milliliter per minuut om de supernatant op de kolom te laden bij 20 graden Celsius. Was de fast proteïne vloeistof chromatografie machine lijnen met genoeg NCMN Buffer B om het systeem volledig te spoelen en verbind de kolom met de chromatografie machine. Was de kolom met 30 milliliters NCMN Buffer B bij een stromingssnelheid van een milliliter per minuut en verzamel de flowthrough.

Was de kolom met 30 milliliters NCMN Buffer C bij een stromingssnelheid van een milliliter per minuut en verzamel de flowthrough. Elueer het eiwit met 20 milliliters NCMN Buffer D bij een stromingssnelheid van 0,5 milliliter per minuut en gebruik een fractie verzamelaar om een milliliter fracties van het monster te verzamelen, en bewaar vervolgens de eiwitmonsters bij vier graden Celsius met behulp van SDS-PAGE om de monsters te controleren die overeenkomen met de pieken die worden waargenomen op de fast proteïne vloeistof chromatografie elutiegrafiek. Om negatieve kleuringrids voor te bereiden, wikkel een glazen plaat met filterpapier met de koolstofzijde naar boven en plaats de grids die zullen worden gebruikt voor de monstervoorbereiding op de plaat.

Plaats de glazen plaat met de elektronenmicroscoopgrids in de kamer van een gloei-ontladingsapparaat tussen de twee elektroden en vervang de glazen deksel en zorg ervoor dat de deksel gecentreerd en goed afgesloten is. Laat het gloei-ontladingsapparaat lopen en zorg ervoor dat het paarse licht dat door het plasma wordt gegenereerd zichtbaar is. Wanneer de machine klaar is met lopen, wacht tot de kamer atmosferische druk heeft bereikt voordat u het glazen deksel verwijdert en de plaat op de werktafel plaatst.

Pas de concentratie van de gezuiverde eiwitmonsters aan tot ongeveer 0,1 milligram per milliliter en laad 3,5 microliters van het eiwitmonster op de 10 nanometer dikke koolstof grid. Na een minuut, gebruik een stuk filterpapier om de vloeistof van het elektronenmicroscoopgridoppervlak te verwijderen en was het gridoppervlak drie keer met een drie microliter druppel water per wasbeurt. Na de laatste waterwas, was het gridoppervlak nog twee keer met drie microliter druppels vers gefilterde 2% uraniumacetaat per wasbeurt.

Na de laatste uraniumacetaat wasbeurt, kleurt de grid met een drie microliter druppel vers gefilterde 2% uraniumacetaat gedurende één minuut. Aan het einde van de incubatie, gebruik een nieuw stuk filterpapier om de druppel te verwijderen en laat de grid minimaal één minuut aan de lucht drogen voordat u de grid in een griddoos bewaart voor later gebruik. Hier kunnen negatieve kleurinbeelden worden waargenomen die zijn verkregen met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie zoals gedemonstreerd.

Het negatieve kleurinbeeld voor de wild-type Acraflavine-resistentiekanaaleiwit B-monster gezuiverd met detergent onthult een homogene oplossing van monodisperse deeltjes met het eiwit dat een goed gedefinieerde trimere quaternaire structuur vertoont. Deze trimere structuren komen overeen met het waargenomen grootte-exclusiechromatogram na zuivering. In vergelijking, in het negatieve kleurinbeeld voor de P223G mutant ook gezuiverd met detergent, kan een heterogene oplossing van polydisperse nanodeeltjes met een neiging tot aggregatie maar geen waarneembare native trimers worden waargenomen.

Deze resultaten worden ook ondersteund door grootte-exclusiechromatografie. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor wild-type en mutante eiwitten na zuivering met het membraactief polymeer NCMNP11. Het gebruik van het NCMNP52 polymeer vergemakkelijkt de generatie van native celmembraan nanodeeltjes in veel grotere maten, waardoor meerdere Acraflavine-resistentiekanaaleiwit B trimers kunnen worden afgebeeld in een enkele native celmembraan deeltje.

In het mutantenmonster worden echter geen trimer deeltjes waargenomen, zelfs niet bij het bekijken van de grote native celmembraan dubbellaagvlakken. SDS-PAGE analyse van de gezuiverde eiwitmonsters bevestigt de aanwezigheid van Acraflavine-resistentie B in alle monsters met een zuiverheid van meer dan 95% op het voorspelde molecuulgewicht van het eiwit. Bij het aanpassen van dit protocol voor andere eiwitten, is het belangrijk om experimenteel de juiste hoeveelheid membraanfractie en de lengte, tijd en temperatuur voor het solubilisatieproces te bepalen.

Als de beelden van uw monster een homogene oplossing van monodisperse deeltjes met goed gedefinieerde structurele eenheden onthullen, kan het monster worden gebruikt voor hoge-resolutie structuurbepaling met cryo-elektronenmicroscopie.